Name: Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Lernen Sie Zeitraffer-Imaging der Mitose nach siRNA-Transfektion in Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung mitotischer Zeitabläufe und die Analyse chromosomaler Dynamik in lebenden Zellen.

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Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (PF-07-103 bis 01-CSM), die National Institutes of Health (R01 GM61275 und P30 CA042014), die Leukämie-und Lymphom-Gesellschaft und der Huntsman Cancer Foundation unterstützt.

siRNA-Transfektion und Zell-Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie ein 4-gut LabTek II chambered Deckglas, indem 0,5 ml Fibronektin (10μg/mL) in jede Vertiefung, die verwendet werden. Inkubieren für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen)-Komplexe für die reverse Transfektion laut Hersteller Anweisungen. Verwenden Sie die empfohlenen Mengen für eine Vertiefung einer 24-well Schale pro Kammer verwendet werden (100 &amp;mgr; l insgesamt) werden. Eine analoge Produkt / Protokoll für siRNA-Transfektion ersetzt werden können. </li><li> Entfernen Sie die Fibronektin aus den Vertiefungen der Kammer Deckglas. Add 100 &amp;mgr; von siRNA / Lipofectamine RNAiMAX Komplexe in jede Vertiefung, die verwendet werden. </li><li> Aliquot 20.000 Histon H2B-mCherry-exprimierenden Zellen (in 500μL) pro Well mit Transfektionsansatz. </li><li> Lassen Zellen für ~ 24 Stunden vor dem Auswechseln der Transfektion Gemisch mit 1ml von regelmäßigen Zellkulturmedium inkubiert. </li><li> Inkubieren Zellen weitere 24 Stunden vor der Bildaufnahme (48 Stunden nach der Transfektion). </li></ol> Mikroskop-Setup und Bildaufnahme <ol start="7"><li> Es gibt drei wesentliche Teile der Bildaufnahme Setup: 1) eine Zelle Inkubator, der auf dem Mikroskoptisch passt und sorgt für eine konstante feuchten Umgebung von 37 ° C und 5% CO 2, 2) einem inversen Mikroskop mit einem automatisierten Bühne ausgestattet, automatisierten Fluoreszenz-und Hellfeld Fensterläden und automatisierte Filterräder und 3) ein Softwarepaket, das integriert und steuert die Bühne, Fensterläden und Filterräder. In unserer Imaging-Setup verwenden wir ein maßgeschneidertes Zellinkubator von OKO Lab, die mit dem LabTek II chambered Deckglas verwendet werden können. Die Bühne, Fensterläden und Filterräder werden von der Metamorph-Software gesteuert. Hinweis: Die OKO Lab Bühne-Top-Inkubator-System wird mit Adaptern für eine Vielzahl von verschiedenen Teller, Schüssel oder Deckglas Größen. </li><li> Positionieren Sie den LabTek II chambered Deckglas in den Inkubator durch das Öffnen der Deckel des vorgewärmten und äquilibriert Inkubator, indem die Kammern Deckglas in den Adapter, und hält in Platz mit Knetmasse. Lassen Sie die Abdeckung auf der Kammern Deckglas, so dass das Zellkulturmedium nicht austrocknet. Schließen Sie den Deckel und die Position der gesamten Inkubator auf dem Mikroskoptisch, dass der Inkubator fest an ihrem Platz gehalten. </li><li> Mit Metamorph, richten Sie Ihren Experiment durch Auswahl von &quot;Apps / Mehrdimensionale Bildaufnahme&quot; in der Menüleiste der Software. Dadurch öffnet sich ein Fenster, in dem Sie die Frequenz und die Länge der Zeitraffer auswählen können, die Belichtungszeit für jede Farbe (wenn dies mehrere Einstellungen), die Anzahl und Lage der Bühne Positionen, und die Anzahl der z-Abschnitten (falls gewünscht). . Wählen Sie, wo die Daten-Dateien speichern Tipp: Wenn Sie andere Software als Metamorph, die Funktionen können leicht unterschiedlich, aber das Gesamtkonzept ist die gleiche. Mikromanager, ein Open-Source ImageJ-basierte Software zur Erfassung, die kompatibel mit den meisten Hardware-Setups ist, ist eine hervorragende Alternative. </li><li> . Für die Zwecke dieses Protokolls, wir werden die Bilder bei zwei Wellenlängen (Hellfeld und mCherry) alle 15 Minuten für 8 Stunden bei 15 Tischpositionen Hinweis zu erwerben: Wenn bessere zeitliche Auflösung gewünscht wird, dann können Sie verkürzen die Zeitspanne zwischen den Aufnahmen, aber kann weniger Bühne Positionen eingesetzt werden, und damit weniger mitotischen Zellen werden zur Analyse zur