Laser Mikrodissektion Angewandt auf Gene Expression Profiling von Untergruppe von Zellen aus dem Drosophila Wing Disc

Im Folgenden finden Sie eine ausführliche Beschreibung der Lasermikrodissektion, die angewendet wird, um ein A-verglichenes RNA-Transkript-Profiling von stillgelegten und nicht stillgelegten Bereichen der Drosophila-Flügelscheibe zu erreichen. Dieser Ansatz erfordert als biologisches Material manuell präparierte Drosophila-Bildscheiben als Hauptgerät, einen Laser-Mikrodissektor. Wir verwenden das LI A-L-L-M-D 6.000 und ein real time PCR Gerät.

Wir haben ein BioRad iq verwendet. Fünf kleine Werkzeuge, die benötigt werden, sind: eine konkave Platte, ein kleiner Pinsel, eine Mikrodissektionszange, eine hängende Fallrutsche, Insektenpings, montiert auf Spritzennadeln, ein Metallrahmen mit PET-Membran und kleine Kunststoffröhrchen. Diese Methode umfasst die folgenden Schritte.

Schritt eins ist die Kreuzung von zwei geeigneten oph-transgenen Linien, um ein lokalisiertes und spezifisches Gen-Silencing in den Nachkommen unter Verwendung des GAL-Vier-UAS-Systems auszulösen. Schritt zwei, um die Präparierrahmen zu behandeln. Schritt drei, um den Laser-Mikrodissektor einzurichten.

Schritt vier, um die Flügel-Imaginalscheiben von den Larven der genetischen Kreuzung manuell zu entnehmen. Schritt fünf, um eine Lasermikrodissektion bestimmter Bereiche der GFP-markierten imaginalen Scheiben durchzuführen. Schritt sechs, die Transkriptionsprofilierung äquivalenter Bereiche von stillgelegten und unfesten Regionen der Bandscheibe, ermöglicht die Etablierung der Effekte, die durch das Silencing Ihres interessierenden Gens ausgelöst werden.

Nennen Sie es Gen X in vivo Transkriptionsprofilierung erfordert die Extraktion von RNA aus den mikropräparierten Bereichen, die Kontrolle der Genauigkeit der manuellen Dissektion, die Bewertung der GFP-Expression in den beiden Proben durch R-T-P-C-R und die Quantifizierung der Expression des Putatives. Ziele des Silence-Gens in den beiden Proben durch Echtzeit-R-T-P-C-R oder durch Durchführung einer Microarray-Analyse. Jetzt mehr Details zu jedem Schritt.

Der erste Schritt, die genetische Kreuzung. Die genetische Kreuzung umfasst vier transgene GAL-Stämme und zielt darauf ab, schallgedämpfte imaginale Scheiben in den Larvennachkommen zu erhalten. Das vielseitige GAL-Four-System ermöglicht es Ihnen, spezifisches und lokalisiertes Gen-Silencing durch RNA-Interferenz auszulösen.

Ein Stamm führt in der Kreuzung das Treibertransgen ein, das GAL vier in einem spezifischen zeitlichen oder räumlichen Muster exprimiert. Und A-U-A-S-G-F-P-Reporter, der die Visualisierung des GAL-Vier-Expressionsbereichs ermöglicht. Der zweite Stamm führt ein UAS-Responder-Transgen ein, das Haarnadel-Silencing-RNA exprimiert und in der Lage ist, spezifisch auf Gen X abzuzielen, sobald es in der Zelle exprimiert wird.

Diese RNA wird gespalten, um kleine interferierende RNA zu erzeugen, die in der Lage ist, das selektierte Gen X in den Nachkommen dieser Kreuzung spezifisch zum Schweigen zu bringen. Das UAS-Silencing-Transgen wird nur in den Zellen transkribiert, die das GAL-4-Protein exprimieren, wodurch ein räumlich eingeschränktes Silencing des X-Gens induziert wird. Unter den vielfältigen Anwendungen konzentrierten wir uns auf die Erstellung von RNA-Transkriptprofilen in Flügelscheiben, die durch den Grailed GAL 4-Treiber zum Schweigen gebracht werden, der das spezifische Silencing im hinteren Kompartiment steuert.

