Name: Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Lernen Sie den optimierten Fibringel-Bead-Assay zur Untersuchung der Angiogenese mit Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Sprossung, Lumenbildung und Anastomose in vitro.

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VORBEREITUNG CELLS <ol><li> Rufen Sie HUVEC und Fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 Tage vor Sicken. </li><li> Schalten Sie mittel-bis EGM-2 (Clonetics) am Tag vor Sicken für HUVEC und der Tag vor dem Einbetten für Fibroblasten. </li><li> Eine Konzentration von ~ 400 HUVEC pro Perle benötigt wird. </li><li> 20.000 Fibroblasten pro Vertiefung erforderlich ist. </li></ol> COATING die Perlen mit HUVEC - Tag -1 <ol><li> Trypsinize HUVEC. </li><li> Lassen Perlen absetzen (nicht zentrifugieren!). Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Perlen kurz in 1 ml warmes EGM-2 Medium. </li><li> Mix 2500 Perlen w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 ml warmes EGM-2 Medium in einem FACS-Röhrchen. Legen Sie sie vertikal in den Inkubator. (Dies reicht für ca. 10 Brunnen. Scale up bei Bedarf) </li><li> Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C, Schütteln der Röhre alle 20 min. (Good Beschichtung ist entscheidend für die Keimung.) </li><li> Nach 4 Stunden, übertragen Sie die Kügelchen zu einer T25-Kolben in 5 ml EGM-2 und verlassen O / N. </li></ol> EMBEDDING Kügelchen IN Fibringel - Tag 0 <ol><li> Bereiten Sie die 2,0 mg / mL Fibrinogen-Lösung (siehe Rezepte). </li><li> Add 0,15 Einheiten / ml Aprotinin auf die Fibrinogen-Lösung. </li><li> Transfer-beschichteten Beads zu einem 15mL konischen Rohr und lassen Kugeln zu begleichen. Resuspendieren Perlen in 1ml von EGM-2 und in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen Sie die Perlen 3X mit 1ml von EGM-2 durch Pipettieren und langsam nach unten. </li><li> Graf Perlen auf einem Deckglas und resuspendieren in Fibrinogen-Lösung bei einer Konzentration von ~ 500 Beads / ml. </li><li> Add 0,625 Einheiten / ml Thrombin in jede Vertiefung. </li><li> Fügen Sie 0,5 ml der Fibrinogen / Bead-Suspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Ändern Sie die Pipettenspitze für jeden gut! </li><li> Mischen Sie die Thrombin und Fibrinogen, indem Sie nach oben und unten vorsichtig mit der Pipettenspitze ~ 4 bis 5 mal. Achten Sie darauf, große Blasen machen. </li><li> Lassen Sie die Platte für 5 min in der Motorhaube, dann legen Sie sie in die 37 ° C-Inkubator für 10-15 min, ein Gerinnsel zu erzeugen. </li><li> Während des Wartens auf das Gerinnsel, trypsinize Fibroblasten. </li><li> 1 ml der EGM-2 pro Well tropfenweise. </li><li> Seed-Fibroblasten auf der Fibrin-Gel bei einer Konzentration von 20.000 Zellen pro Vertiefung. </li></ol> HINWEISE: Normalerweise, wenn das Fibrin-Gel gebildet wird, werden Sie winzige Bläschen in dem Gel zu sehen. Mach dir keine Sorgen, sie werden in 3-4 Tagen verschwinden. Ändern Sie die Medien jeden zweiten Tag, dh, Tag 2, 4, 6, etc. .. Am Tag 3 oder 4 sollten Sie beginnen, um zu sehen sprießen.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Es gibt einen wachsenden Konsens, dass die dreidimensionale (3D) in vitro Angiogenese-Assays ein Modell, das viel näher an der tatsächlichen Umgebung in vivo als erreicht mit Hilfe von 2D Kulturen anbieten. Es ist offensichtlich, dass überlegene 3D-Systeme sollten reproduzierbar sein, und in der Lage sein, mehrere der wichtigsten Schritte der Angiogenese zu imitieren. Während mehrerer früherer 3D-Assays entwickelt worden, viele von ihnen entweder schwer zu erhalten mikrovaskulären Zellen, oder nur zu rekapitulieren einige der Etappen. In di...