Verfügung. Es ist wichtig, wenn man Zeitabständen zu berücksichtigen, die Zeit für das Filterrad zwischen Filter-Sets Schalter erforderlich. </li><li> Bestimmen Sie die optimale Belichtungszeit für jede Wellenlänge, indem Sie zunächst mit Schwerpunkt auf einem Feld von Zellen mit Hilfe von Hellfeld. In der Software, stellen Sie die Autofokus-Funktion nur für die Hellfeld-Kanal (dieser wird die Software auf Autofokus ermöglicht in jeder Phase Position vor jedem Erwerb). Hinweis: Wir verwenden ein 40x trockenen Phasen-Kontrast-Ziel, hervorragende Auflösung, ohne die Notwendigkeit für Öl geben . Andere Ziele können in Abhängigkeit von der optischen Auflösung wünschen übrig. </li><li> Wechseln Sie auf die mCherry Wellenlänge und Snap ein Bild mit einem 50 ms Belichtung. Stellen Sie die Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um ein gutes Bild zu sehen. Es ist wichtig, die Menge an Licht ausgesetzt nachhaltige Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten begrenzen. Als allgemeine Regel gilt, können dies am besten durch einen Graufilter (zur Anregung Lichtstrom zu reduzieren) und eine längere Belichtung Zeit, anstatt durch eine Erhöhung der Beleuchtungsstärke erreicht werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle weiteren Wellenlängen verwendet werden. Hinweis: Um die langfristige Lebensfähigkeit der Zellen bei einer bestimmten Belastung für Ihr Experiment zu bestimmen, können Sie die Gesamtzahl der Bilder einer Zelle überleben kann über die gewünschte Zeitraffer durch eine einstweilige Umgestaltung der Zeitpunkt Abstand Vorschau von Minuten auf Sekunden (dh, 10 min. wird 10 Sekunden). Wenn Ihre Zellen überleben 100-200 Aufnahmen (oder dieentsprechende Anzahl), dann wird Ihre Exposition ist in Ordnung. Wenn nicht, reduzieren Sie Ihre Anregungslicht, Belichtungszeit oder die Gesamtzahl der Bilder auf Ihren vollständigen Experiment simulieren. </li><li> Als nächstes wählen Sie und markieren Sie eine entsprechende Anzahl von Positionen der Bühne, so dass Sie auf eine ausreichende Stichprobe der Zellpopulation erreichen können. Metamorph zeichnet die Positionen und wird dort als Gegenleistung für jede Akquisition. Tipp: ich generell versuchen, Positionen, in denen gibt es viele Zellen zu Bild zu finden, aber nicht so viele, dass sie zu dicht sind. Außerdem ist es wichtig, genügend Positionen wählen, so dass Sie eine gute Chance, unter Einhaltung einer großen Anzahl von Zellen voran durch Mitose wird. </li><li> Nachdem alle Zeitraffer, Wellenlänge Belichtungszeit, und Tischposition Informationen aufgezeichnet worden sind, wählen Sie die Schaltfläche &quot;Vorschau&quot; auf dem Bildschirm, um festzustellen, ob die Software die Steuerung der Geräte entsprechend. </li><li> Sobald Sie zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot; auf dem Bildschirm auf den Erwerb beginnen. Dann lehnen Sie sich zurück und lassen Sie den Computer und Mikroskop, um die Arbeit zu tun. Hinweis: Beachten Sie die Automatisierung durch mindestens eine volle Runde der Akquisition um sicherzustellen, dass alles richtig funktioniert. </li></ol> Bildverarbeitung und-analyse <ol start="16"><li> Nach der Übernahme abgeschlossen ist, ist der nächste Schritt, um die Bilddaten in eine Form, die einfacher zu handhaben ist zu übertragen. Für die Zwecke dieses Protokolls, werde ich zunächst zeigen, wie man Filme mit Metamorph erzeugen, dann wie Bildmontagen mit dem ImageJ Programm zu generieren. Entweder Format nützlich sein wird für die Quantifizierung Zwecke. </li><li> Der erste Schritt ist, um die Daten zu überprüfen. Dazu wählen Sie &quot;Apps / Review Mehrdimensionale Daten&quot; in der Menüleiste. Wählen Sie den Speicherort der Dateien und wählen Sie &quot;Ansicht&quot;. Dies ermöglicht es Ihnen, den Stapel von Bildern aus jedem Stadium Position einzeln zu überprüfen. Wählen Sie die gewünschte Stufe Position, dann &quot;Load Images&quot;. Sie können durch die Daten-Frame-by-Frame Voraus. </li><li> Für diejenigen Bühne Positionen, in denen Zellen gehen durch Mitose (wie von DNA-und Zell-Morphologie bestimmt), können Sie Filme und Montagen mit Metamorph, oder mit anderen Programmen wie ImageJ (kostenlos erhältlich über NIH). </li><li> Um einen Film in Metamorph, wählen Sie &quot;Bearbeiten / Speichern Film&quot; in der Menüleiste. Du wirst in der Lage sein, die Bilder zu verwenden, die Geschwindigkeit und den Dateityp des Films auszuwählen. Dann wählen Sie &quot;Save Movie&quot;. </li><li> Um eine Montage und ich spare den Bildstapel als. Stk Datei, die auch in anderen Programmen wie ImageJ verwendet werden. </li><li> Öffnen Sie die Datei in ImageJ und vorab den Rahmen, bis Sie eine Zelle durchläuft Mitose zu finden. . Crop den Bereich um die Zelle und wählen Sie &quot;Bild / Duplizieren&quot; Hinweis: Vergewissern Sie sich, um alle Frames duplizieren. </li><li> Um eine Montage, wählen Sie &quot;Bild / Stacks / Make Montage&quot; in der Menüleiste. Hier können Sie festlegen, welche Bilder Sie sind, der Größe und Form der Montage werden soll, und ob Sie die Grenzen zwischen den Frames. Wählen Sie diese und klicken Sie auf &quot;Okay&quot;. .. Speichern Sie die Montage als tif-Datei und führen Sie einen weiteren Verarbeitung in beiden ImageJ oder Adobe Photoshop Tipp: Ändern Sie montage-Dateien aus dem 16-Bit-Format, das von Metamorph auf 8-Bit-Format verwendet zur leichteren Bildverarbeitung. </li><li> Zur Berechnung der Zeit in verschiedenen Stadien der Mitose bestimmen t = 0 (erste Anzeichen für DNA-Kondensation oder Zellabrundung), die Anzahl der Frames, bis Chromosomen am Äquator (Zeit in Prophase / Prometaphase), Frames ausgerichtet sind, bis Chromosomen zu trennen beginnen (Zeit in der Metaphase) und Frames, bis die Zellen beginnen zu glätten (Anaphase / Telophase / Cytokinese). Die berechnete Zeit in jeder mitotischen Phase hängt von dem Zeitintervall zwischen den einzelnen Bildern. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer typischen Kontroll-siRNA-Transfektion Experiment mit einem HeLa Zelllinie Histon H2B-mCherry. Diese Methode der hat effektiv auf mitotische Timing quantifizieren und enthüllt eine unerwartete Rolle für die nucleoporin Nup153 in das Timing der späten Mitose 1. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Mit den jüngsten Fortschritten in der Bildgebung und fluoreszierendes Protein-Technologie, hat Live-Bildgebung zu einem routinemäßigen Bestandteil der zellulären Analyse 2. Eine Vielzahl von GFP (und andere Farbvarianten 3)-markierte Proteine ​​sind überall erhältlich oder relativ leicht zu konstruieren und können verwendet werden, um eine Reihe von Zellteilung Kennzeichen einschließlich DNA / Chromosom Dynamik 4, 5, Zentrosom Vervielfältigung 6, Cyclin B Dynamik zu verfolgen 7, Kernhülle Abbau und Wiedereinbau 8, 9, Mitosespindel Bildung 10 und verschiedenen Stadien der Cytokinese 11. Tagged Proteine ​​können allein oder in Kombination verwendet werden, wenn die Anregungs / Emissionsspektren von fluoreszierenden Tags kompatibel sind, so dass die Koordination zwischen bestimmten Ereignissen zu beurteilen. Wenn größere räumliche und / oder temporale Auflösung ist / sind erwünscht, auch weiterhin die konfokale Mikroskopie, ob Laser-Scanning-, Spinning-Disk oder Resonanz Scannen verwendet werden kann, und die Liste der anspruchsvolle Mikroskopie-Optionen mit zunehmenden Auflösung zu wachsen. Live-Bildgebung der Mitose in Säugetierzellen ist auch für den Einsatz in High-Throughput-RNAi und kleinen Molekül-Bildschirme 12-14 angepasst worden. Während also ein s erste Experimente mit dieser Technik kann relativ einfach, sind die Möglichkeiten für den Aufbau dieser Strategie umfangreich.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek-II-Kammerobjektträger (4 Mulden)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Weitere Kammergrößen erhältlich</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Zellinkubator für Mikroskoptisch</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Kann jeder geeignete Inkubator verwendet werden</td></tr><tr><td>Automatisiertes invertiertes Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Kann jedes geeignete Mikroskop verwendet werden</td></tr><tr><td>Softwarepaket</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Kann jede geeignete Software verwendet werden</td></tr></tbody></table>