Die Stilleregion ist durch die Expression des U-A-S-G-F-P-Transgens gekennzeichnet. Im hinteren Kompartiment. Zwei Ereignisse werden ausgelöst: die Expression von GGFP und die Stilllegung von Gen x.

Schritt zwei, Behandlung der Dissektionsrahmen, um die Aktivität der RNAs zu hemmen. Waschen Sie die Rahmenführungen und Sezierwerkzeuge mindestens eine Stunde lang mit DEPC-Wasser bei Raumtemperatur und lassen Sie sie in einer sterilen Kammer trocknen. Um die RNA-Aktivität zu hemmen, verwenden Sie ein brandneues 50-ml-Röhrchen, das bereits RNAs-frei ist, mit DEPC-Wasser gefüllt und mit einer Pinzette in das Röhrchen gefüllt ist, einen hängenden Tropfschieber und einen Haustierrahmen.

Beide benötigt Für die Mikrodissektion. Schließen Sie die Tube, drehen Sie sie auf den Kopf und lassen Sie sie mindestens eine Stunde lang reagieren. Bewegen Sie bei Raumtemperatur eine Stunde später das DEPC-Wasser mit der Pinzette in ein anderes Röhrchen.

Halten Sie die Objektträger in der Röhre, damit sie nicht herunterfallen. Lassen Sie dann die Objektträger in der Röhre trocknen. Schritt drei, die Einrichtung von Mikrodissektionen.

Schalten Sie zunächst alle benötigten Geräte ein, die Fluoreszenzlampe, das Mikroskop und die Software für die Mikrodissektion. Ein Warnfenster erinnert Sie daran, auch den Laser einzuschalten. Tun Sie es und lassen Sie den Laser aufwärmen, während Sie die Mikrodissektion einrichten

Jetzt ist es an der Zeit, die Vertiefungen vorzubereiten, in denen das Gewebe gesammelt werden soll. Schneiden. Mit dem Leica LMD 6.000 Laserschneidgerät können bis zu vier Röhrchen geladen werden, um verschiedene Proben zu entnehmen. Für unseren Zweck benötigen wir nur zwei Röhren.

Eines, um das GFP-positive Stillegewebe zu sammeln, das andere, um GFP-negatives Unilgewebe mit einem Mikropec zu sammeln. Füllen Sie beide Röhrchenkappen mit 20 Mikrolitern Tri-Reagenzlösung, um die RNA zu konservieren. Jetzt ist das Mikropräparat einsatzbereit Schritt vier, die Handsektion von Flügelbildscheiben von Wurflarven.

Isolieren Sie die Flügelscheiben von den Nachkommen der Larven, die wie zuvor beschrieben erhalten wurden, und stellen Sie sicher, dass andere Gewebe die Bandscheiben nicht kontaminieren. Um dieses Ziel zu erreichen, unterscheidet sich der Ansatz der Sektion stark von dem, der üblicherweise verwendet wird, um den Großteil aller ursprünglichen Scheiben zu sammeln. Waschen Sie die Larve zuerst in Ringerlösung, um anhaftende Medien zu entfernen. Übertragen Sie es dann in eine hängende Tropfrutsche und schneiden Sie den Kopf sofort ab, indem Sie den Mund nach unten ziehen.

Mit den Insektennadeln wird nun vorsichtig weiteres Gewebe abgetrennt. Der rote Umriss zeigt die imaginären Flügelscheiben, die eingesammelt werden sollen. Halten Sie die Scheiben schnell und schonend frei vom anhaftenden Gewebe Übertragen Sie jede isolierte Flügelscheibe zum sofortigen Schnitt in einen Präparierrahmen.

Dieser Vorgang muss so lange wiederholt werden, bis die Gesamtzahl von hundert Flügelscheiben erreicht ist. Schritt fünf, Lasermikrodissektion bestimmter Bereiche von GFP-markierten Flügelscheiben. Sobald sich die originale Flügelscheibe auf der Membran befindet, können Sie mit dem Schnitt fortfahren.

Setzen Sie den Rahmen auf seine Halterung und befestigen Sie die Halterung auf der motorisierten Bühne. Suchen Sie nach der originalen Flügelscheibe, indem Sie das LMD 6.000 als gängiges Mikroskop verwenden. Fokussieren Sie sich darauf und legen Sie den Schnitt fest.