<table><tbody><tr><td>Cytodex-3-Kügelchen</td><td>Reagenz</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/Flasche. 1.0,5 g trockene Kügelchen werden in 50 mL PBS (pH = 7,4) mindestens 3 h bei RT hydratisiert und aufquellen gelassen. Verwenden Sie ein 50-mL-Röhrchen und stellen Sie es auf einen Schüttler. 2. Lassen Sie die Kügelchen absinken (~15 min). Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen einige Minuten lang mit frischem PBS (50 mL). 3. Entsorgen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch frisches PBS: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 Kügelchen/mL oder 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30.000 Kügelchen/mL. 4. Geben Sie die Kügelchensuspension in eine silikonisierte Glasflasche (Windshield Wiper oder Sigmacote). 5. Sterilisieren Sie die Kügelchen durch Autoklavieren für 15 min bei 115&amp;#x00B0;C. 6. Lagern Sie sie bei 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/Flasche. Rekonstituieren Sie lyophilisiertes Aprotinin mit 4 U/mL in destilliertem Wasser. Sterilfiltrieren. Portionieren Sie in Aliquots zu je 1 mL. Lagern Sie bei -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen Typ I</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Lösen Sie 2 mg/mL Fibrinogen in DPBS. Beachten Sie den prozentualen Anteil an gerinnbarem Protein und passen Sie entsprechend an. Lösen Sie das Fibrinogen durch Erwärmen im 37 &amp;#x00B0;C-Wasserbad auf. Mischen Sie durch Vorsichtiges Umstülpen des Röhrchens. Nicht wirbeln. Sterilfiltration über 0,22 µm</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1.000 Einheiten. Rekonstituieren Sie in sterilem Wasser mit 50 U/mL. Portionieren Sie in Aliquots zu je 0,5 mL. Lagern Sie bei -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

optimierte fibringel bead assay für das studium der angiogenese

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, in dem, in Antwort auf angiogene Stimuli, neue Schiffe aus dem bestehenden Gefäßsystem geschaffen werden. Diese Schritte sind: Abbau der Basalmembran, die Proliferation und Migration (sprießen) von Endothelzellen (EC) in der extrazellulären Matrix, die Ausrichtung der EG zu Schnüren, Verzweigungen, Lumenbildung, Anastomose, und die Bildung einer neuen Basalmembran. Viele in-vitro-Assays wurden entwickelt, um diesen Prozess zu studieren, aber die meisten nur imitieren bestimmte Stadien der Angiogenese und morphologisch die Schiffe innerhalb des Assays oft nicht Schiffe in vivo ähneln. Basierend auf früheren Arbeiten von Nehls und Drenckhahn, haben wir ein in vitro-Angiogenese-Assay, der menschlichen Nabelvene EG und Fibroblasten nutzt optimiert. Dieses Modell rekapituliert alle wichtigen frühen Phasen der Angiogenese und, was wichtig ist, zeigen die Gefäße Patent interzellulären Lumen durch polarisiertes EG umgeben. EG werden auf Cytodex Mikroträger beschichtet und eingebettet in eine Fibrin-Gel. Fibroblasten sind auf der Oberseite des Gels, wo sie bieten notwendige lösliche Faktoren, die EG sprießen aus der Oberfläche der Kügelchen zu fördern geschichtet. Nach mehreren Tagen sind zahlreiche Schiffe zu, die leicht unter Phasen-Kontrast-und Zeitraffer-Mikroskopie beobachtet werden. Dieses Video zeigt die wichtigsten Schritte bei der Einrichtung dieser Kulturen.

Dieses Video zeigt das Protokoll eines in-vitro-Angiogenese-Assay, rekapituliert mehrere Stufen der Angiogenese. Zeitraffer-Bilder von Keimen, Lumenbildung, Verzweigung und Anastomose - die wichtigsten Merkmale der Angiogenese - gezeigt werden.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Die Angiogenese ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, bei dem als Reaktion auf angiogene Stimuli neue Gefäße aus der bestehenden Vaskulatur entstehen. Diese ...

