Name: Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-02T15:15:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Einzelzell-Ableitung von Aktionspotentialen im Chiasma opticum der Ratte mit speziell gefertigten Wolfram-Glaselektroden. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zur visuellen Informationsverarbeitung.

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Wir danken Dr. Dan Green für die Bereitstellung technischer Aufwand bei der Entwicklung dieser experimentellen Techniken. Diese Arbeit wurde vom NIH Grant R01-EY016849A und die Smith Family New Investigator Award unterstützt.

Teil I: Herstellung von Tungsten-in-Glas-Elektroden <ol><li> Ein Graphit-Ring wird in ein Becherglas mit einer konzentrierten Lösung von Natriumnitrat (0.71g/mL) und Kaliumhydroxid (0.34g/mL) in Wasser 1 gelöst gefüllten, und der Becher unter dem Näharm einer modifizierten Nähmaschine gelegt . </li><li> Tungsten Draht (Durchmesser 0,5 mm, 6 cm Länge) ist es, die Näharm, so dass es teilweise eingetaucht ist (1-2cm) in Lösung aufgezeichnet. </li><li> 2V sind über die Wolfram-Draht durch die Anbringung eines Pluspol an die Näh-Arm und ein Minuspol an die Graphit-Ring angewendet. </li><li> Die Nähmaschine ist eingeschaltet und der Wolfram-Draht wird wiederholt in die Lösung mit einer Rate von ~ 4Hz für 2 min, die elektrolytisch ätzt das Metall zu einer scharfen Spitze eingetaucht. </li><li> Die geätzten Draht wird auf eine manuelle Mikromanipulator und an der Stelle unter mikroskopischer Führung (40x Vergrößerung) mit der Welle eines Glaspipette (0,25 mm OD, 0.175mm ID) gezogen, um eine 1mm-Spitze mit einem Glas puller ausgerichtet ist. Um zu verhindern, Bewegung während Draht Einführen wird das Glas vorübergehend auf dem Mikroskoptisch mit Kitt befestigt. </li><li> Der Draht wird vorsichtig in den unpulled Ende des Glases fortgeschritten, in den Schacht, und durch die 1 &amp;mgr; Öffnung Ein kleines Stück Glas gesehen brechen Sie die Spitze in dem Video, was auf einen festen Sitz der Wolfram in das Glas. Der Draht sollte etwa 5-10mm über die Spitze für Ratten LWL-Aufnahmen zu erweitern. </li><li> Cyanacrylat ist es, die unpulled Ende des Glases aufgetragen und nach dem Aushärten die elektrische Impedanz wird gemessen, wo 1MΩ Elektroden in der Regel am besten funktionieren. </li></ol> Teil II: Stereotaktische Setup und Spike Zug Recordings <ol><li> Der Stimulus-Display-System ist in dem Video dargestellt, zusammen mit den stereotaktischen Apparat und Microdrive für die Positionierung und die Senkung der Elektrode in das Gehirn. </li><li> Zur Durchführung der Netzhaut spike Zug Aufnahmen der Ratte wird betäubt und später gelähmt. Standard-Verfahren (nicht dargestellt) für die chirurgische Insertion eines femoralis Kanüle für Drug-Delivery und eine tracheale (Y-Rohr) Kanüle zur mechanischen Beatmung während der Lähmung eingesetzt. Die Experimente sind Terminals für das Tier. </li><li> Nach vorbereitenden Verfahren wird das Tier