Name: Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Lernen Sie die Herstellung oligomerer β-Amyloid 1-42 und deren Wirkung auf die synaptische Plastizität im Hippocampus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung amyloidinduzierter synaptischer Dysfunktion.

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Diese Arbeit wurde vom NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442) unterstützt.&gt;

Resuspendieren β-Amyloid-Peptid Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> Aß 1-42 (gefriergetrocknetes Pulver) </li><li> 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) </li><li> Low-Bindung Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) </li><li> Gasdichte Hamilton-Spritze mit Teflon stürzen zu stoppen (250 ul) </li><li> Dimethylsulfoxid (DMSO) </li></ul><ol><li> Lassen lyophilisiert Aß 1-42 bei Raumtemperatur für 30 Minuten ins Gleichgewicht zu Kondensation beim Öffnen der Peptid-Fläschchen zu vermeiden. </li><li> Unter der Abzugshaube, resuspendieren Aß-Peptid 1-42 in eiskaltem HFIP zu einer 1 mM Lösung und Vortex die Lösung für ein paar Sekunden zu erhalten. </li><li> Mit einem Glas Gasdichte Hamilton-Spritze mit Teflon-Stecker, schnell teilen die Aß 1-42 / HFIP-Lösung in drei gleich große Polypropylen Ampullen und dichten die Gefäße. </li><li> Die Fläschchen werden dann für 2 Stunden inkubiert, um für Aß Monomerisierung ermöglichen. Dann öffnen Sie die Fläschchen und konzentrieren die Aß 1-42 / HFIP Lösung unter Vakuum mit Hilfe eines SpeedVac Zentrifuge (800 g, Raumtemperatur), bis eine klare Peptid-Film ist an der Unterseite der Fläschchen beobachtet. Prüfen Sie sorgfältig die Temperatur im Inneren des SpeedVac Zentrifuge Peptidabbau vermeiden (max 25 ° C). </li><li> Verschließen Sie die Fläschchen und speichern Sie die Aliquots bei -80 ° C. Aß Film kann für 6 Monate gespeichert werden. </li><li> Re-suspend ein Film, indem DMSO zu einer Konzentration von bis zu erhalten, um 5 mM Aß 1-42. Mit Ultraschall im Wasserbad für 10 Minuten, um sicherzustellen, komplette Resuspension. </li><li> Aliquot dieser 5mM Aß 1-42 Lösung in Polypropylen Ampullen. Seal alle Fläschchen und lagern Sie sie bei -20 ° C. Aliquots sollten nur einmal aufgetaut werden. Hüten Sie sich Kondenswasser im Inneren der Tiefkühltruhe. Peptide in Lösung zersetzen sich sehr leicht. </li></ol> Oligomerisierung Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> Aß 1-42 / DMSO (5mm) </li><li> Sterile Phosphat-Puffer </li><li> Low-Bindung Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) </li><li> Low-Bindung Polypropylenzentrifugenröhrchen (50 ml) </li></ul><ol><li> Verdünnen Sie die erhaltenen 5mM Aß 1-42 / DMSO Aliquot mit sterilem Phosphatpuffer (bis zu 100 ul). </li><li> Vortex für 30 Sekunden und anschließend 12 Stunden lang bei 4 ° C </li></ol> Hippokampalen Slice Behandlung Bei der Behandlung von Schnitten des Hippocampus, ist es wichtig, nicht-spezifische Peptid Haftung auf Bechern, Infusionsschlauch Flächen und die Aufnahme Kammer zu vermeiden. Verwenden Sie bevorzugt low-Bindung Polypropylen Rohre und Behälter. Vermeiden Sie die Verwendung von Glas-oder