Hallo, mein Name ist Mar Katsu. Ich komme aus dem Hughes-Labor der Abteilung für Molekularbiologie und Biochemie an der uc Irvine. Ich werde den Fibrin-Perlen-Assay durchführen.Der gesamte Prozess dauert zwei Tage. Am ersten Tag erfolgt die Beschichtung von Kügelchen mit Schamhaar- oder humanen Nabelvenenendothelzellen. Am zweiten Tag werden diese beschichteten Kügelchen in Fibringele eingebettet und anschließend mit Fibroblasten überzogen.Wir verwenden diesen Assay, um die zahlreichen Schritte der Angiogenese in einem in-vitro-Setup zu untersuchen. Am ersten Tag im ersten Teil verwenden wir CY X three Beads. Am zweiten Tag verwenden wir dann diese drei Reagenzien: Fibrinogen, Thrombin und Aprotinin cytx.Die Kugeln drei stammen von Amazon Biosciences und sind speziell kollagenbeschichtet, damit die endothelialen Zellen an den Kugeln haften. Der nächste Reagenz ist Fibrinogen, das wir von Sigma beziehen. Dieses bildet das eigentliche Gel oder Gerinnsel im Kugel-Assay.Thrombin ist ein Gerinnungsfaktor. Dieses Protein wandelt Fibrinogen in Fibrin um, weshalb wir es dem Assay hinzufügen. Aprotinin ist ein seriner Proteaseinhibitor.Wir verwenden dies, um Proteasen daran zu hindern, das

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen modifizierten Microcarrier-Beads-basierten Assay, der Perizyten enthält, um die Endothelkeimung in den frühen Stadien der Angiogenese zu untersuchen. Der Assay bietet ein experimentelles In-vitro-Modell zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Angiogenese und der Wirkung von anti-angiogenetischen Therapeutika.

Bead-Sprouting-Assay für die Beurteilung der Angiogenese im Frühstadium: Ein In-vitro-Bead-basiertes Modell zur Untersuchung der Endothelkeimung in Gegenwart von Perizyten

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Die Rekapitulation der organspezifischen Mikroumgebung, die die lokale Angiogenese stimuliert, ist für eine erfolgreiche Regeneration von geschädigtem Gewebe unerlässlich. Dieser Bericht demonstriert eine neuartige Methode zur Implantation von Fibringelen auf die Lungenoberfläche lebender Mäuse, um zu untersuchen, wie die lungenspezifische Mikroumgebung die Angiogenese und Alveolärregeneration bei erwachsenen Mäusen moduliert.

Die Implantation von Fibrin Gel auf Maus Lung Lung spezifischen Angiogenese Studieren

Krebszellen werden in ein Kollagengel eingebettet und dann in ein azelluläres Fibringel eingebettet, um ein 3D-Kultursystem zu erzeugen, in dem die Invasivität und Bildung von Satellitentumoren überwacht werden kann.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Dieses Protokoll stellt eine neuartige in-vitro- Perle assay, die mehr entsprechend modelliert den Prozess der in Vivo Angiogenese durch den Einbau von Perizyten sprießen. Diese Änderung ermöglicht die Wulst-Assay, treuer rekapitulieren die Zellkulturmodells zellulären Interaktionen zwischen Endothelzellen und Wandbild Zellen, die entscheidend für die Angiogenese.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie mit Patienten abgeleitet, chirurgisch herausgeschnitten, fibrovaskulärem Gewebe für dreidimensionale nativen Gewebe Charakterisierung und Ex-Vivo-Kultur zu studieren. Diese ex-Vivo-Kultur-Modell ist auch für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden.

Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Diese Methode beschreibt die Kultur von iPSC-abgeleiteten Endothelzellen als 40 durchfundierte 3D-Mikrogefäße in einer standardisierten mikrofluidischen Plattform. Diese Plattform ermöglicht die Untersuchung von gradientengetriebenen angiogenen Keimen in 3D, einschließlich Anastomose und Stabilisierung der angiogenen Sprossen in einer skalierbaren und hochdurchsatzigen Weise.

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Die mechanisch isolierte stromale Gefäßfraktion (SVF) in Kombination mit einem Fibrinhydrogel bietet einen einfachen und effizienten Träger für lebensfähige Stromazellen aus Fettgewebe für verschiedene Indikationen, einschließlich Tissue Engineering und/oder Wundheilungszwecke. Hier stellen wir die Herstellung eines mechanischen SVF (mSVF)-Fibrin-Hydrogel-Konstrukts für die translationale Forschung und klinische Anwendung vor.

Die Kombination aus mechanisch isolierter stromaler vaskulärer Fraktion und Fibrinhydrogel: Ein Verarbeitungsprotokoll

Hier stellen wir ein Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Protokoll (PAGE) vor, um die fibrinogenolytischen Wirkstoffe von Sipunculus nudus schnell zu trennen und darzustellen.

Schnelle Trennung und Darstellung von aktiven fibrinogenolytischen Wirkstoffen in Sipunculus nudus durch Fibrinogen-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Lernen Sie den optimierten Fibringel-Bead-Assay zur Untersuchung der Angiogenese mit Endothelzellen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Sprossung, Lumenbildung und Anastomose in vitro.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

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