auf der Heizdecke gelegt und der Kopf ist in stereotaktische Position fixiert, wie von Rattenhirn atlas 2 definiert, mit Ohr und Zahn Bars. </li><li> Die rektale Sonde eingesetzt wird, steuert die Heizdecke über eine homeothermic Steuergerät, das die Körpertemperatur hält bei 37 ° C. </li><li> Metall-Nadel verwendet werden, wie führt zu dem Elektrokardiogramm und überwachen die Herzfrequenz zu messen. </li><li> Die Haut ist auf der Oberseite des Schädels geöffnet und der Schnittpunkt der Schädel-Platten (Bregma) ausgesetzt ist. Ein speziell konstruiertes Gestell Querlatte anstelle gesetzt ist, wird ein Kreis auf dem Schädel um begma durch ein Loch in die Querlatte markiert, und die Latte ist vorübergehend entfernt. </li><li> Die stereotaktischen Systems wird durch die Positionierung der Führungsnadel über Bregma kalibriert. Ein 5-mm-Loch in den Schädel an der markierten Stelle gebohrt und der Knochen wird entfernt, so dass das Gehirn. Ein dünner Ring von Kitt ist rund um die Öffnung im Schädel platziert, um eine Dichtung um das Loch in der Latte, die zurückgesetzt wird in Stelle zu bilden. </li><li> Wenn das Tier auf einem stabilen Ebene der Narkose für eine Weile ist es mit Gelähmten injiziert, um Augenbewegungen während der Datenerfassung zu verhindern. Nach Atemstillstand das Tier mechanisch belüftet ist. Ein benutzerdefiniertes Programm Tracks Lüftungs-und physiologischen Parameter während des gesamten Experiments und informiert den Experimentator, wenn kompensatorische Maßnahmen sind erforderlich, sollten alle Parameter außerhalb der normalen Niveaus zu gehen. </li><li> Die Führungsnadel ist mit dem Wolfram-Elektrode Backloaded und senkte in das Gehirn. Nach Hirnpenetration die Querlatte Loch ist mit Agar (nicht dargestellt) gefüllt, und das Microdrive Montage ist die Latte für die mechanische Stabilität geklemmt. Die Wolfram-Elektrode wird dann langsam fortgeschritten (2μm/sec) die Führungsnadel, bis die Spitze ist ca. 8-9mm unterhalb der Schädelbasis, wo das Chiasma befindet. </li><li> Spike Züge gehören retinalen Ganglienzellen durch ihre Reaktion auf visuellen Input identifiziert. Nach Isolierung eines einzigen Lichtwellenleiter das rezeptive Feld der aufgenommenen Zelle ist in visuellen Raum kartiert und ihre Reaktion Eigenschaften sind mit treibenden Gitter oder andere visuelle Muster von Interesse geprägt. Die Stabilität des Systems ermöglicht eine Single-Unit-Aufnahmen von mehreren Stunden 3. </li></ol> Materialien Adult Brown-Norway Ratten (250-400g) wurden von einem kommerziellen Anbieter erworben und beherbergt unter einem geregelten (12/12) Hell / Dunkel-Zyklus. Die Narkose wurde mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Hydrochlorid und Xylazin (70 und 2 mg / kg bzw. Henry Schein Inc.) induziert und aufrecht erhalten für die Dauer des experiment mit einer intravenösen Infusion von Ketamin und Xylazin (30 und 1 mg / kg / h) mit Dextrose, Salz vermischt und gallamine triethiodide (40 mg / kg / h, Fischer