Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen bestimmten lichtempfindlichen Wirkstoff, beispielsweise einen chemisch abgeschirmten fluoreszierenden Farbstoff, in einem lebenden Zebrafischembryo mit Auflösung auf Einzelzellniveau durch Licht zu aktivieren. Dies wird erreicht, indem ein lichtempfindlicher Wirkstoff in Ein-Zell-Stadium-Embryonen injiziert wird, die einen lebenden genetischen Markierungsvektor exprimieren, um beliebige Zielzellen zu lokalisieren und gezielt anzusteuern. In einem zweiten Schritt werden die Embryonen kultiviert und in einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt montiert, das den lebenden Embryo immobilisiert.

Anschließend wird die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um eine sichtbare fluoreszierende transgene Markierung zu lokalisieren. Der lichtempfindliche Wirkstoff wird dann in einer gewünschten Fokusebene aktiviert, und der Umfang der Photoaktivierung wird überwacht. Das Schicksal der resultierenden markierten Zellen kann anschließend in späteren embryonalen Entwicklungsstadien verfolgt werden.

Dieses Verfahren kann zur Aktivierung einer Vielzahl von Verbindungen mit einer Auflösung auf Einzelzellniveau in lebenden Proben verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der konfokalen Mikroskopie oder der Blitzlampe, liegt darin, dass sie die photochemische Aktivierung relativ tiefliegender Gewebe auf einer axialen Ebene von wenigen Mikrometern mit relativ geringer Phototoxizität ermöglicht. Die hier vorgestellte Methode wird jedoch zur Selenkantenverfolgung verwendet und kann auch für die photochemische Aktivierung einer Vielzahl von Komponenten eingesetzt werden, wodurch eine gezielte Steuerung über Entwicklungs- und physiologische Prozesse ermöglicht wird. Am Abend vor der Injektion bereiten Sie Paarungstanks vor und trennen männliche und weibliche Zebrafische einer transgenen Linie, die ein sichtbares fluoreszierendes Markierungssignal exprimiert.

In diesem Experiment exprimiert die transgene Linie GFP unter Kontrolle des neurogenen N-Promotors. Tauen Sie eine Aliquotprobe von 5 % Dextran-konjugiertem abgeschirmtem Fluorescein in 0,2 molarer Kaliumchloridlösung auf Eis auf. Verdünnen Sie das abgeschirmte Fluorescein in 0,2 molarer Kaliumchloridlösung auf eine Endkonzentration von 1 %. Bewahren Sie das Fluorescein auf Eis auf und schützen Sie es vor Licht. Lassen Sie die Zebrafisch-Kreuzungen paaren, sammeln Sie die befruchteten Eier unmittelbar nach der Ablage und spülen Sie sie gemäß der Beschreibung im Text ab. Verwenden Sie eine Plastikpipette, um Embryonen im Ein-Zell-Stadium unter einem Stereomikroskop auf eine Injektionsplatte mit 1 % Agarose zu überführen, die zuvor mit frischem E3-Medium bedeckt wurde.

Verwenden Sie die Pipette, um die Embryonen in den Injektionsrillen auszurichten. Brechen Sie die Spitze einer kapillaren Injektionsnadel ab, die zu einer langen Spitze gezogen wurde. Füllen Sie die Nadel mit Hilfe einer Mikrolader-Spitze von hinten mit etwa einem Mikroliter 1% caged Fluorescein auf.

Platzieren Sie die beladene Nadel in einem Mikromanipulator, der an einen pneumatischen Mikroinjektor angeschlossen ist. Injizieren Sie jeweils zwei bis drei Nanoliter verkapseltes Fluorescein in das Zytoplasma jeder Embryozelle. Injizieren Sie pro Experiment mindestens 50 Embryonen.

Überführen Sie die injizierten Embryonen in eine Petrischale mit frischem E3-Medium und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei 28,5 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Fügen Sie 0,1 % Phenylthiourea zu den Embryonen nach 24 Stunden hinzu, um die Pigmentierung zu hemmen, und bereiten Sie die Embryonen für die Einbettung vor. Beschichten Sie 15 bis 20 60-mm-Petrischalen mit einer dünnen Schicht aus 1 % Agarose, gelöst in frischem E2-Medium, sobald die Agarose erstarrt ist. Füllen Sie die Schale unter einem Stereomikroskop mit E2-Medium auf.

Verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um injizierte Embryonen auf beschichteten Platten aufzutragen. Vermeiden Sie es, die Embryonen Luft auszusetzen. Halten Sie eine Portion 2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Wasser bereit.

In einem Wärmeblock bei 72 Grad Celsius. Überführen Sie mit einer feinpolierten Pasteurpipette ein beschichtetes Embryo in etwa 150 Mikroliter Medium in eine 60 Millimeter Petrischale. Geben Sie eine ähnliche Menge 2 % Agarose neben das Embryo und mischen Sie die beiden Tropfen schnell miteinander, um einen homogenen 1 % Agarose-Tropfen zu erhalten.

Orientieren Sie das Embryo so, dass die dorsale Seite der Objektivlinse zugewandt ist. Lassen Sie das Aros erstarren und tauchen Sie das eingebettete Embryo in E2-Medium ein. Stellen Sie das frisch montierte Embryo auf einen Plattenträger unter ein Zwei-Photonen-Mikroskop, das mit einem Breitband-Turntable-Laser ausgestattet ist.