zeitraffer-imaging der mitose nach sirna-transfektion

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Änderungen in der zellulären Organisation und Chromosom Dynamik, die während der Mitose auftreten, sind eng aufeinander abgestimmt, um genaue Vererbung der genomischen und zellulären Inhalte zu gewährleisten. Hallmark Ereignisse der Mitose, wie Chromosom Bewegung, kann ohne weiteres auf eine einzelne Zelle auf der Grundlage einer Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von Säugetier-Zelllinien, die spezifische GFP-markierten Proteine ​​verfolgt werden. In Kombination mit RNAi-basierte Erschöpfung, kann dies eine leistungsfähige Methode der Ermittlung der Bühne (n) der Mitose, wo Mängel auftreten, nachdem das Vorkommen eines bestimmten Proteins gesenkt worden sind. In diesem Protokoll, präsentieren wir eine grundlegende Methode zur Beurteilung der Wirkung von abbauenden eine mögliche mitotischen regulatorisches Protein über den Zeitpunkt der Mitose. Die Zellen werden mit siRNA transfizierten, in einen Tischinkubation Kammer und bebildert mit Hilfe eines automatisierten Fluoreszenz-Mikroskop. Wir beschreiben, wie Sie Software verwenden, um die Einrichtung eines Zeitraffer-Experiment, wie die Bildsequenzen Prozess entweder noch Bildmontagen oder Filme zu machen, und wie zur Quantifizierung und Analyse der Zeitpunkt der Mitosestadien mit einer Zell-Linie Ausdruck mCherry- getaggt Histon H2B. Schließlich diskutieren wir wichtige Überlegungen für die Gestaltung eines Zeitraffer-Experiment. Diese Strategie ist eine Ergänzung zu anderen Ansätzen und bietet die Vorteile von 1) Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen in der Kinetik, die nicht beobachtet, wenn man Zellen einer Population und 2) Analyse der Mitose ohne die Notwendigkeit, den Zellzyklus mit medikamentösen Behandlungen zu synchronisieren könnte. Die visuelle Informationen aus solchen bildgebenden Experimenten ermöglicht nicht nur die sub-Stadien der Mitose zu beurteilen, sondern können auch unerwartete Erkenntnis, dass sich nicht unmittelbar aus Zellzyklusanalyse durch FACS sichtbar.

Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll, um Bild und Quantifizierung der mitotischen Zeitpunkt der Live-Säugetier-Zellkultur-Zellen nach siRNA-Transfektion.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Veränderungen in der zellulären Organisation und der Chromosomenndynamik, die während der Mitose auftreten, sind eng koordiniert, um eine präzise Vererbung des genomischen und ...

