Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Kunststoffprofile pflegen wahre Gewebemorphologie in dünne Schnitte von Gewebe, das mit fluoreszierenden Sekundärantikörper immungefärbt werden können, so dass diese Methode besser geeignet als Paraffin eingebettet oder Gefrierschnitten für viele Arten von Gewebe. Die Methode zur Färbung-, Kunststoff-Einbettung und Schneiden wird in diesem Video demonstriert.

Hallo, mein Name ist Sotschi ota. Ich bin Postdoktorand im Labor von Dr. Ken Cho am Department of Developmental and Cell Biology der University of California. Irv I Heute zeige ich Ihnen die Vorbereitung des Simpl-Schnitts eines Xenopus-Embryos.

Dieses Verfahren umfasst die Bisektion von Froschembryonen im späten Gasstadium, die Färbung mit Antikörpern gegen das interessierende Molekül, das Infiltrieren in den Kunststoff und das Anfertigen eines fünf Mikrometer großen gleichen Kunststoffabschnitts. Dieses Verfahren kann zur Untersuchung der Immunfluoreszenz-Immunhistochemie oder der in situ Hybridisierung mit sehr hochauflösenden Bildern verwendet werden. Okay, das sind die kleinen praktischen Werkzeuge, die ich für die plastische Schnittung von Embryonen von mehr als 10 Embryonen verwende.

Dies ist eine Metallpinzette mit Deltaspitze und diese, Nummer eins, die verwendet werden kann, um den Embryo in Kunststoff zu orientieren. Und Nummer zwei: Dieser kann zusammen mit diesem Pinsel verwendet werden, um den Embryo vom Mikrotom auf die Montagefläche zu übertragen. Dies ist ein Silikonkautschuk-Isolator, den ich auf die Oberfläche des Objektträgers lege und der einen Wasserzug ausführt, an dem ich die Scheiben der plastisch geschnittenen Embryonen befestigen kann.

Jetzt zeige ich, wie man den Embryo, den fixierten Embryo für den Assay halbiert, wie z.B. die Nstituten-Hybridisierung oder die Immunfluoreszenzdetektion. Und um den Embryo in die Hälfte zu schneiden, verwende ich dieses sehr dünne Wüstengitter, das man im Supermarkt kaufen kann. Ich denke ja, es gibt fixierte Embryonen, die die Zelle fixieren 3,7% formelles High über Nacht.

Und das ist es, wie Sie es beheben, hängt vom Zweck ab. Dies wird über Nacht behoben. Für die Zwecke der Inzisionshybridisierung können Sie sich für eine Fixierung über Nacht entscheiden, aber für den Immunfluoreszenznachweis, bei dem Sie das Protein im Inneren des Embryos nachweisen, empfehle ich keine zu lange Fixierung.

Und ich mache lieber die 3,7%-Formhöhenfixation für nur zwei Stunden, um den Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation des Proteins zu minimieren und auch die Überfixierung zu vermeiden, um die schöne Penetration des Antikörpers während des Nachweisschritts zu ermöglichen. Okay, jetzt seziere ich diesen Embryo durch die Strahlwand und schneide die linke und rechte Seite. Jetzt sehe ich, dass es sich um einen Embryo im Stadium 11 handelt, bei dem der PO den ganzen Weg von der dorsalen Seite zur ventralen Seite ist, aber bi ein Embryo

Und werfen wir einen Blick auf dieses rechte Handstück. Sie sehen den Blast-Po sowohl auf der dorsalen Seite als auch auf der ventralen Seite, aber die dorsale Seite ist offensichtlich, weil diese Einstülpung im Vergleich zur ventralen Seite eindeutig in die tiefste, tiefste Tiefe des Embryos vordringt. Dies ist also ein gutes Stück, ein gutes halbiertes Stück, um sowohl die dorsale als auch die ventrale Seite zu untersuchen.

