Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus
14. Juli 2010
Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der Aß 1-42 Peptid. Hier bieten wir ein Protokoll zur Herstellung von synthetischen Aß 1-42 Oligomere, die Hippocampus Langzeit-Potenzierung beeinträchtigt, ein zelluläres Korrelat der Erinnerung. Dieses Verfahren ist nützlich für die Untersuchung von Mechanismen der Aß-induzierte Pathologie und Wirkstoff-Screening.
Synthetisches Beta-Amyloid 1–42 wird in HFIP resuspendiert, um das Peptid zunächst zu modifizieren, und anschließend zu einem Film eingeengt, um es zu ligandisieren. Der Film wird in DMSO resuspendiert, in Phosphatpuffer verdünnt und über Nacht inkubiert. Schließlich wird das oligomere Peptid mit Aufzeichnungspuffer verdünnt und auf akute hippocampale Schnitte perfundiert, wobei die Wirkung der Beta-Amyloid-Exposition auf die synaptische Plastizität bewertet wird.
Willkommen im Labor von Avio Orio an der Columbia University in New York City. Hallo, heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, das wir für die Herstellung von Li-Rise-Beta-Amyloid optimiert haben und das auf einem Protokoll basiert, das ursprünglich 2003 von Stein und Kollegen vorgeschlagen wurde. In diesem Labor haben wir dieses Verfahren verwendet, um amyloid-beta-induzierte synaptische Dysfunktionen zu untersuchen.
Beginnen wir nun. Lassen Sie das Röhrchen mit lyophilisiertem Beta-Amyloid-Pulver 30 Minuten lang auf Raumtemperatur kommen, um Kondensation zu vermeiden, wenn es unter dem Abzug geöffnet wird. Öffnen Sie das Röhrchen und geben Sie eiskalte HFIP hinzu, um eine endgültige Beta-Amyloid-Konzentration von einem Millimolar zu erhalten.
Schließen Sie das Gefäß und wirbeln Sie es zur Mischung; teilen Sie die Lösung mithilfe einer Hamilton-Spritze schnell gleichmäßig auf drei Low-Bindings-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Schließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, damit sich das Peptid mischen kann. Öffnen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie in ein Speed-Vac, um die Lösung einzudampfen. Zentrifugieren Sie etwa 15 Minuten bei 800 G unter Vakuum.
Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 25 Grad Celsius nicht überschreitet, um eine Proteindegradation zu vermeiden. Die Drehung ist beendet, wenn sich ein klarer, trockener Peptidfilm am Boden des Röhrchens abgesetzt hat. Der Film kann schwer zu erkennen sein; verschließen Sie die Röhrchen und lagern Sie ungenutzte Aliquots bis zu sechs Monate bei minus 80 Grad Celsius im Abzug. Verwenden Sie DMSO, um den Peptidfilm auf eine Endkonzentration von fünf Millimolar aufzulösen, und sonifizieren Sie zehn Minuten im Wasserbad.
Um eine vollständige Resuspension des Peptids sicherzustellen, lagern Sie 1,6-Mikroliter-Aliquote der fünf Millimolaren Beta-Amyloid-Lösung bei minus 20 Grad Celsius. Jeder Aliquot sollte nur einmal am Tag vor dem Experiment aufgetaut werden; tauen Sie einen Aliquot der fünf Millimolaren Beta-Amyloid-Lösung auf und geben Sie 98,4 Mikroliter sterilem Phosphatpuffer hinzu, um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erhalten. Vortexen Sie 30 Sekunden lang und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für 12 Stunden. Um die Ligamentierung zu ermöglichen, beginnen Sie ein Experiment, indem Sie frische hippocampale Lyse 90 Minuten lang inkubieren.
Im Standard-Aufzeichnungspuffer wird die stimulierende Elektrode auf die Shafer-Kollateralen und die Ableitelektrode auf die Stratum-radium-Schicht platziert. Sobald eine Reaktion gefunden wurde und die Grundlinie 10 Minuten stabil ist, verdünnen Sie das gesamte Ligan β-Amyloid auf 200 Nanomolar. Da β-Amyloid im Aufzeichnungspuffer unspezifisch an Glas bindet, sollte so weit wie möglich Plastik verwendet werden.
Perfudieren Sie die Beta-Amyloid-Lösung 20 Minuten lang auf die Schnitte. Führen Sie Ihre bevorzugte tetanische Stimulation durch. Zum Beispiel ein Theta-Burst unmittelbar nach dem Tetanus, gefolgt von einem Wechsel zurück zur Perfusionslösung mit normalem Aufzeichnungspuffer.
Überwachen Sie die Aufzeichnung mindestens zwei Stunden nach dem Tetanus, um die Induktion einer langzeitpotenzierung (LTP) zu bestätigen und die Wirkungen der Beta-Amyloid-Behandlung zu beobachten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man oligomeres Beta-Amyloid 1–42 zur Induktion einer Beeinträchtigung der synaptischen Plastizität in Hippocampus-Schnitten herstellt. Bei dieser Vorgehensweise ist es wichtig zu beachten, dass eine zu starke Austrocknung des Peptidfilms zu einer unvollständigen Ligandierung führen kann.
Es ist außerdem entscheidend, Kunststoffgefäße für Beta-Amyloid-Lösungen zu verwenden, um unspezifische Peptidbindung zu vermeiden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Herstellung synthetischer Aβ 1-42-Oligomere vor, die bekanntermaßen die langzeitige Potenzierung im Hippocampus beeinträchtigen, einen zentralen Mechanismus, der mit dem Gedächtnis assoziiert ist. Das Verfahren ist entscheidend für die Untersuchung von Aβ-induzierter Pathologie sowie für die Wirkstoffscreening-Anwendung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Alzheimer-Forschung
Hintergrund
- Die Alzheimer-Krankheit ist gekennzeichnet durch erhöhte Konzentrationen des Aβ 1-42-Peptids.