Kunststoff-generic-ware. Perfusion Medien sollten Serum-oder Albumin-frei. Aß Perfusion Bevor Sie beginnen müssen bereit: <ul><li> Oligomerisiert Aß 1-42 </li><li> Recording-Puffer (in mM: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na 2 HPO 4, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2 und 10 Glukose) </li><li> Elektrophysiologische Aufzeichnung Set-up mit Schnittstelle Kammer </li><li> Quer Schnitten des Hippocampus in Sauerstoff Aufzeichnungspuffer für mindestens 90 Minuten nach der Präparation inkubiert (T = 29 ° C; konstant Perfusionsrate = 2 ml / Minute) </li></ul><ol><li> Unmittelbar vor dem Experiment, verdünnen oligomerisiert Aß 1-42 Aliquot auf den entsprechenden Arbeitsgruppen Konzentration (200 nM oder höher) in einem Polypropylen-Rohr mit pre-Sauerstoff Aufzeichnungspuffer. </li><li> Versorgen die Aß 1-42 Lösung für 20 Minuten, um die Scheiben vor der Induktion der synaptischen Plastizität. </li></ol> Induktion von Plastizität und Follow-up <ol><li> Typischerweise ist der am weitesten verbreitete Modell der synaptischen Plastizität der LTP. Es kann durch tetanische Stimulation eines bestimmten Synapsen im Hippocampus induziert werden. Wir Datensatzfeld Antworten von Synapsen zwischen den Shaffers Sicherheiten Projektionen und CA1 pyramidalen Neuronen in der Schicht radiatum. Unsere tetanische Stimulation besteht aus einem Theta-Burst Stimulation, die 3-Züge um 15 Sekunden getrennt sind. Jeder Zug besteht aus 10 Ausbrüche bei 5 Hz, wo jeder Burst bringt 5 Impulse bei 100 Hz. Übernehmen Sie die tetanische Stimulation unmittelbar nach der Perfusion der oligomerisiert Aß abgeschlossen ist. </li><li> Unmittelbar nach der tetanischen Stimulation wieder auf Perfusion mit normaler Aufnahme-Puffer. Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionsrate, Aufnahme Kammertemperatur und ordnungsgemäße Sauerstoffversorgung während der gesamten Dauer des Experiments. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse und mögliche Probleme Die Aß oligomerisiert nach dem klassischen Protokoll Stine et coll. 1 erzeugt Aß Monomeren und eine Vielzahl von Oligomeren unterschiedlicher Größes (Dimer, Trimer, etc.) Die Perfusion des oligomerisiert Aß 1-42 führt zu einer verminderten LTP in Aß-behandelten Scheiben im Vergleich zur Kontrollgruppe Scheiben schneiden. Unter unseren experimentellen Bedingungen, wo 3-5 Monate alten C57BL/6J männlichen Mäusen verwendet werden, LTP in 200 nM Aß-behandelten Scheiben auf durchschnittlich 150% der Ausgangswerte in zwei Stunden nach dem tetanischen Stimulation, während die Kontrolle Scheiben LTP-Werte im Durchschnitt 200-250% der baseline2. In einigen Fällen kann die Behandlung mit Aß nicht zu hippocampalen LTP zu reduzieren. Mehrere kritische Fehler, die auftreten könnten, umfassen ein extremes Filmtrocknung während Aß-Konzentration und unvollständiger Oligomerisierung. Aß Perfusion in Schnitten des Hippocampus könnte ein weiterer Anlass zur Sorge wegen der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Aß-Peptid in Lösung, die anfällig für unspezifische Haftung auf Kunststoffen ist. Troubleshooting von diesen Fragen wird im Folgenden erörtert.