Im Inneren des Embryos, dieses präparierten Embryos, werde ich die Immunfluoreszenzdetektion von Proteinen verwenden, die im Inneren des Embryos exprimiert werden. Und für die Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie verwenden Sie antikörperspezifische Antikörper zum Nachweis. Das Problem ist jedoch, dass Antikörper nicht sehr gut in das Innere des Embryos eindringen.

Wenn Sie also einen ganzen Mount oder einen ganzen Mount Embryo verwenden, können Sie es nicht wissen. Sie können das Expressionsmuster Ihrer Proteine am Embryo nicht untersuchen. Aber mit diesem vorhalbierten Embryo können Sie untersuchen, was das Expressionsmuster in der Zelle tief im Inneren des Embryos ist.

Ah, fleckenbefleckter Embryo wurde bereits in 3,7% Formaldehyd fixiert, in Ethanol dehydriert und in den Kunststoff infiltriert, der Techno 7, 100 genannt wird. Und dieses Kit besteht aus drei Teilen, nämlich dem Hauptteil Flüssigkeit und diesem Pulver, das als Härter bezeichnet wird. Und diese Flüssigkeit heißt Härter zwei.

Zuerst mische ich diesen Hauptteil und den Härter mit 100 zu 1 Reio, wodurch Sie diese Infiltrationsmischung erhalten. Und das ist es, was ist, das ist eine Flüssigkeit, in die ich diesen Embryo infiltriert habe. Und das ist noch flüssig, so dass es noch nicht aushärtet.

Und das ist, dass diese Embryonenproben über Nacht in dieser Infiltrationsmischung belassen werden, um sicherzustellen, dass die Embryonenproben vollständig in diesem Kunststoff zusammengefasst sind. Nun nehme ich diesen der Probenembryonen mit einer Transferpipette und übertrage ihn in ein dünnwandiges 0,5 MPCL Röhrchen, das ich als Einbettungsform verwende. Dann entferne ich aus diesem Embryo überschüssige Flüssigkeit.

Und jetzt ist dieser Embryo, dieser Embryo bereit, in den aushärtenden Kunststoff eingebettet zu werden. Um den aushärtenden Kunststoff herzustellen, mischen Sie diese Infiltrationsmischung mit diesem Härtungsrohr im Verhältnis 15 zu eins. Wenn ich zum Beispiel 750 Mikroliter dieser Infiltrationsmischung nehme, um das Rohr zu untermauern, dann soll ich auch 50 Mikroliter dieses Härters hinzufügen, um die Polymerisation des Kunststoffs nach der Zugabe zu initiieren, ups, schließen Sie die Kappe und mischen Sie dann nur vorsichtig so.

Und Sie sollten keinen Wirbel machen, da Sauerstoff der Inhibitor der Polymerisationsreaktion ist. Geben Sie etwa 250 Mikroliter dieser Mischung in den Embryo. Und dieser Polymerisationsschritt dauert fast vier Stunden, was Sie sollten, Sie müssen sich überhaupt nicht beeilen.

Nachdem Sie diesen polymerisierenden Kunststoff zuerst hinzugefügt haben, können Sie ihn auf und ab spritzen, um den Embryo im Kunststoff schwimmen zu lassen. Und jetzt nehme ich diese Metallpinzette, um den Embryo um ihn herum zu schieben und ihn so auszurichten, dass die Schnittfläche des Embryos auf den Boden dieser Einbettungsform kommt. Dann schließen Sie die Kappe, da Sauerstoff ein Inhibitor der Aushärtungsreaktion ist, und lassen Sie sie vier Stunden lang einwirken, damit die Reaktion möglich ist.

Danach ist dies eine HUD-Herde, die bereits in der Stichprobe ist. Sie tragen eine Art Klebstoff auf diese Probe auf, um sicherzustellen, dass dieses harte Kunststoffteil nicht aus dieser Form herauskommt. Dies ist ein weiterer Kunststoff, der zu diesem Zweck als Klebstoff fungiert und Techno 30 40 genannt wird.