- Aβ 1-42-Oligomere sind an der synaptischen Dysfunktion beteiligt.
- Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist ein zellulärer Korrelat des Gedächtnisses.
- Das Verständnis der Wirkungen von Aβ kann bei der Arzneimittelentwicklung helfen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Synthese von Aβ 1-42-Oligomeren bereitstellen.
- Die Mechanismen der Aβ-induzierten synaptischen Schädigung untersuchen.
- Die Arzneimittelscreening für potenzielle Alzheimer-Behandlungen erleichtern.
Verwendete Methoden
- Resuspension von synthetischem Beta-Amyloid in HFIP.
- Konzentrierung des Peptids zu einem Film zur Ligamentierung.
- Resuspension in DMSO und Inkubation in Phosphatpuffer.
- Beurteilung der Beta-Amyloid-Exposition an akuten Hippocampus-Schnitten.
Hauptergebnisse
- Die hergestellten Aβ 1-42-Oligomere beeinträchtigen die synaptische Plastizität wirksam.
- Das Protokoll ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse bei der Untersuchung synaptischer Dysfunktionen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Rolle von Aβ in der Alzheimer-Pathologie bei.
- Mögliche Anwendungen in der Wirkstoffscreening-Verfahren für Alzheimer-Therapien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll zur Synthese von Aβ 1-42-Oligomeren ist wirksam und zuverlässig.
- Diese Studie vertieft das Verständnis der Auswirkungen von Aβ auf gedächtnisbezogene Prozesse.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um therapeutische Optionen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Die durch oligomere β-Amyloid1-42 induzierte Beeinträchtigung der synaptischen Plastizität im Hippocampus bietet ein robustes, krankheitsrelevantes Modell für die Forschung zu frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit. Dieses Paradigma ermöglicht eine mechanistische Entlastung und eine vorhersagbare Sicherheit bei der Validierung von Zielstrukturen und beim Screening von Wirkstoffen hinsichtlich synaptischer Dysfunktion. Der Ansatz unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er die translative Relevanz von kandidatenbasierten Interventionen, die auf amyloidvermittelte Pathologie abzielen, klärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung amyloidbedingter synaptischer Dysfunktionen in einem kontrollierten ex vivo-System.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Quantifizierung der LTP-Störung nach Exposition gegenüber oligomeren β-Amyloid.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung von Hypothesen zur Alzheimer-Krankheit auf synaptischer Ebene.
- Bietet eine Plattform für eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Bewertung von Wirkstoffen in frühen Entwicklungsstadien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Stellt einen reproduzierbaren Assay zur Quantifizierung der synaptischen Plastizitätsstörung in hippocampalen Schnitten bereit.
- Standardisiert die Herstellung und Applikation oligomerer β-Amyloid-Proben für konsistente Assayergebnisse.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Wirkstoffkandidaten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die LTP-Störung zu reduzieren.
- Unterstützt Skalierbarkeit und die Wiederverwendung der Plattform für Hochdurchsatz-Screening-Initiativen.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht krankheitsrelevanten Mechanismen, die bei der frühen Alzheimer-Pathologie eine Rolle spielen.
- Bietet Kontinuität von der molekularen Zielstrukturenbindung bis hin zu funktionellen synaptischen Effekten.
- Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Verbindungseffekte mit translationalen Biomarkern der synaptischen Gesundheit verknüpft werden.
- Unterstützt die Auswahl und Validierung präklinischer Modelle für nachgeschaltete In-vivo-Studien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem sie die Überprüfung von Hypothesen, die Absicherung von Zielstrukturen und die quantitative Beurteilung der synaptischen Funktion als Reaktion auf Amyloid-Exposition ermöglicht.
- Entdeckungsbereich Biologie: Ermöglicht die Überprüfung der Nullhypothese bezüglich amyloidinduzierter synaptischer Beeinträchtigungen und die Klärung beteiligter Signalwege.
- Screening: Bietet einen standardisierten und reproduzierbaren Assay zur Bewertung von Substanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Unterbrechung der langzeitpotenzierung (LTP).
- Analysen: Liefert quantitative Messgrößen der synaptischen Plastizität für belastbare statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet ex vivo-Befunde mit krankheitsrelevanten Biomarkern und präklinischen Endpunkten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt einen wiederverwendbaren Arbeitsablauf für laufende Zielstrukturen-Validierungen und Screening-Kampagnen in Programmen zur Neurodegeneration bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung von Alzheimer-Zielen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Assays zur synaptischen Beeinträchtigung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Fortführung oder Abbruch von Projekten und die Kapitalnutzungseffizienz, indem der Fokus auf funktionelle, krankheitsrelevante Endpunkte gelegt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Assets zur Neurodegeneration.
Durchführungsaspekte
- Benötigt Fachkenntnisse im Umgang mit Peptiden, in der Herstellung von hippokampalen Schnitten und in der elektrophysiologischen Ableitung.
- Erfordert Zugang zu spezialisierten Geräten zur Messung der langzeitpotenzierung (LTP) und zu kontrollierten Perfusionsystemen.
- Setzt eine strenge, übergreifende Standardisierung der Peptidpräparation und der Testverfahren zwischen den Teams voraus.
- Kann je nach Löslichkeit und Bindungseigenschaften eine Anpassung an verschiedene Modellsysteme oder Wirkstoffklassen erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität der Peptidaggregation und die Empfindlichkeit gegenüber experimentellen Bedingungen.