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Columbia University IACUC gesetzt durchgeführt.

Wie oben beschrieben, können verschiedene Probleme in der Herstellung von oligomeren Aß in unbeeinträchtigt LTP führen. Eine Möglichkeit zu prüfen, ob Aß Abbau oder der Mangel an Aß Oligomerisierung stattgefunden haben könnte ist, die Aß Vorbereitung mit Tris-Tricin PAGE / Western Blot-Analyse und analytische Ultrazentrifugation (noch nicht in diesem Protokoll beschrieben) zu bewerten. Als Western Blot Proben unter non-denaturing/non-reducing Bedingungen vorbereitet sind, sollte eine erfolgreiche Vorbereitung erzeugen e...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42 (lyophilisiert)</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-Propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>50-mL-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>1,5-ml-MaxyClear-Mikroröhrchen mit maximaler Rückgewinnung</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>GASTIGHT-Spritzen 250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac-Konzentratoren-System</td><td>Verschiedene</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von oligomeren β-amyloid 1-42 und induktion der synaptischen plastizität impairment auf schnitten des hippocampus

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Wertminderung von synaptischen Verbindungen geeignet ist, die subtilen amnesic Veränderungen in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) zugrunde liegen. β-Amyloid (Aß), ein Peptid, in hohen Mengen in AD produziert, ist bekannt, dass Langzeit-Potenzierung (LTP), ein zelluläres Korrelat von Lernen und Gedächtnis zu reduzieren. In der Tat ist LTP Beeinträchtigung durch Aß verursacht eine nützliche experimentelle Paradigma zur Untersuchung synaptischer Funktionsstörungen in AD-Modellen und zum Screening von Drogen in der Lage zu mildern oder Zurücksetzen wie synaptic Beeinträchtigungen. Studien haben gezeigt, dass Aß die LTP Unterbrechung produziert bevorzugt über ihr oligomerer Form. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für beeinträchtigen LTP durch Perfusion von oligomerisierten synthetischen Aβ1-42-Peptid auf akuten Schnitten des Hippocampus. In diesem Video, skizzieren wir eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung von oligomeren Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt;. Dann folgen wir ein individuelles Experiment, bei dem LTP im Hippocampus Scheiben ausgesetzt oligomerisiert Aß reduziert wird<sub&gt; 1-42</sub&gt;, Um Scheiben in einem Kontrollexperiment, wo kein Aß im Vergleich<sub&gt; 1-42</sub&gt; Exposition stattgefunden hatte.

Ein Merkmal der Alzheimer-Krankheit ist die Erhöhung der Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; Peptid. Hier bieten wir ein Protokoll zur Herstellung von synthetischen Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; Oligomere, die Hippocampus Langzeit-Potenzierung beeinträchtigt, ein zelluläres Korrelat der Erinnerung. Dieses Verfahren ist nützlich für die Untersuchung von Mechanismen der Aß-induzierte Pathologie und Wirkstoff-Screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Eine Beeinträchtigung synaptischer Verbindungen liegt wahrscheinlich den subtilen amnestischen Veränderungen zugrunde, die in den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) auftreten. ...