Veränderungen in der zellulären Organisation und der Chromosomendynamik, die während der Mitose auftreten, sind eng koordiniert, um eine genaue Weitergabe des genomischen und zellulären Inhalts sicherzustellen. In diesem Videoartikel wird eine Methode zur Verfolgung charakteristischer Ereignisse der Mitose gezeigt. Die Chromosomenbewegung wird auf Einzelzellbasis mithilfe von Zelllinien überwacht, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren.Die Transfektion mit irna, die gegen mitotische Proteine gerichtet ist, führt zu Veränderungen im Zellzyklus, die mittels Zeitrafferaufnahmen sichtbar gemacht und durch Bildanalyse quantifiziert werden können. Hallo, ich bin Douglas Mackey aus dem Labor von Katie Oman am Huntsman Cancer Institute der University of Utah. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Aufnahme lebender Zellen, während sie nach einer SIA-Transfektion die Mitose durchlaufen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um mögliche Auswirkungen einer Störung von Zielproteinen auf den Zeitpunkt des Mitoseverlaufs zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie eine vierwandige Labortechnik-Vierkammerscheibe vor, indem Sie 0,5 Milliliter Fibronectin in jede Kammer geben.Gut 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit bereiten Sie iRNA- und lipRNAI-max-Komplexe für die reverse Transfektion vor. Verwenden Sie gemäß den Herstelleranweisungen für jede Kammer die Menge, die für ein Loch einer 24-Loch-Platte empfohlen wird.Nach 15 Minuten das Fibronectin aus den Vertiefungen der Kammerobjektträger entfernen. Anschließend 100 Mikroliter irna-Komplexe in jede Vertiefung geben und jeweils 20.000 Zellen in 500 Mikrolitern hinzufügen. Die Zellen für 24 Stunden in den Inkubator stellen.Am nächsten Tag das Transfektionsgemisch durch ein Milliliter reguläres Zellkulturmedium ersetzen und die Zellen anschließend weitere 24 Stunden inkubieren, bevor die Bildaufnahme erfolgt. Die Einrichtung für die Bildaufnahme besteht aus einem angepassten Zellinkubator, der auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops platziert wird und über eine Software zur Bildaufnahme gesteuert wird. Um die Bildaufnahme vorzubereiten, sicherstellen, dass der Inkubator vorgewärmt und equilibriert ist.Öffnen Sie anschließend den Deckel des Inkubators und stellen Sie die Zellen mit dem Kammerdeckel im Adapter ein. Befestigen Sie sie mit einer geringen Menge Modelliermasse. Schließen Sie den Deckel und positionieren Sie den gesamten Inkubator auf dem Mikroskoptisch, wobei sichergestellt werden muss, dass der Inkubator fest sitzt.Als Nächstes richten Sie das Experiment mit Metamorph ein, indem Sie im Menüband der Software die Option „Apps Multidimensionale Aufnahme“ auswählen. Daraufhin öffnet sich ein Fenster, in dem die Bildgebungsparameter festgelegt werden können. Geben Sie an, wo die Datendateien gespeichert werden sollen.Danach mithilfe des trockenen Phasenkontrastobjektivs mit 4-facher Vergr&ouml;&szlig;erung die Wellenl&auml;ngen f&uuml;r Hellfeld und mCherry ausw&auml;hlen, ein Zellfeld mit der Software fokussieren und die Autofokus-Funktion ausschlie&szlig;lich f&uuml;r den Hellfeld-Kanal anpassen. Dadurch kann die Software vor jeder Aufnahme automatisch an jeder Stelle neu fokussieren. F&uuml;r die erste Wellenl&auml;nge ein Bild mit einer Belichtungszeit von 50 Millisekunden aufnehmen und die Belichtungszeit auf das Minimum einstellen, das erforderlich ist, um ein gutes Bild zu erhalten.Es ist entscheidend, die Lichtbelastung zu begrenzen, um die langfristige Zellviabilität sicherzustellen. Allgemein lässt sich dies am besten durch die Verwendung eines Neutraldichtefilters und einer längeren Belichtungszeit der Kamera erreichen – und nicht durch Erhöhung der Beleuchtungsintensität.Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle weiteren Wellenlängen. Anschließend stellen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal ein. Danach legen Sie ein Zeitraffer-Intervall von 15 Minuten über acht Stunden an 15 Objektträgerpositionen fest.Wenn eine bessere zeitliche Auflösung gewünscht ist, verkürzen Sie das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen. Beachten Sie, dass die Aufnahme umso länger dauert, je mehr Objektträgerpositionen verwendet werden. Wählen Sie in jedem Zeitintervall eine geeignete Anzahl von Objektträgerpositionen aus und markieren Sie diese, um die Zellpopulation ausreichend abzudecken.Metamor zeichnet die Positionen auf und kehrt zur festgelegten Position für jede Aufnahme zurück. Nachdem die Belichtung über die Zeit und die Wellenlänge sowie Zeit- und Stufenpositionen festgelegt