Die Messung der 50% Hämolytische Complement (CH ₅₀) Aktivität von Serum

Bestimmung der 50 % hämolytischen Komplement-CH50-Aktivität von Serum. Sie benötigen eine Pipette, die 200 Mikroliter abgeben kann, und eine, die 1000 Mikroliter abgeben kann, Testserum, das auf Eis aufbewahrt wurde, sensibilisierte Schafs-rote Blutkörperchen, varone gepufferte Salzlösung und destilliertes Wasser, Röhrchen für den Test, Serum- und Röhrchen für die Basislinie sowie für totale Lyse, einen Vortex-Mischer und eine 96-well-Flachbodenplatte. Beschriften Sie die Röhrchen einzeln mit Kontrolle und der endgültigen Verdünnung. In diesem Fall beginnen wir mit einer Verdünnung von 1:8.

Fahren Sie mit Verdünnungsschritten im Verhältnis 1:2 fort, die eine Verdünnung von 1:16, 1:32, 1:64 und 1:128 ergeben, und beschriften Sie die verbleibenden Röhrchen mit „blank“ und „Gesamtlyse“. Sobald alle Röhrchen beschriftet sind, können Sie nun mit der Verdünnung Ihres Testserums beginnen. Geben Sie zunächst 300 Mikroliter R-Puffer-Salzlösung in ein frisches Röhrchen.

Überführen Sie nun 100 Mikroliter Serum in 300 Mikroliter R-Pufferlösung. Dadurch erhalten Sie eine 1:4-Anfangsverdünnung. Stellen Sie sicher, dass die Serumprobe gründlich gemischt wird.

Überführen Sie nun 200 Mikroliter PBS-Puffer in die zuvor beschrifteten Röhrchen. Geben Sie außerdem 200 Mikroliter PBS-Puffer zu den beiden Leerproben hinzu, die insgesamt zu den Lysepufferröhrchen gehören. Fügen Sie 200 Mikroliter destilliertes Wasser hinzu, nicht Verona-Puffer-Salzlösung.

Überführen Sie nun 200 Mikroliter des 1:4 verdünnten Serums in das mit 1:8 beschriftete Gefäß. Zuvor haben wir 200 Mikroliter PBS-Puffer in die Serie von Gefäßen mit der Beschriftung 1:8 bis 1:1028 übertragen. Dies führt nun zu einer 1:8-Verdünnung.

Mischen Sie die Probe gründlich und überführen Sie anschließend 200 Mikroliter in das Gefäß, das mit „eins zu 16“ beschriftet ist. Fahren Sie fort, bis die gesamte Reihe von Gefäßen verdünnt wurde. Entsorgen Sie 200 Mikroliter aus der Verdünnung „eins zu 128“, sodass das Endvolumen 200 Mikroliter beträgt.

Die sensibilisierten Schafs-rote Blutkörperchen können sich im Laufe der Zeit abgesetzt haben. Diese müssen durch vorsichtiges mehrmaliges Umstülpen des Röhrchens wieder resuspendiert werden. Nach gründlicher Resuspension werden 200 Mikroliter der sensibilisierten Schafs-Blutkörperchen in jedes der vorbereiteten Röhrchen überführt.

Stellen Sie sicher, dass das Serum gründlich mit den roten Blutkörperchen vermischt wird. Sensibilisierte Schaf-Rote-Blutkörperchen, die dem Blindrohr hinzugefügt werden, ermöglichen die Bestimmung der spontanen Lyse, während Blut, das dem Gesamtlyserohr hinzugefügt wird, die Ermittlung des 100 %-Werts ermöglicht. Verrühren Sie vorsichtig jedes der Röhrchen mit einem Vortex-Mischer, der auf niedriger Stufe eingestellt ist. Stellen Sie die Röhrchen nun in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.

Nach 15 Minuten Inkubation die Röhrchen vorsichtig erneut vortexen und weitere 15 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation die Röhrchen in einen bei vier Grad Celsius eingestellten Zentrifugenapparat überführen und bei 1500 ×g fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Röhrchen vorsichtig entnehmen und in einen geeigneten Halter stellen. Hier sehen Sie das Pellet aus roten Blutkörperchen, während die SNA rot erscheint.

Aufgrund der Freisetzung von Hämoglobin werden 100 µL destilliertes Wasser in die erforderliche Anzahl von Vertiefungen einer 96-Loch-Platte mit flachem Boden gegeben. Unter Vorsicht, das Pellet nicht mitzuübertragen, werden 100 µL der Überstand-Supernatant in eine geeignete Vertiefung der 96-Loch-Platte überführt. Nachdem alle Proben auf die Platte aufgetragen wurden, wird die Absorption mit einem Platten-Spektrophotometer bei 540 nm gemessen.

Hier liegen die Rohabsorptionsdaten für die beiden Replikate A1 und B1 vor. Bezug genommen wird auf die 1:8-Verdünnung.

Dann haben wir die Daten für 1 zu 16, 1 zu 32, 1 zu 64 und 1 zu 128. A6 und B6 sind die Blindprobe, während A7 und B7 die totale Lyse darstellen.

Nachdem die Daten gesammelt wurden, müssen Sie die mittlere Absorption für jede Probe im Duplikat berechnen. Anschließend subtrahieren Sie die Blindabsorption, also die spontane Lyse, von allen Proben. Sobald alle Daten erhoben wurden, können Sie nun den Prozentsatz der Lyse für jede Verdünnung anhand der folgenden Formel berechnen.

Nachdem alle Daten berechnet wurden, tragen Sie die prozentuale Lyse auf der vertikalen Achse gegen die Serumverdünnung auf der horizontalen Achse auf. Der resultierende Graph kann anschließend verwendet werden, um die Serumverdünnung zu berechnen, die erforderlich ist, um 50 % der sensibilisierten Schafblutkörperchen zu lysieren. Dieser Graph zeigt die prozentuale Lyse in Abhängigkeit von der Verdünnungsstufe des Serums.

Eine Linie kann dann von der 50 %-Lyse gezogen werden, bis sie die Kurve schneidet. An der Stelle, an der die Kurve geschnitten wird, wird eine vertikale Linie nach unten zur horizontalen Achse gezogen. Dieser Wert stellt die Faltverdünnung dar, auf die das Serum verdünnt werden muss, um 50 % Lyse zu gewährleisten. Beim Vergleich zweier Serumproben, um festzustellen, ob ein Unterschied im CH 50 besteht, kann die Verdünnung, die 50 % Lyse liefert, als Maß verwendet werden.