Synthetisches Beta-Amyloid 1–42 wird in HFIP resuspendiert, um das Peptid zunächst zu modifizieren, und anschließend zu einem Film eingeengt, um es zu ligandisieren. Der Film wird in DMSO resuspendiert, in Phosphatpuffer verdünnt und über Nacht inkubiert. Schließlich wird das oligomere Peptid mit Aufzeichnungspuffer verdünnt und auf akute hippocampale Schnitte perfundiert, wobei die Wirkung der Beta-Amyloid-Exposition auf die synaptische Plastizität bewertet wird.Willkommen im Labor von Avio Orio an der Columbia University in New York City. Hallo, heute zeigen wir Ihnen ein von uns optimiertes Verfahren zur Herstellung von Li-Rise-Beta-Amyloid, das auf einem Protokoll basiert, das ursprünglich 2003 von Stein und Kollegen vorgeschlagen wurde. In diesem Labor haben wir dieses Verfahren verwendet, um amyloid-beta-induzierte synaptische Dysfunktionen zu untersuchen.Beginnen wir also. Lassen Sie das Röhrchen mit lyophilisiertem Beta-Amyloid-Pulver 30 Minuten lang auf Raumtemperatur kommen, um Kondensation beim Öffnen unter dem Abzug zu vermeiden. Öffnen Sie das Röhrchen und geben Sie eiskalte HFIP hinzu, um eine endgültige Beta-Amyloid-Konzentration von einem Millimolar zu erhalten.Schließen Sie das Gefäß und wirbeln Sie es zur Vermischung; teilen Sie die Lösung mithilfe einer Hamilton-Spritze schnell gleichmäßig auf drei Low-Bindings-Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen auf. Schließen Sie die Röhrchen und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, damit sich das Peptid vermischt. Öffnen Sie die Röhrchen und stellen Sie sie in ein Speed-Vac, um die Lösung einzudampfen. Zentrifugieren Sie etwa 15 Minuten bei 800 × g unter Vakuum.Stellen Sie sicher, dass die Temperatur 25 Grad Celsius nicht übersteigt, um eine Proteindegradation zu vermeiden. Die Drehung ist beendet, wenn sich ein klarer, trockener Peptidfilm am Boden des Röhrchens abgesetzt hat. Der Film kann schwer zu erkennen sein; verschließen Sie die Röhrchen und lagern Sie ungenutzte Aliquote bei minus 80 Grad Celsius bis zu sechs Monate lang in der Haube. Verwenden Sie DMSO, um den Peptidfilm auf eine Endkonzentration von fünf Millimolar aufzulösen, und sonifizieren Sie zehn Minuten lang in einem Wasserbad.Um eine vollständige Resuspension des Peptids sicherzustellen, lagern Sie 1,6 Mikroliter-Aliquote der fünf Millimolaren Beta-Amyloid-Lösung bei minus 20 °C. Jeder Aliquot sollte nur einmal am Tag vor dem Experiment aufgetaut werden; tauen Sie einen Aliquot der fünf Millimolaren Beta-Amyloid-Lösung auf und geben Sie 98,4 Mikroliter sterilem Phosphatpuffer zu einem Endvolumen von 100 Mikroliter hinzu, wirbeln Sie 30 Sekunden lang und inkubieren Sie bei 4 °C für 12 Stunden. Um die Ligamentierung zu ermöglichen, beginnen Sie ein Experiment, indem Sie frische hippocampale Lysate 90 Minuten lang inkubieren.Im Standard-Aufzeichnungspuffer wird die stimulierende Elektrode auf die Collaterale von Shafer und die Ableitelektrode auf die Stratum radiatum platziert. Sobald eine Reaktion gefunden wurde und die Grundlinie 10 Minuten stabil ist, verdünnen Sie das gesamte Liganden-Beta-Amyloid auf 200 Nanomolar. Da Beta-Amyloid im Aufzeichnungspuffer unspezifisch an Glas bindet, verwenden Sie so viel wie möglich Plastikmaterial.Perfundieren Sie die Beta-Amyloid-Lösung 20 Minuten lang auf die Schnitte. Geben Sie Ihre bevorzugte tetanische Stimulation. Zum Beispiel ein Theta-Burst unmittelbar nach dem Tetanus, gefolgt von einem Wechsel zurück zur Perfusion mit normalem Aufzeichnungspuffer.Überwachen Sie die Aufzeichnung mindestens zwei Stunden nach dem Tetanus, um die Induktion der langzeitpotenzierung (LTP) zu bestätigen und die Wirkungen der Beta-Amyloid-Behandlung zu beobachten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man oligomeres Beta-Amyloid 1–42 zur Induktion einer Beeinträchtigung der synaptischen Plastizität in Hippocampus-Schnitten herstellt. Bei dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, dass eine zu starke Austrocknung des Peptidfilms zu einer unvollständigen Ligandierung führen kann.Es ist außerdem entscheidend, Kunststoffgefäße für Beta-Amyloid-Lösungen zu verwenden, um unspezifische Peptidbindung zu vermeiden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Herstellung von oligomeren β-Amyloid_1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

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