Name: Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie FACS-gestützte zelltypspezifische Expressionsanalyse zur Untersuchung von Phytochrom-Antworten in Arabidopsis thaliana. Diese Methode ermöglicht die Isolierung spezifischer Zelltypen für genetische Analysen.

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Die Arbeit in der Montgomery-Labor auf Phytochrom Reaktionen in Pflanzen wird durch die National Science Foundation (Grant No. MCB-0919100 bis BLM) und der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of unterstützt Energy (Grant No. DE FG02 91ER20021 zu BLM). Wir danken Melissa Whitaker für die technische Unterstützung während der Dreharbeiten und kritische Durchsicht des Manuskripts, Stephanie Costigan für experimentelle Mitarbeit, Dr. Louis King für die Unterstützung bei der Entwicklung und Optimierung Fluorescence-Activated Cell Sorting Protokolle für Arabidopsis Protoplasten Sortierung und Dr. Melinda Rahmen für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir bedanken uns bei Marlene Cameron für die grafische Gestaltung Unterstützung und Karen Vogel für redaktionelle Unterstützung.

1. Plant Growth <ol><li> Bestätigt UAS-BVR X GAL4-GFP-Enhancer trap line isoliert als 4 beschrieben (Zusammenfassung siehe Abb.. 1) und Wildtyp-oder elterlichen Linien sind auf den Boden gesät, dh ~ 2000 sterilisierten Samen pro Zeile. </li><li> Pflanzen sind für 5 Wochen auf den Boden unter weißer Beleuchtung von 100 μmolm -2 s -1 gewachsen bei 22 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit. </li></ol> 2. Blatt Protoplastenisolierung (angepasst von Denecke und Vitale 9) <ol><li> Zur Isolierung Protoplasten, bereiten TEX-Puffer. Für 1 Liter TEX-Puffer, wiegen Sie die folgenden Komponenten: 3,1 g Gamborg die B5-Salze, 0,5 g 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES, 2,56 mM), 0,75 g Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g Ammoniumnitrat (NH 4 NO 3, 3,12 mM), auflösen 136,9 g Saccharose (0,4 Mio.). Bauteile komplett in ~ 900 ml entionisiertem, destilliertem Wasser (ddH 2 O) und bringen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit 1 M KOH. Bringen Endvolumen von 1 Liter und Filter sterilisieren mit einem 0,2 &amp;mgr; Flaschenaufsatz-Filter angeschlossen an eine Vakuumpumpe. </li><li> Sammeln Sie grüne, gesunde Blätter von Pflanzen (~ 250 ml der Blätter lose in ein Becherglas verpackt) und spülen Sie mit ~ 40 ml ddH 2 O 4-mal, gefolgt von Spülen zweimal mit sterilem ddH 2 O. Mit einem Nr. 20 Skalpell schneiden Blätter in feine Streifen schneiden und spalten Gewebe zu gleichen Teilen in zwei 50 ml sterile Kunststoffröhrchen. Bereiten 1x Blatt Verdauung durch Zugabe von 5 ml Aliquot 10x Blatt Verdauung Stammlösung (10x Blatt Verdauung Stammlösung: Man löst 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v Cellulase "Onozuka" R-10 in TEX-Puffer, Filter sterilisieren mit 0,2 um Filter und frieren 5 ml Aliquots bei -80 ° C) auf 45 ml frisches TEX-Puffer. Add ~ 25 ml 1x Blatt Verdauung Mischung pro 50 ml Tube für alle Blattgewebe zu decken. </li><li> Vacuum infiltrieren Blattgewebe in Verdaumischung in offenen Röhren für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Vakuum-Exsikkator an eine Wasserpumpe mit 3-hr Inkubation bei Raumtemperatur auf einer Wippe unter leichtem Schütteln folgte. Capped Rohre mit Blattgewebe in 1x Blatt Verdauung Mix sind in Alufolie aufbewahrt während dieses Prozesses umwickelt, um Lichteinfall zu verhindern. </li><li> Nach 3 Stunden, erhöhen Sie die Wippe Geschwindigkeit für ca. 2 Minuten bis Protoplasten freizugeben. Filter das rohe Protoplastensuspension durch zwei Schichten sterile Gaze, um Ablagerungen zu entfernen und das Filtrat in ein steriles Becherglas. Filter das Filtrat durch einen sterilen 100-um Nylon-Mesh in eine sterile Petrischale. Sammeln Sie die Durchströmung und übertragen sie auf eine neue sterile 50 ml-Tube. Verwenden Sie ca. 15-20 ml frischem TEX Puffer, um die sterile Petrischale waschen und sammeln keine Protoplasten an der Oberfläche haften. </li><li> Centrifuge die Durchströmung mit einem Swing-Eimer Rotor bei 100xg bei 10 ° C für 15 min (Acceleration 6, Verzögerung 0). </li><li> Nehmen Sie ~ 25 bis 30 ml der Flüssigkeit unterhalb der schwimmenden Protoplasten Schicht, die Rest-und pelletiert