Bevor Sie mit dem Fotoaktivierungsprozess beginnen, nehmen Sie eine Bildserie vom ventralsten bis zum dorsalsten Rand des exprimierenden Gewebes bei 860 Nanometern und Raum erfasst. Die Bilder sind im Z-Plan sechs Mikrometer voneinander entfernt. Wählen Sie die Ziel-Ebene im Z-Plan für die Fotoaktivierung aus und fokussieren Sie sie unter Verwendung von GFP als Orientierungspunkt.

Suchen Sie den interessierenden Bereich. Nehmen Sie ein einzelnes Bild bei 860 Nanometern auf und lassen Sie es zur korrekten Ausrichtung in einem separaten Fenster geöffnet. Es ist entscheidend, dass der Laser bei 720 Nanometern im modengekoppelten Zustand ist, bevor das Bearbeitungs-Bleach-Menü geöffnet wird.

Verwenden Sie das bei 860 Nanometern aufgenommene Bild, um den interessierenden Bereich oder ROI für die Photoaktivierung zu definieren. Passen Sie im Fenster „Bleach bearbeiten“ die relative Laserleistung, die Anzahl der Iterationen und die Abtastgeschwindigkeit an. Drücken Sie zum Durchführen der Photoaktivierung die Taste „Bleach“, wenn der Laser gestoppt hat, wechseln Sie anschließend zurück zu 860 Nanometern und nehmen Sie ein Einzelebenen-Bild auf, um die Intensität des resultierenden photoaktivierten Materials zu bewerten.

Sammeln Sie einen Bildstapel, um die zsan oder Dicke der aktivierten Domäne zu bewerten. Auf diese Weise lässt sich die Laserintensität und Belichtungsdauer empirisch bestimmen. Aktivieren Sie für eine optimale Photoaktivierung jedes Klon oder Kreuzphoto alle verbleibenden Embryonen für das Experiment.

Unter Verwendung dieser Bedingungen die befestigten, lichtaktivierten Embryonen im Dunkeln bei 28,5 Grad Celsius in E2-Medium, das 0,1 % Phenylthioharnstoff enthält, bis zum gewünschten Entwicklungsstadium aufziehen. Unter einem Stereomikroskop mit einem scharfen Skalpell eine V-förmige Kerbe in die Aros in der Nähe des befestigten Embryos schneiden, wobei die Spitze der Kerbe in Richtung des Embryokopfes zeigt. Ein Paar geschlossener Pinzette an der Spitze der Kerbe platzieren.

Öffnen Sie vorsichtig die Pinzette, um die Aros entlang der Länge des Embryos zu trennen, und lösen Sie den Embryo in das Medium. Nachdem Sie jeden Embryo freigesetzt haben, sammeln Sie ihn mit einer feuerpolierten Pasteurpipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fixieren Sie die Embryos in einem chemischen Abzug drei Stunden lang mit 4 % Formaldehyd.

Bei Raumtemperatur die Dehydrierung, Rehydrierung und Färbung mit alkalischer Phosphatase, konjugiert, anti-Fluorescein, sowie alle zugehörigen Waschschritte gemäß der beigefügten Beschreibung durchführen. 500 Mikroliter gefilterte Fast-Red-Lösung zu den Embryonen geben. Im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren und jede Stunde mit frischer Fast-Red-Färbelösung auffrischen, bis das gewünschte Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erreicht ist.

Beenden Sie die Färbereaktion durch dreimaliges Waschen in PBST je fünf Minuten. Im Abzug fixieren Sie die Färbung 20 Minuten lang in 4 % Formaldehyd. Waschen Sie anschließend zweimal in PBST je fünf Minuten.

Waschen Sie klare Embryonen durch eine Reihe von 25 %, 50 % und 75 % Glycerol-Gradienten in PBS, bis sich jeder Embryo am Boden des Röhrchens abgesetzt hat. Lagern Sie die Embryonen bei vier Grad Celsius, bis sie zur Visualisierung am Mikroskop bereit sind. Um die Embryonen zur Visualisierung zu montieren, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um vier 20-Mikroliter-Tropfen klaren Silikonfetts an den Ecken einer 15-Millimeter-Quadratform auf einen Objektträger aufzutragen.

Legen Sie ein Embryo in etwa 200 Mikroliter 75 % Glycerin zwischen die Fetttropfen. Legen Sie ein Deckglas über das Embryo. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas nach unten, bis die Glycerinlösung vollständig auffüllt.

Der Abstand zwischen den mit Fett montierten Embryonen kann einige Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, bevor eine Visualisierung mittels konfokaler Mikroskopie erfolgt. Diese Aufnahme zeigt einen lebenden Zebrafisch-Embryo, der GFP unter der Kontrolle von Neurogen exprimiert. In einem Promotor, der im Ein-Zell-Stadium mithilfe der vorangehenden Methode mit einem verkapselten Fluorescein-Tracerfarbstoff injiziert wurde, im Stadium von drei bis fünf Somiten.

Ein abgegrenzter Bereich der vier Gehirnanlagen im Embryo wurde mittels Zweiphotonenlaser photoaktiviert, und der freigesetzte fluoreszierende Farbstoff Fluorescein konnte nachgewiesen werden. Nach der Photoaktivierung wurde der Embryo bei 28,5 Grad Celsius inkubiert, und Gehirnzellen, die den freigesetzten Fluorescein enthielten, wurden 24 Stunden nach der Befruchtung durch Anti-Fluorescein-Immunfärbung in Rot verfolgt. Beachten Sie die geringe Anzahl markierter Zellen. Sobald die Photoaktivierungstechnik beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die optimalen Parameter zu kontrollieren, um eine präzise Photoaktivierung mit Einzelzellauflösung zu ermöglichen.