Und ich mische dieses Pulver und die Flüssigkeit mit 2, 2, 1, hier sind 0,6 Gramm dieses Pulvers. Also werde ich 300 Mikroliter dieser Flüssigkeit hinzufügen, sie dann schnell mischen und dieser Kunststoff wird ziemlich schnell hart. Das ist also ein Teil, man muss ein bisschen hart sein und dann das zu diesem bereits gehörten Sample gießen.

Das ist gut genug. Schließen Sie die Kappe. Ich sehe so aus.

Und es dauert ungefähr 30 bis 60 Minuten, bis es hart wird. Und das ist es, was bereit ist zu handeln. Zuerst schneide ich die Spitze der Form mit einem Pappmesser ab und ziehe diesen Spitzenteil von dieser Form ab.

Jetzt sind also diese eingebetteten Embryonen freigelegt. Und auch diese Kappe habe ich abgeschnitten, weil ich sie nicht brauche. Jetzt nehme ich diese Stain-Roy-Nadel, ich meine nicht die Nadel-Roy-Klinge, die härter ist als die normale Fleckenklinge, die zum Parin-Schneiden verwendet wird.

Ich tauche es kurz in Xin, um es sauber zu machen. Stellen Sie dies auf die, setzen Sie es auf den Klingenhalter und wischen Sie die überschüssige Zaine aus. Und manchmal reinige ich diesen Bereich auch mit Zaine, weil die Sauberkeit dieses Bereichs absolut wichtig ist.

Jetzt ist es bereit zum Schneiden. Bevor ich mit dem Schneiden beginne, richte ich die Montagekammer ein. Das ist also Diaglas.

Und darüber hinaus fülle ich diesen Silikonkautschuk ein und schiebe den Landwirt den ganzen Weg herum, so dass es kein Leck geben wird. Und legen Sie es auf den Rutschenwärmer und gießen Sie dieses saubere medizinische Wasser ein, um unseren Pool zu bauen. Und gib so viel Wasser, wie du bekommst, bis du die Oberfläche des Oberflächenwassers bekommst.

Und das ist wichtig, weil diese Flutwasseroberfläche eine gleichmäßige Verteilung der Oberflächenspannung des Wassers ergibt, was wichtig ist, damit sich der Abschnitt gleichmäßig ausdehnt. Jetzt schneide ich, aber vorher trage ich diese Maske, weil jedes Stück Schnitt so leicht ist, so leicht und meine Brust kann von der Bühne weggeblasen werden. Also trage ich diese Maske.

Und jetzt beginnen Sie mit dem Unterteilen. Nachdem du eine bestimmte Anzahl von Abschnittsstücken auf die Bühne gebracht hast, nimmst du diese mit dem Pinsel und bewegst dich langsam auf diese Bergkammer und klopfst auf diesen Pinsel, damit diese Teile durch die Schwerkraft ins Wasser gelangen. Und sobald sie auf dem Wasser landen, dehnen sie sich zu einem kreisförmigen Stück auf der Wasseroberfläche aus.

Wie ist das Licht nach dem Trocknen über Nacht? Jetzt sieht es so und so aus. Jetzt ist die Probe bereit, mit DPI für Kern-DNA in Kontakt zu treten.

Und dann kann man unter dem Mikroskop studieren. Heute habe ich Ihnen die Vorbereitung des Kunststoffschnitts mit einem Froschembryo im späten Gasstadium gezeigt. Dieses Verfahren ist sehr nützlich für die Untersuchung von Subzellen oder Lokalisationen von Proteinen, die mit der Paren-Embedding-Technik nicht untersucht werden können, und auch für die Resthybridisierung im Allgemeinen.

Dieser plastische Schnitt bietet Ihnen auch für die Resthybridisierung, dieses Verfahren kann Ihnen ein viel höheres Bildniveau liefern als Paren- oder Gefrierschnittprobe.