Inc) durch einen Katheter (0,13 mm OD, Small Parts Inc ) in die rechte Vena femoralis. Gallamine wird in der Mischung, um Augenbewegungen zu lähmen enthalten. Die Infusion der Pumpe (WPI Inc) eingestellt wurde, wie notwendig, um eine stabile Ebene der Narkose zu halten, wie Herzfrequenz und Blutdruck Variabilität beurteilt. Nach Lähmung, war das Tier mechanisch beatmet (Harvard Apparatus, Model 683) durch eine Trachealkanüle bei 60-80 Atemzüge / min (2cc Volumen), wobei die Rate bei Bedarf angepasst werden, um zu halten endexspiratorischen CO 2 mit einem in-line gemessen Kapnometer (Novametrix Inc, Model 710Sp) bei 30%. Die Körpertemperatur wurde über eine homeothermic Decke Steuerung (Harvard Apparatus Inc) geregelt. Körpertemperatur, endexspiratorischen CO 2, Herzfrequenz und Blutdruck wurden kontinuierlich während des gesamten Versuchs von einem LabVIEW-Programm überwacht. Visuelle Reize wurden auf einem Sony Multiscan 17e CRT-Monitor (mittlere Leuchtdichte von 30 cd / m 2) mit 100 Hz mit einer Auflösung von 800x600 Pixel dargestellt. Datenerfassung und-Monitor-Ausgang wurden mit kundenspezifischer Software in Matlab und LabView in Verbindung mit einem Video-Bild-Prozessor (Cambridge Research Systems Inc, Bits + +) und die Psychophysik Toolbox 4 geschrieben wurde. Das Tier sah den Reiz Display (40,4 x 30,2 cm) in einem Abstand von 16,5 cm durch Kontaktlinsen (Ocular Instruments Inc) und Augentropfen wurde periodisch während des Experiments zu halten die Augen feucht angewendet. Das Gesichtsfeld zugänglich Stimulation wurde durch reverse Montage des Tieres in einem stereotaktischen Apparat (Stölting Co) erhöhten 14cm über der Oberfläche eines schwebenden Tisch (TMC Inc) und die Einstellung des Monitors auf einem speziell entwickelten Schlitten, auf dem Tisch entlang bewegt maximiert von ± 100 Grad Bogen um die Nase. Dies ergab ein repositionierbar Anzeigefeld, dass 60-Grad oberhalb und 35-Grad unterhalb der Augenhöhe und ± 42-Grad seitlich von der Mitte des Monitors erweitert. Tungsten electodes wurden mit Draht von Small Parts Inc und benutzerdefinierte Borosilikatglas von Friedrich und Dimmock Inc. Ein Standard micropippete Puller (Sutter Instruments, Modell P-97) erhalten wurde hergestellt wurde benutzt, um das Glas Tip Shape. Die Elektrodenimpedanz-Tester wurde von Bak-Electronics gekauft. Die Elektroden wurden mit einem motorisierten Microdrive-System (Newport Inc, StepperMike) fortgeschritten. Elektrokardiogramm und Sehnerv Signale wurden verstärkt und mit einer hohen Eingangsimpedanz Multielektroden Verstärker (FHC Inc, X-Cell 3x4) filtriert. Herzschläge wurden mit einem Fenster-Diskriminator (WPI Inc, Model 121) festgestellt. Nerve Aktionspotentiale wurden erkannt und mit einem Zeitstempel versehen mit 0,1 ms Auflösung von einer digitalen spike Diskriminator (FHC Inc., APM). Die Spike-Diskriminator wurde gated durch ein Trigger-Signal aus dem Video-Bildprozessor, so dass Spike mal auf den Stimulus wurden gesperrt.