wurden, wählen Sie die Schaltfläche „Vorschau“ auf dem Bildschirm, um zu bestätigen, dass die Software die Geräte ordnungsgemäß steuert.Nachdem sichergestellt wurde, dass das System ordnungsgemäß funktioniert, die Schaltfläche „Acquire“ auf dem Bildschirm auswählen, um die Aufnahme zu starten. Die Automatisierung über mindestens eine komplette Aufnahmerunde beobachten, um sicherzustellen, dass alles korrekt funktioniert. Danach zurücklehnen und dem Computer und Mikroskop die Arbeit überlassen.Um die Daten zu überprüfen, wählen Sie im Menüleistenpunkt „Apps“ die Option „Mehrdimensionale Daten überprüfen“, dann die Ansicht „Dateispeicherort“ und anschließend eine Objektträgerposition aus. Klicken Sie auf „Bilder laden“, um den Bildstapel von dieser Position zu überprüfen. Sobald die Bilder geladen sind, verwenden Sie die Maus, um schrittweise durch die Datenblöcke zu navigieren.Hier werden mithilfe von Metamorph Filme von mitotischen Zellen erstellt. Um in Metamorph einen Film zu erzeugen, wählen Sie „Stack“ und dann „Film erstellen“. Wählen Sie in der Menüleiste aus, welche Bilder verwendet werden sollen, sowie die Geschwindigkeit und den Dateityp des Films.Danach „Speichern“ auswählen, um eine Montage zu erstellen. Zuerst die Daten als .STK-Datei in MetaMorph speichern. Anschließend ImageJ öffnen, die .STK-Datei in ImageJ öffnen und einen interessierenden Bereich zuschneiden, indem der Bereich markiert und im Menü „Bild“ → „Zuschneiden“ ausgewählt wird.Wählen Sie anschließend Bildstapel aus. Erstellen Sie eine Montage, indem Sie festlegen, welche Bilder einbezogen werden sollen, sowie die Größe und Form der Montage und ob Zwischenrahmen mit Rahmen gewünscht sind.Dann klicken Sie auf „OK“. Speichern Sie die Montage als .tiff-Datei. Berechnen Sie abschließend die Zeit in jeder Phase der Mitose, wobei der Zeitpunkt, in dem erstmals Anzeichen der DNA-Kondensation oder der Zellrundung sichtbar sind, als T gleich null für die Prophase festgelegt wird.Die Prometaphase endet, wenn die Chromosomen am Äquator ausgerichtet sind; anschließend folgt die Metaphase, bis die DNA zu segregieren beginnt, gefolgt von Anaphase und Telophase. Schließlich erfolgt die Zytokinese, und die Zellen beginnen sich abzuflachen. Zeitrafferaufnahmen von hiliaren Zellen, die His-Stein exprimieren.H zwei BCFP wird gezeigt. Diese Zellen wurden mit einer Kontroll-siRNA transfiziert und durchlaufen normalerweise den Zellzyklus. Im Vergleich dazu weisen Zellen, die mit siRNAs gegen das nukleäre Porenprotein NUP 153 transfiziert wurden, starke Veränderungen in der MIT-Progression auf.Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Zeitrafferaufnahmeverfahren einrichtet, durchführt und analysiert, um den zeitlichen Ablauf der mitotischen Progression von Zellen nach einer siR-Transfektion zu bestimmen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen so schonend wie möglich zu behandeln, indem die richtige Temperatur und CO2-Konzentration aufrechterhalten und die Lichtexposition der Zellen auf ein Minimum beschränkt wird. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Hier präsentieren wir Ihnen die Echtzeit-Überwachung der Zellwanderung in einem Wundheilung Assay mit TIP60-abgereicherte MCF10A Brust Epithelzellen. Die Umsetzung des live-Zelle bildgebender Verfahren in unserem Protokoll erlaubt uns, Analyse und Visualisierung von einzelligen Bewegung in Echtzeit und über die Zeit.

Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Zellteilungen können in Echtzeit mit fluoreszierend markierten Proteinen und Zeitraffermikroskopie visualisiert werden. Mithilfe des hier vorgestellten Protokolls können Benutzer die Timing-Dynamik der Zellteilung, die mitotische Spindelbaugruppe sowie den Chromosomenkongress und die Segregation analysieren. Defekte in diesen Ereignissen nach RNA-Interferenz (RNAi)-vermitteltem Genknockdown können bewertet und quantifiziert werden.

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen.  Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.

Chemische Dimerisierungsinduzierte Proteinkondensate auf Telomeren

Dieses Protokoll stellt ein neues Reporter-Gensystem und den Versuchsaufbau zum Nachweis der Transkription bei DNA-Doppelstrangbrüchen mit Einzelmolekülsensitivität vor.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Lernen Sie Zeitraffer-Imaging der Mitose nach siRNA-Transfektion in Säugetierzellen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung mitotischer Zeitabläufe und die Analyse chromosomaler Dynamik in lebenden Zellen.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

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