Testen der Fähigkeit des diffusiblen Signalmoleküle zu embryonalen Spinal kommissuralen Axone neu ausrichten

Ausgangsstücke des dorsalen Rückenmarks werden aus Rattenembryonen präpariert und in einem dreidimensionalen Kollagen-Gel kultiviert, das gegen Ursprungszellen ausgerichtet ist, die ein kandidaten Signalprotein exprimieren. Die Fähigkeit des Signalproteins, wachsende Axone innerhalb des dorsalen Rückenmarks-Ausgangsstücks umzuleiten, wird mittels Immunhistochemie beurteilt.

Hallo, ich bin Virginia Hazen aus dem Labor von Samantha Butler am Fachbereich Biowissenschaften der University of Southern California. Ich bin Keith Fun, ebenfalls aus dem Butler-Labor. Und ich bin Ken Ya Mai aus dem Butler-Labor.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kultivierung dorsaler Rückenmarks-Implantate und Aggregate transfizierter Cost-Zellen in einer Kollagenmatrix. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Fähigkeit von Kandidaten, linguistischen Molekülen, dazu zu testen, comm-Rückenmarkneuronen auszurichten. In diesem Experiment untersuchen wir die Fähigkeit von Bone Morphogenetic Protein oder BMP7, als Chemoabstoßer zu wirken.

Beginnen wir. Bereiten Sie Co-Zellaggregate vor, die verwendet werden, um die Bahn von Kommunikations-Axonfortsätzen aus Co-Zellen herauszufordern. Diese wurden mit dem Expressionsplasmid für das Molekül des Interesses – hier knochenmorphogenetisches Protein oder BMP7 – transfiziert.

Entfernen Sie das Medium aus der Schale und waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter 1× PBS. Entfernen Sie das PBS und behandeln Sie die Zellen mit einem halben Milliliter enzymfreiem Zelldissoziationsmedium für 15 Minuten. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von einem Milliliter Medium mit fetalem Kälberserum.

Unter Verwendung einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze die Zellen solange auf- und abpipettieren, bis keine Zellen mehr auf der Oberfläche der Kulturschale haften. Die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischglas überführen und zwei Minuten lang pellettieren. Bei 2000 U/min das Überstandmedium entfernen und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.

In 100 Mikroliter Medium mehrere 20 Mikroliter-Tropfen der Zellsuspension auf der Innenseite des Deckels einer 35 Millimeter-Kulturschale auftragen. Den Deckel über die Schale schließen und mehrere Stunden im Inkubator belassen, damit sich die Zellen aggregieren können. Zum Vorbereiten von dorsalen Rückenmarkstransplantaten frisch gewonnene Gewebe weiterverwenden.

E 11 Rattenembryonen auf Eis. In L 15 Medium mit einer geschärften Wolframnadel eine Strecke von vier bis sechs Somitenabschnitten aus dem Rumpfbereich unmittelbar unterhalb der Vordergliedmaßenanlage jedes Embryos entfernen. Mit einer Plastikpipette das Gewebe in einer Vertiefung einer Vierer-Platte sammeln.

Gut keine Schale auf Eis. Sobald alle Segmente disseziert wurden, überführen Sie die Stücke mit einer Pipette in eine zweite Vertiefung der Schale, die L-15-Medium plus Disc-Paste enthält. Inkubieren Sie das Gewebe bei Raumtemperatur nicht länger als fünf Minuten.

Um Zelltod zu verhindern, darf das Gewebe nicht überverdaut werden. Geben Sie ein Milliliter frisches L-15-Medium mit 5 % hitzeinaktiviertem Ziehenserum in die dritte Vertiefung der Petrischale und überführen Sie die Gewebestücke in diese Vertiefung.

Am Ende der Inkubation im Dis-Raum wird das Gewebe eine Stunde lang auf Eis ruhen gelassen. Um die anschließende Dissektion in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu erleichtern, werden 40 Mikroliter 10 x minimales essentielles Medium zu 360 Mikrolitern Kollagen gegeben. Anschließend kurz verwirbeln, um zu mischen, und in einer Piko-Zentrifuge abzentrifugieren.

Die Lösung wird gelb sein und sollte bei jeder Charge so weit wie möglich auf Eis gehalten werden, um zu verhindern, dass das Kollagen aushärtet. Titrieren Sie das Kollagen mit einer Menge von 0,8 molarer Natriumbicarbonatlösung, die die Kollagenlösung leicht orange färbt. Rühren Sie die Lösung nach jeder Zugabe gut durch. Wenn die Kollagenlösung diese Farbe erreicht hat, bleibt sie flüssig, solange sie auf Eis gehalten wird, ist aber bereit, bei Raumtemperatur zu gelieren. Falls die Lösung nach dem Mischen rosa wird, beginnen Sie erneut mit einer frischen Röhre Kollagen. Geben Sie 20 Mikroliter Kollagen in jedes Loch einer sauberen Vierloch-Platte ohne Vertiefung.

Verteilen Sie mit der Pipettenspitze das Kollagen, um ein kleines Polster zu bilden. Lassen Sie das Kollagen etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur aushärten. Entfernen Sie unter dem Auflichtmikroskop mit einer frisch geschliffenen Wolframehre und einer feinen Pinzette das Mesoderm, das das Rückenmark eines Embryos umgibt, mit Hilfe der Wolframehre, und entfernen Sie den ventralen Teil des Rückenmarks, der anhand der Anwesenheit der Bodenplatte identifiziert werden kann.