<ol><li>Levick, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+tungsten+microelectrode%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Another tungsten microelectrode.</a> Med Biol Eng. 10 (4), 510-515 (1972).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , Fourth Edition, Academic Press. London, UK. (1998).</li>
<li>Freeman, D. K., Heine, W. F., Passaglia, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maintained+discharge+of+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The maintained discharge of rat retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 25 (4), 535-548 (2008).</li>
<li>Brainard, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychophysics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Spat+Vis%22%5BJournal%5D)">The psychophysics toolbox.</a> Spat Vis. 10, 433-436 (1997).</li>
</ol>

Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Boston University zugelassen.

Glasfaser-Aufnahmen sind ein attraktiver Ansatz für die Bewältigung experimentellen Fragen zu retinalen Informationen Kodierung und Übertragung, die eine intakte Auge erfordern. Darüber hinaus kann die Signalisierung Eigenschaften beider Augen in nahezu der gleichen physiologischen Zustand untersucht werden, wenn die Elektrode in das Chiasma oder Trakt, wo die Aktivität von gekreuzten und ungekreuzten Sehnervenfasern mit einer einzigen Elektrode Eindringen aufgezeichnet werden kann positioniert ist. Glasfaser-Aufnahmen ...

single-einheit in-vivo- aufnahmen aus dem chiasma der rat

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Informationen über die visuelle Welt ist, das Gehirn in Sequenzen von Aktionspotentialen in retinalen Ganglienzellen Axone, die den Sehnerv übertragen.<em&gt; In-vivo-</em&gt; Aufnahmen von Ganglienzellen spike Züge in verschiedenen Tiermodellen haben viel von dem, was darüber, wie die frühen visuellen System bekannten Verfahren offenbart und kodiert visueller Informationen. Allerdings haben solche Aufnahmen wurden in einem der am häufigsten Tiermodellen, die Ratte, möglicherweise wegen Schwierigkeiten bei der Erkennung Spikes von kleinem Durchmesser Axone abgefeuert selten. Die vielen Netzhauterkrankungen Modelle mit Ratten zu motivieren ein Bedürfnis für die Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften von Ganglienzellen, ohne das Auge, wie bei intraokularen oder<em&gt; In-vitro-</em&gt; Aufnahmen. Hier zeigen wir eine Methode zur Aufzeichnung Ganglienzelle spike Züge aus dem Chiasma der narkotisierten Ratte. Wir zeigen zunächst, wie Wolfram-in-Glas-Elektroden, abholen elektrische Aktivität von einzelnen Ganglienzelle Axone von Ratten kann fabrizieren. Die Elektroden übertreffen alle kommerziellen dass wir versucht haben. Wir haben dann zeigen unsere maßgeschneiderten stereotaktischen Systems zur<em&gt; In vivo</em&gt; Visuellen Neurophysiologie Experimente und unsere Verfahren für tierische Vorbereitung und zuverlässige und stabile Platzierung der Elektroden in das Chiasma.

Retinalen Ganglienzellen übertragen visuelle Informationen vom Auge an das Gehirn mit Sequenzen der Aktionspotentiale. Hier zeigen wir, wie man die Aktionspotentiale einzelner Ganglienzellen Rekord<em&gt; In vivo</em&gt; Von narkotisierten Ratten.

Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat

Informationen über die visuelle Welt werden in Sequenzen von Aktionspotenzialen in den Axonen der retinalen Ganglienzellen an das Gehirn übertragen, welche den Sehnerv bilden ...

Wir werden heute ein von uns entwickeltes Aufzeichnungssystem vorstellen, mit dem wir In-vivo-Aufzeichnungen vom Chiasma opticum der Ratte durchführen können. Solche Aufzeichnungen sind bei der Ratte bisher sehr selten gewesen, unter anderem deshalb, weil die Axone der retinalen Ganglienzellen, aus denen der Sehnerv besteht, sehr klein sind, was die Ableitung von Einzelzellen erschwert. Da die Ratte ein häufig verwendetes Tiermodell für die Untersuchung der Netzhautdegeneration ist, könnten diese Aufzeichnungen eine große Menge an nützlichen Informationen liefern. Der Schlüssel zur erfolgreichen Durchführung dieser Aufzeichnungen lag in den von uns konstruierten Wolframelektronen aus Glas, die eine lange, spitze Spitze besitzen und es ermöglichen, Aktionspotentiale von dünnen Axonen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu registrieren.Wir führen Sie durch den Herstellungsprozess dieser Elektroden und zeigen Ihnen, wie wir das Tier am stereotaktischen Gerät positionieren. Anschließend zeigen wir Ihnen ein Beispiel für die Aufzeichnung von Aktionspotentialfolgen aus einer einzelnen Ganglienzelle. Zur Herstellung der Elektroden werden drei Hauptgeräte benötigt: ein Standard-Glasge

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Dieses Video zeigt die Vorbereitung eines Rattenmodells zur Untersuchung der Netzhautgesundheit und der Integrität der Sehbahn. Visuell evozierte Potential- und Elektroretinographie-Referenz- und aktive Elektroden werden mit der Ratte verbunden, gefolgt von der Ausrichtung der Plattform mit der Ratte vor der Ganzfeld-Schale für eine gleichmäßige Netzhautbeleuchtung und dem Schließen des Faradayschen Käfigs, um externe Störungen zu vermeiden.

