Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Hallo, mein Name ist Sochi ota. Ich bin Postdoktorandin im Labor von Dr. Ken Cho am Department für Entwicklungs- und Zellbiologie der University of California, Irvine. Heute werde ich Ihnen die Herstellung eines einfachen Schnittpräparats eines Xenopus-Embryos zeigen.

Dieses Verfahren umfasst die Halbierung von Froschembryonen im späten Gastrulationsstadium, die Färbung mit einem Antikörper gegen das Molekül der Untersuchung, die Infiltration in Kunststoff und das Anfertigen eines fünf Mikrometer dicken Schnitts aus demselben Kunststoff. Dieses Verfahren kann zur Untersuchung der Immunfluoreszenz, Immunhistochemie oder In situ-Hybridisierung mit sehr hochauflösenden Bildern verwendet werden. Okay, das sind die kleinen praktischen Werkzeuge, die ich für die Plastschnitte von zehn oder mehr Embryonen verwende.

Dies ist eine Metallpinzette mit Delta-Spitze, und diese, Nummer eins, kann verwendet werden, um das Embryo in Kunststoff zu positionieren. Und Nummer zwei kann zusammen mit diesem Pinsel eingesetzt werden, um das Embryo vom Mikrotom auf die Montageoberfläche zu übertragen. Dies ist ein Silikonkautschuk-Isolator, den ich auf die Oberfläche des Objektträgers lege und der eine Wasseransammlung bildet, in der ich die in Kunststoff eingebetteten Embryoschnitte montieren kann.

Nun zeige ich, wie man das Embryo präpariert, indem man das fixierte Embryo für einen Assay wie die In-situ-Hybridisierung oder die Immunfluoreszenznachweisung halbiert. Um das Embryo zu teilen, verwende ich dieses sehr dünne Drahtgitter, das man im Lebensmittelgeschäft kaufen kann. Ich denke, ja, die Embryos werden zur Zellfixierung über Nacht in 3,7 % Formaldehyd fixiert.

Und das, das Reparieren hängt von dem Zweck ab. Dies wird über Nacht fixiert. Für die Zwecke der Schnitthybridisierung kann man eine Fixierung über Nacht durchführen, aber für die Immunfluoreszenznachweis, bei dem Sie das Protein innerhalb des Embryos nachweisen, empfehle ich keine zu lange Fixierung.

Und ich bevorzuge die Fixierung mit 3,7 % Formaldehyd für lediglich zwei Stunden, um die Beeinflussung der subzellulären Lokalisation des Proteins zu minimieren und gleichzeitig eine Überfixierung zu vermeiden, um eine gute Penetration des Antikörpers während des Nachweisschritts zu ermöglichen. Gut, jetzt dissekiere ich dieses Embryo durch einen Schnitt durch die Blastwand auf der linken und rechten Seite. Nun erkenne ich, dass es sich um ein Embryo im Stadium 11 handelt, bei dem der PO sich vollständig von der dorsalen bis zur ventralen Seite erstreckt, jedoch ein bi-Embryo.

Und betrachten wir nun dieses rechte Stück. Sie sehen die Keimzellen sowohl auf der dorsalen als auch auf der ventralen Seite, aber die dorsale Seite ist offensichtlich, da diese Einwärtsfaltung im Vergleich zur ventralen Seite eindeutig am tiefsten ins Innere des Embryos eindringt. Dies ist daher ein gutes, sauber halbiertes Präparat, um sowohl die dorsale als auch die ventrale Seite zu untersuchen.

Im Inneren des Embryos werde ich bei diesem präparierten Embryo die Immunfluoreszenznachweis von im Embryo exprimiertem Protein verwenden. Für die Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie verwendet man spezifische Antikörper zum Nachweis. Das Problem ist jedoch, dass Antikörper nicht gut in das Innere des Embryos eindringen.

Wenn Sie also ein Ganzpräparat, ein Ganzpräparat-Embryo, verwenden, können Sie dies nicht wissen. Sie können das Expressionsmuster Ihrer Proteine im Embryo nicht untersuchen. Doch mithilfe dieses vorher halbierten Embryos können Sie untersuchen, wie das Expressionsmuster in der Zelle tief im Inneren des Embryos aussieht.

Ah, das angefärbte Präparat des Embryos wurde bereits in 3,7 % Formaldehyd fixiert, in Ethanol dehydriert und in den Kunststoff, der Technovit 7100 genannt wird, infiltriert. Dieses Kit enthält drei Bestandteile: diese Hauptflüssigkeit sowie dieses Pulver, das als Härter 1 bezeichnet wird, und diese Flüssigkeit, die als Härter 2 bezeichnet wird.

Zuerst mische ich diesen Hauptbestandteil und den Härter im Verhältnis 100 zu 1, wodurch sich die Infiltrationsmischung ergibt. Dabei handelt es sich um eine Flüssigkeit, mit der ich das Embryo infiltriere. Diese Mischung ist weiterhin flüssig, sodass sie noch nicht aushärtet.

Und diese Embryoproben verbleiben über Nacht in dieser Infiltrationsmischung, um sicherzustellen, dass die Embryoproben vollständig in diesem Kunststoff eingebettet sind. Anschließend nehme ich mithilfe einer Transferpipette eine der Embryoproben und überführe sie in eine dünwwandige 0,5-MPCL-Röhrchen, das ich als Einbettform verwende. Danach entferne ich die überschüssige Flüssigkeit von diesem Embryo.