Zeichne einen ovalen Bereich, der auf beide Seiten der Scheibe passt, die GFP-positive und die andere. Wählen Sie den Röhrchendeckel aus, an dem Sie den GFP-Positivteil auffangen möchten. Drücken Sie die Schaltfläche Start Cut.

Der Mikrodissektor fährt mit dem Schneiden des Gewebes mit der Geschwindigkeit und der Leistung fort, die Sie zuvor eingestellt haben, indem Sie die Funktion Bewegen und Schneiden auswählen. Sie können den Schnitt manuell verfeinern, bis das nicht ausgewählte Gewebestück herunterfällt. Die 3D-Animation zeigt, was unter den Mikros passiert: Dissector-Schnitt, ein Laserwesen, das sich auf das Gewebe konzentriert, führt einen Schnitt entlang des ausgewählten Umfangs aus.

Sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Gewebestück in den ausgewählten Röhrchendeckel und folglich in das Tri-Reagenz. Verschieben Sie nach dem ersten Schnitt den Schnittbereich auf der anderen Seite der Flügelscheibe, um einen äquivalenten GFP-Negativbereich zu schneiden. Bevor Sie mit dem neuen Schnitt fortfahren, stellen Sie sicher, dass Sie einen anderen Röhrchendeckel auswählen, um das GFP-positive Gewebe vom GFP-negativen Gewebe zu trennen.

Drücken Sie die Start-Cut-Taste nach dem automatischen Schnitt. Fahren Sie mit der manuellen Verfeinerung des Schnitts fort, wie in der 3D-Animation vor dem zweiten Schnitt gezeigt. Der motorisierte Tisch bewegt die ausgewählte Tubenkappe unter den Schnittbereich.

Der Laserstrahl fokussiert sich auf das geschnittene Gewebe entlang des ausgewählten Umfangs, und sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Gewebestück in die ausgewählte Röhrchenkappe mit dem Tri-Reagenz. Um genügend Material zu sammeln, wiederholten Wir die Prozedur an hundert imaginären Flügelscheiben. Sobald Sie die Proben entnommen haben, entladen Sie die Röhrchen.

Dies ist ein heikler Schritt, der dazu führen kann, dass Sie all die Arbeit, die Sie bisher geleistet haben, verlieren. Seien Sie also vorsichtig. Schließen Sie die Kappe auf dem Kopf und fahren Sie mit dem Experiment fort.

Dies ist das mit GFP-positivem Gewebe. Dies ist die andere mit GFP-negativem Gewebe. Schritt sechs, Transkriptionsprofilerstellung.

Drehen Sie die Röhrchen, um die Flüssigkeit von der Kappe zu lösen, und fügen Sie das Reagenz bis zu einem Milliliter hinzu. Führen Sie die RNA-Extraktion nach dem Standard-Versuchsreagenzprotokoll aus hundert Bereichen von jeweils etwa 5.000 Mikrometern im Quadrat durch. Unsere Ausbeute lag bei 1,5 Mikrogramm RNA.

Wir verwenden hochgestellte drei in vitrogen, um CD NA mit zufälligem Hexa zu synthetisieren. Die Genauigkeit der manuellen Dissektion wurde durch Überprüfung der GFP-Expression in den beiden Proben mit R-T-P-C-R kontrolliert. Wie im Gel mit quantitativer R-T-P-C-R gezeigt.

Wir untersuchten die Expressionsniveaus des Stille-Gens X zusammen mit denen möglicher mutmaßlicher Ziele des Gen-X-vermittelten Regulationswegs. Dieses Diagramm zeigt ein Beispiel für die Expressionsniveaus von Gen X und eines seiner mutmaßlichen Ziele. Nennen Sie sie Gene Y in Bezug auf ihre basalen Expressionsniveaus in den vorderen hinteren Kompartimenten unsolider Flügelscheiben.

Es wurde festgestellt, dass die Aktivität des ausgewählten Gens X nach dem Silencing auf 40% reduziert war. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass eines seiner mutmaßlichen Ziele, Gen Y, signifikant um das Siebenfache hochreguliert wurde, was uns dazu veranlasst, die Hypothese zu validieren, dass es durch Gen X negativ reguliert wurde.Wir kommen zu dem Schluss, dass der oben beschriebene experimentelle Ansatz erfolgreich auf die Validierung von mutmaßlichen Zielen auf verschiedenen Regulationswegen angewendet werden kann.