Vorbereitung eines Rattenmodells zur Beurteilung der Integrität der Sehbahn unter Verwendung eines elektrophysiologischen Aufbaus

Dieses Video zeigt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung einer anästhesierten Ratte für elektrophysiologische Aufzeichnungen der Gehirnaktivität von mehreren Stellen. Die Kopfhaut wird präpariert, um Zugang zum Schädel zu erhalten, und es werden Löcher an präzisen Stellen gebohrt, um Elektroden zu installieren und zu sichern. Wolfram-Mikrodrahtelektroden werden dann an der Zielstelle eingesetzt, um die Daten aufzuzeichnen.

In vivo Elektrophysiologische Aufzeichnungen von Gehirnaktivitäten von mehreren Stellen bei Ratten

Dieses Video zeigt den Prozess der Messung visuell evozierter Potentiale oder VEPs bei einer dunkeladaptierten, anästhesierten Ratte mit präimplantierten Schädelelektroden, die die elektrischen Signale vom visuellen Kortex des Gehirns als Reaktion auf Lichtreize aufzeichnen.

Aufzeichnung visuell evozierter Potentiale über die Schädelelektroden in einem Rattenmodell

Dieses Video zeigt, wie man das Elektroretinogramm (ERG) und das visuell evozierte Potenzial (VEP) bei einer bewussten Ratte aufzeichnet. Die Ratte wird zunächst mit chirurgisch implantierten Elektroden dunkeladaptiert. Nach dem Auftragen von dilatierenden Tropfen wird das Tier in eine Fesselung gelegt und in eine Ganzfeld-Schüssel gelegt. Anschließend werden die ERG- und VEP-Signale aufgezeichnet.

Aufnahme des Elektroretinogramms und des visuell evozierten Potentials bei einer Ratte

Ex vivo ERG kann verwendet werden, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen direkt von isolierten intakten Netzhäuten von Tieren oder Menschen aufzuzeichnen. Wir zeigen hier, wie gängige in vivo ERG-Systeme für ex vivo ERG-Aufzeichnungen adaptiert werden können, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen zu zerlegen.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

Fokale Demyelinisierung wird im Sehnerv durch Lysolecithin-Mikroinjektion induziert. Visuell evozierte Potentiale werden über Schädelelektroden aufgezeichnet, die über den visuellen Kortex implantiert werden, um die Signalleitung entlang der Sehbahn in vivo zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Verfahren, die der Elektrodenimplantation und der Mikroinjektion des Sehnervs zugrunde liegen.

Visuell evozierten Potential-Aufnahme in einem Rattenmodell für Experimentelle Optic Nerve Demyelinisierung

Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Messung von Elektroretinogramm und visuell evozierten Potentialen bei anästhesierten Ratten.

Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

Wir zeigen eine chirurgische Implantation und Aufnahmeverfahren visuelle elektro Signale aus dem Auge (ERG) und Gehirn (visuell evozierte Potentiale) zu messen in der bewussten Ratten, die mehr analog zum menschlichen Zustand ist, wo Aufnahmen ohne Narkose verwechselt durchgeführt werden.

Implantations- und Aufzeichnung von Wireless-Elektroretinogramm und visuell evozierten Potenziale in wachen Ratten

Hier beschreiben wir Methoden der optogenetischen Manipulation bestimmter Arten von Neuronen bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen und stellen unsere jüngsten Arbeiten am Bettkern der Stria terminalis als Beispiel vor.

Optogenetische Manipulation von neuronalen Schaltkreisen während der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um in vivo Einzelneuronen-Aufzeichnungen mit hoher Dichte aus dem Hirnstamm von kopffixierten Mäusen zu erhalten. Dieser Ansatz wird eingesetzt, um das Aktionspotentialfeuer von Neuronen im ventrolateralen periaquäduktalen Grau - einer Hirnstammregion, die während des REM-Schlafs (Rapid Eye Movement) inaktiv ist - vor und während der Vollnarkose zu messen.

Akute Einzel-Multi-Elektroden-Ableitungen aus dem Hirnstamm von Mäusen mit fixiertem Kopf

Lernen Sie die Einzelzell-Ableitung von Aktionspotentialen im Chiasma opticum der Ratte mit speziell gefertigten Wolfram-Glaselektroden. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zur visuellen Informationsverarbeitung.

Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat

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