Schmutz enthält, mit einer sterilen 9 "Glas Pasteur Pipette an einer Schlauchpumpe, ohne die schwimmenden Protoplasten Schicht und verlassen ~ 10 bis 15 ml Volumen. </li><li> Add frischen TEX-Puffer auf ein Endvolumen von 40 ml, während sanft Resuspendieren des Protoplasten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,5 bis 2,7 zweimal so viel Zelltrümmer wie möglich zu entfernen. Die Zentrifugation der Zeit ist, 10 Minuten in der ersten Wiederholung und 5 Minuten in der letzten Wiederholung reduziert. </li><li> Absaugen schwimmenden Protoplasten mit einem Schnitt, sterile 1 ml Transferpipette in ein neues 15 ml Tube. Gehen Sie direkt zu sortieren oder zu speichern in Dunkeln bis zu 2 Stunden bei 4 ° C bis zur Sortierung. </li></ol> 3. Protoplast Sortierung nach Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Vor dem Sortieren untersuchen Protoplasten durch konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) mit einem 488-nm-Laser für die Anregung zu Protoplasten Integrität und die Anwesenheit von GFP-Fluoreszenz in den Protoplasten Pool zu bestätigen. Minimal Schutt ist notwendig, um Verstopfungen zu vermeiden die FACS-Sortierung Düse. </li><li> Sortieren isolierten Protoplasten in TEX-Puffer über FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) mit einer 200-um Düse auf der Makro-Art Kopf Ereignisraten zwischen 6.000 und 15.000, mit einem Systemdruck von etwa 9 psi nach einem adaptierten Protokoll 10. </li><li> Wild-Typ nicht-GFP Protoplasten werden verwendet, um die Autofluoreszenz Schwellenwerte zu ermitteln. </li><li> Um GFP-positive Protoplasten, Art-Zellen mit einem luftgekühlten Argonlaser (Spectra Physics Modell 177, Newport Corporation, Irvine, CA) betrieben bei 100 mW auf einer 488-nm Argon Linie GFP-Fluoreszenz zu identifizieren mit einem 530/30 Band sammeln Pass-Filter. </li><li> Nach der Sammlung von GFP-positive Protoplasten untersuchen sortiert Protoplasten durch CLSM wie in Schritt 3.1. </li><li> Auszug Gesamt-RNA aus sortierten Protoplasten unter Verwendung eines Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA kann dann für die Hybridisierung hergestellt werden, wie in Affymetrix GeneChip Expr beschriebenITZUNG Analysis Technical Manual und dann hybridisiert ATH1 Arabidopsis Affymetrix Whole Genome-Arrays. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wir erkannten eine beträchtliche Anzahl von GFP-positive Zellen im GFP-Kanal durch FACS (Abb. 2). In Optimierung Tests unter Verwendung von GFP-Enhancer-trap Eltern, die konstitutiv GFP-exprimierenden Linie, J0571, angezeigt ~ 17% auf 24% GFP-positive Protoplasten, während die Linie mit vaskulären und dermalen Ausdruck, J1071, hatte ~ 1,4% GFP-positive Protoplasten (Tabelle 1). Sortieren von 3 x 500 ul (~ 1,5 ml insgesamt Protoplastensuspension) von J0571 Protoplasten für 1 h gab ~ 100.000 GFP-positive Protoplasten. Sortieren von 3 x 500 ul (~ 1,5 ml insgesamt Protoplastensuspension) von J1071 Protoplasten für 1,5 h gab ~ 3.000 GFP-positive Protoplasten. Konfokale Bilder zeigte eine sehr hohe Ausbeute an Protoplasten für J0571 und J1071 Proben vor der Sortierung wurde (Abb. 3C und 3E) durchgeführt, und die sortierten Fraktionen enthielten nur helle GFP-Fluoreszenz-Protoplasten (Abb. 3G und Daten nicht gezeigt). Dieser Befund bestätigt, dass intakte GFP-positive Protoplasten via FACS sortiert werden können. Die nicht-GFP Protoplasten können auch sortiert und gesammelt in einem separaten Kanal. Die nicht-GFP Protoplasten dienen als ideales negative Kontrolle für die anschließende Microarray-Analysen auf die spezifischen Veränderungen der Genexpression bei der Reduktion von holophytochrome Ebenen zu erkennen. RNA-Extraktion aus isolierten Protoplasten (1 ml) ergibt RNA in ausreichender Menge für den Nachweis von fluorospectrometry (Abb. 4). Isolierte RNA wurde anhand einer NanoDrop Instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) und quantifiziert NanoDrop 3.7.1 RNA-Quantifizierung Software. RNA-Ausbeuten aus C24-Wildtyp-Protoplasten oder FACS-sortiert, überschritten GFP-positive enhancer trap Protoplasten die mindestens 20 ng für den Einsatz in brauchte vorsortiert RNA-Labeling-Assays für die Microarray-(Tabelle 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer-Trap-Linie </td><td> % Der GFP-positive Protoplasten </td><td> Anzahl der sortierten GFP Protoplasten </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% ~ 24,06% </td><td> 26.400 ~ 36.000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1.000 ~ 1.300 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Anteil der GFP-positive Protoplasten von zwei Enhancer-trap-Linien vor der Sortierung und der Anzahl der GFP-positive Protoplasten, indem Sie 500 ul der Protoplastensuspension durch die Fluorescence Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD) gesammelt. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Pflanzenlinie </td><td> RNA-Ausbeute (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486,5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Von RNA-Isolierung aus Protoplasten Yield. RNA wurde aus vorsortierten C24-Wildtyp-oder sortiert GFP-positive Protoplasten von zwei enhancer trap Linien isoliert und quantifiziert. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. GAL4-Enhancer-trap-basierte Induktion von Biliverdin-Reduktase (BVR) die Expression in transgenen Arabidopsis thaliana Pflanzen. (A). Ein einzelner aus einer Bibliothek von GAL4-basierten Enhancer-trap-Linien, die eine GAL4-responsive GFP-Markergen enthält, ausgewählt werden kann mit einer Zeile mit einem GAL4-responsive Zielgen um die Expression des Zielgens in induzieren GAL4-enthaltenden Zellen markiert überquert werden von GFP-Fluoreszenz. Basierend auf einer Figur aus Dr. Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Herstellung von Phytochrom-Chromophor, Phytochromobilin (PΦB) und holophytochrome in übergeordneten Linien. (C) links, Reduktion von Biliverdin IXα (BV IXα) und PΦB von Biliverdin-Reduktase (BVR) Aktivität BR und PΦR jeweils. BVR-Aktivität führt zu Erschöpfung der PΦB und führt zu einer Reduktion bei der Herstellung von photoaktiven holophytochrome. Richtig, wird die Reaktion durch BVR katalysierten gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Erwerb Dot-Plots. Vergleich von Protoplasten Zellsortierung für C24-Wildtyp (A), J0571 (B) und J1071 (C). (A) Erwerb Dot-Plot von nicht-fluoreszierenden GFP C24-Wildtyp-Protoplasten durch ein 488-nm Argon-Laser angeregt und zur Autofluoreszenz Schwelle zu bestimmen. (B) und (C) Erwerb Dot-Plots zeigen Anteile von Protoplasten, dass GFP positive Reaktion auf Anregung durch einen 488-nm-Laser sind. R3 Sortierweichen in B und C begrenzen die GFP-positive Ziele, die durch Fluorescence-Activated Cell Sorter sortiert wurden (FACSVantage, BD) und gesammelt. Red-Kanal zeigt verte für Chlorophyll-Autofluoreszenz von Protoplasten und grünen Kanal zeigt Werte für GFP-Fluoreszenz. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Konfokale Mikroskopie von pflanzlichen Protoplasten für die Zell-Sortierung eingesetzt. Konfokalen Laser-Scans von Protoplasten vor (A, C, E) und nach (G) Sortierung über Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS). B, D, F und H sind DIC Bilder. Protoplasten von C24-Wildtyp (A, B), J1071 (C, D) und J0571 (E, F, G, H) gezeigt. Und Autofluoreszenz (LP 650 nm) aus Anregung mit einem 488-nm-Laser erzielt - Bilder C, E und G sind Bilder von GFP-Fluoreszenz (575 nm BP 505 nm) zusammengeführt. A bis H sind durchschnittlich 4 Scans unter 63x Öl. Bar = 10 pm. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Quantifizierung von RNA aus Protoplasten durch fluorospectrometry isoliert. RNA von (A) C24 Wildtyp (B) J0571 und (C) J1071 extrahiert. A zeigt RNA für vorsortierte Wildtyp-Protoplasten. B und C zeigen RNA aus GFP-positive Protoplasten durch Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) sortiert. RNA-Quantifizierung Software, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

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</ol>

Gene Expression Profiling durch Mikroarrays (1) hat angedeutet, dass mehr als 30% der Gene in Arabidopsis-Keimlinge Licht reguliert 11 sind und (2) hat eine große Gruppe von Genen, Licht Signaltransduktionsproteine ​​in der Phytochrom Signalkaskade 12, 13 beteiligten identifiziert . Solche Experimente deuten darauf hin, dass Licht eine schnelle und langfristige Veränderungen in der Genexpression induziert. Jeder Pool von Phytochrome kann die Kontrolle nur eine Teilmenge der Entwicklungs-und Anpassu...