Und nun ist dieses Embryo, dieses Embryo bereits bereit, in den aushärtenden Kunststoff eingebettet zu werden. Um den aushärtenden Kunststoff herzustellen, mischen Sie diese Infiltrationsmischung mit dieser Härterlösung im Verhältnis 15 zu 1. Nehme ich zum Beispiel 750 Mikroliter dieser Infiltrationsmischung in ein Probengefäß, dann muss ich zusätzlich 50 Mikroliter dieses Härtermittels hinzufügen, um nach dem Zugabe die Polymerisation des Kunststoffs einzuleiten, oops, die Kappe schließen und dann vorsichtig wie folgt mischen.

Und Sie sollten nicht wirbeln, da Sauerstoff der Inhibitor der Polymerisationsreaktion ist. Geben Sie etwa 250 Mikroliter dieser Mischung zum Embryo hinzu. Dieser Polymerisationsschritt dauert fast vier Stunden, sodass Sie keinesfalls Eile haben müssen.

Nachdem Sie zuerst diesen polymerisierenden Kunststoff hinzugefügt haben, können Sie ihn auf- und abpumpen, um das Embryo im Kunststoff schweben zu lassen. Nun nehme ich diese Edelstahl-Pinzette, um das Embryo zu verschieben und auszurichten, sodass die Schneidebene des Embryos an die Unterseite dieser Einbettform gelangt. Danach verschließen Sie die Kappe, da Sauerstoff eine Hemmwirkung auf die Aushärtungsreaktion hat, und lassen Sie das Ganze vier Stunden lang zur Durchführung der Polymerisationsreaktion stehen.

Danach handelt es sich bei dieser Probe bereits um ein HUD, das in der Probe enthalten ist. Sie geben eine Art Klebstoff auf diese Probe, um sicherzustellen, dass dieser harte Kunststoffteil nicht aus der Form herauskommt. Dies ist ein weiterer Kunststoff, der als Klebstoff für diesen Zweck dient und Techno 30 40 genannt wird.

Und ich mische dieses Pulver und die Flüssigkeit mit 2, 2, 1; hier sind 0,6 Gramm dieses Pulvers. Ich werde also 300 Mikroliter dieser Flüssigkeit hinzufügen, sie dann schnell vermischen, wobei dieser Kunststoff ziemlich schnell aushärtet. Dieser Schritt erfordert etwas Schnelligkeit, bevor Sie die Mischung auf die bereits ausgehärtete Probe gießen.

Das ist ausreichend. Schließen Sie die Kappe. Ich sehe so aus.

Und dies benötigt etwa 30 bis 60 Minuten, um hart zu werden. Und dies ist die Vorlage, die einsatzbereit ist. Zuerst schneide ich die Spitze der Form mit einem Pappmesser ab und ziehe diesen Spitzenbereich von der Form ab.

Jetzt sind die eingebetteten Embryonen freigelegt. Außerdem schneide ich diese Kappe ab, da ich sie nicht benötige. Nun nehme ich diese Tain-Roy-Klinge – ich meine nicht die Nadel, sondern die Tain-Roy-Klinge –, die härter ist als die übliche Klinge aus rostfreiem Stahl, die für Paraffinschnitte verwendet wird.

Ich tauche dies kurz in Xin ein, um es zu reinigen. Befestigen Sie dies am Messerhalter und wischen Sie das überschüssige Zaine ab. Manchmal reinige ich auch diesen Bereich mit Zaine, da die Sauberkeit dieses Bereichs äußerst wichtig ist.

Jetzt ist es bereit zum Schneiden. Bevor ich mit dem Schneiden beginne, richte ich die Einbettungskammer ein. Das hier ist ein Objektträger.

Und darauf gebe ich diesen Silikonkautschuk und drücke ihn gleichmäßig nach unten, sodass keine Leckage entstehen kann. Anschließend wird das Objektträgerwärmebett verwendet, und sauberes Mediumswasser wird hinzugefügt, um das Becken zu füllen. So viel Wasser hinzufügen, bis die Oberfläche vollständig überflutet ist.

Und das ist wichtig, weil diese Flutwasseroberfläche eine gleichmäßige Verteilung der Oberflächenspannung des Wassers bewirkt, was entscheidend dafür ist, dass sich der Schnitt gleichmäßig ausbreitet. Jetzt schneide ich, aber davor trage ich diese Maske, weil jedes Schnittstück so leicht ist, so leicht, dass mein Atem es vom Objekttisch wegpusten könnte. Deshalb trage ich diese Maske.

Und nun beginnen Sie mit dem Schneiden. Nachdem eine bestimmte Anzahl von Schnittstücken auf der Probehalterplatte liegt, nehmen Sie diese mit einem Pinsel und bewegen sie langsam über die Kammer. Schlagen Sie leicht gegen den Pinsel, sodass die Stücke durch die Schwerkraft ins Wasser fallen. Sobald sie auf dem Wasser landen, entfalten sie sich und bilden eine kreisförmige Struktur auf der Wasseroberfläche.

Wie sieht das Licht nach dem Übernacht-Trocknen aus. Jetzt sieht es so und so aus. Nun ist die Probe bereit, mit DPI für nukleäre DNA in Kontakt gebracht zu werden.

Und dann können Sie die Probe unter dem Mikroskop untersuchen. Heute habe ich Ihnen die Herstellung von Plastschnitten an einem Froschembryo im späten Gastrulationsstadium gezeigt. Dieses Verfahren ist sehr nützlich, um subzelluläre Strukturen oder die Lokalisation von Proteinen zu untersuchen, die mit der Paraffineinbettungstechnik nicht analysiert werden können, und ist außerdem allgemein auch für die in-situ-Hybridisierung geeignet.

Dieser Plastikschnitt ermöglicht Ihnen außerdem eine gleichmäßige Resthybridisierung; dieses Verfahren kann Ihnen viel höhere Bildsignale liefern als Schnittpräparate aus Paraffin oder gefrorenen Proben.