An der ventralen Kante ist die Bodenplatte am stärksten verdickt im Vergleich zur Dachplatte an der dorsalen Kante. In diesem Beispiel liegt das Rückenmark mit der ventralen Seite nach unten. Schneiden Sie das Gewebe vorsichtig parallel zur Bodenplatte ab und entsorgen Sie das ventrale Fünftel des Rückenmarks.

Verwenden Sie die Nadel, um das dorsale Rückenmarksexplantat vertikal zu halbieren. Achten Sie darauf, dass die Schnittkanten so sauber wie möglich sind, und schneiden Sie sie gegebenenfalls nach. Übertragen Sie jedes Explantat mithilfe einer Mundpipette, die mit einem Glas-Kapillarrohr mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern ausgestattet ist, auf ein separates Kollagenpolster.

Mit der Wolframelektrode schneiden Sie den Aggregat der transfizierten Co-Zellen in Quadrate, die ungefähr die gleiche Breite wie die seitliche Kante des dorsalen Rückenmarks aufweisen. Erkl. Übertragen Sie mithilfe einer Mundpipette eines der Quadrate auf das Kollagenpolster mit dem x Erkl. Saugen Sie mit der Mundpipette jegliche überschüssige Flüssigkeit ab.

Überaspirieren Sie nicht, da eine kleine Menge Flüssigkeit bei der anschließenden Applikation von Kollagen hilfreich ist; geben Sie vier Mikroliter vorbehandeltes Kollagen auf das Polster. Bewegen Sie mit der Wolframenadel das Kollagen über die Implantate, ohne das Gewebe direkt zu berühren. Durch Bewegen der Nadel im Kollagen richten Sie jedes x-Explan so aus, dass das Ko-Zellaggregat an seiner seitlichen Kante liegt.

Lassen Sie das Kollagen 15 bis 20 Minuten lang aushärten. Wiederholen Sie den Applikationsvorgang mit weiteren vier Mikrolitern Kollagen, um sicherzustellen, dass das X-Explan vollständig in Kollagen eingeschlossen ist, bevor Sie zum nächsten Embryo in einer Gewebekulturhaube übergehen, mit 0,5 Millilitern Medium kultivieren und 30 bis 40 Stunden im Inkubator inkubieren. Im Abzug fixieren Sie die Explantate mit 0,5 Millilitern einer 4 %igen Paraformaldehydlösung in PBS für 45 Minuten. Halten Sie das Gewebe auf Eis und waschen Sie es zweimal mit jeweils 0,5 Millilitern der Blockier- und Permeabilisierungslösung PBTN.

Die X-Explanten in Blockierungslösung bei vier Grad Celsius inkubieren, vorzugsweise über Nacht. Mit einer Pinzette den X-Explanten aus der Vierer-Platte herausschneiden und jeden in eine Vertiefung einer 48-Vertiefungs-Platte geben.

Fügen Sie 200 Mikroliter Primärantikörper zu jedem Brunnen hinzu. Um comm-choral-Axone sichtbar zu machen, verwenden Sie einen Maus-anti-ttag-Antikörper, und um zu überprüfen, ob die transzelluläre Transfektion erfolgreich war, fügen Sie einen Antikörper gegen das getestete Molekül hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Spülen Sie jede Probe fünfmal mit PBTN-Blockierungslösung, jeweils eine Stunde lang, bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie das PBTN und geben Sie 200 Mikroliter Sekundärantikörper zu jeder Probe hinzu. Bedecken Sie die Platte mit Abschlussfolie, um eine Ausbleichung zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Die Proben fünfmal wie zuvor in PBTN waschen. Jeden Explanten auf eine Dreifach-Vertiefungsobjektträger übertragen. Überschüssige Flüssigkeit entfernen, Invecta-Shield-Medium auftragen und mit einem Deckglas abdecken.

Bewahren Sie die Objektträger entweder bei vier oder minus 20 Grad Celsius in einem lichtgeschützten Ordner oder Behälter auf, bis sie unter dem Mikroskop visualisiert werden. Nun zeigen wir einige repräsentative Bilder von X-Explantaten nach Kultivierung, Fixierung, Färbung und Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie. Panel A zeigt, dass ein X-Explantat der Dachplatte, weiß hervorgehoben, die tag1-positiven choralen Axone von sich weg umlenken kann, was belegt, dass die Dachplatte die Quelle eines axonalen Chemoabstoßungsfaktors ist. Panel B zeigt, dass CO-Zellen, die das M-tact-Signalprotein Bone Morphogenetic Protein oder BMP7 sezernieren, die zerebralen Axone in ähnlicher Weise wie die Dachplatte abstoßen können.

Achsen von Zellen, die nur das Expressionsplasmid sezernieren, haben keinerlei Auswirkung auf die Orientierung der Axone. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man X-Explantate des Rückenmarks dissezieren, ausrichten und kultivieren kann und Zellaggregate erzeugt, um zu bestimmen, ob ein Kandidaten-Signalprotein eine axonreorientierende Aktivität besitzt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Kollagen so weit wie möglich auf Eis zu halten und das Explant vollständig in Kollagen einzuschließen, sodass es nicht in direkten Kontakt mit dem Kulturmedium gelangt.

Und schließlich kultivieren Sie nur so lange, bis die Axone bis zum ventralen Rand des X-Explanten gewachsen sind. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.