<table><tbody><tr><td>Anti-BVR-Antikörper</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase &amp;#8220;Onozuka&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s B5 Basalsalzgemisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES, geringer Feuchtegehalt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Murashige-und-Skoog-Salze</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Phytablend</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant Minikit</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung tissue-und organ-spezifische phytochrom antworten mit facs-gestützte zelltypspezifisch expression profiling in arabidopsis thaliana</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Licht vermittelt eine Reihe von Entwicklungs-und adaptive Prozesse über den gesamten Lebenszyklus einer Anlage. Pflanzen nutzen Licht absorbierende Moleküle, so genannte Photorezeptoren zu spüren und sich an Licht. Die rot / Dunkelrot-Licht-absorbierenden Photorezeptoren Phytochrom wurden umfassend untersucht. Phytochrome existieren als eine Familie von Proteinen mit unterschiedlichen und sich überschneidenden Funktionen in allen höheren Pflanzen, in denen sie studiert haben,<sup&gt; 1</sup&gt;. Phytochrom-vermittelten Reaktionen Licht, das von Keimung der Samen durch blühende und Seneszenz-Bereich, sind oft auf bestimmte pflanzliche Gewebe oder Organen lokalisiert<sup&gt; 2</sup&gt;. Trotz der Entdeckung und Aufklärung der individuellen und redundant Phytochrom Funktionen durch Mutationsanalysen, aussagekräftige Berichte auf unterschiedlichen Seiten des photoperception und die molekularen Mechanismen der lokalen Pools von Phytochrome, die vermitteln, räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen begrenzt sind. Wir haben Experimente auf der Hypothese, dass bestimmte Websites von Phytochrom photoperception regulieren Gewebe-und Organ-spezifische Aspekte der Photomorphogenese und die lokalisierte Phytochrom Pools engagieren verschiedene Teilmengen von nachgeschalteten Zielgene in Zell-Zell-Signal basiert. Wir entwickelten ein biochemischer Ansatz zur selektiven Reduktion funktioneller Phytochrome in einem Organ-oder Gewebe-spezifische Weise in transgenen Pflanzen. Unsere Untersuchungen basieren auf einem bipartiten Enhancer-trap Ansatz, der in Transaktivierung der Expression eines Gens unter der Kontrolle des Upstream Activation Sequence (UAS) Element Ergebnisse der Transkriptionsaktivator GAL4 Basis<sup&gt; 3</sup&gt;. Das Biliverdin-Reduktase (<em&gt; BVR</em&gt;)-Gen unter die Kontrolle der UAS wird stillschweigend in der Abwesenheit von GAL4 Transaktivierung in der FH-BVR Elternteil aufrechterhalten<sup&gt; 4</sup&gt;. Genetische Kreuzungen zwischen einem UAS-BVR transgene Linie und ein GAL4-GFP-Enhancer trap line führen zu spezifischen Ausdruck der<em&gt; BVR</em&gt; Gen in Zellen gekennzeichnet durch<em&gt; GFP</em&gt; Ausdruck<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR Akkumulation in Arabidopsis-Pflanzen führt Phytochrom-Chromophor-Mangel<em&gt; In planta</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. So sind transgene Pflanzen, die wir haben, zeigen GAL4-abhängige Aktivierung der produzierten<em&gt; BVR</em&gt; Gen, was in der biochemischen Inaktivierung von Phytochrom sowie GAL4-abhängigen<em&gt; GFP</em&gt; Ausdruck. Photobiologische und molekulargenetische Analysen<em&gt; BVR</em&gt; Transgenen Linien sind nachgiebig Einblick in Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom-vermittelten Reaktionen, die mit entsprechenden Stellen des photoperception in Verbindung gebracht wurden<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) von GFP-positive, Enhancer-trap-induzierte<em&gt; BVR</em&gt;-Exprimierenden Pflanzenprotoplasten mit Zelltyp-spezifische Gene Expression Profiling durch Microarray-Analyse gekoppelt wird verwendet, um vermeintliche nachgeschaltete Zielgene bei der Vermittlung von räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind. Diese Forschung baut unser Verständnis von Seiten der Lichtwahrnehmung, die Mechanismen, durch die verschiedenen Gewebe oder Organe in Licht-regulierte Pflanzenwachstums und der Entwicklung zusammenarbeiten und die Weiterentwicklung der molekularen Zergliederung komplexer Phytochrom-vermittelten Zell-Zell-Signalkaskaden.

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Licht vermittelt eine Reihe von Entwicklungs- und Anpassungsprozessen während des gesamten Lebenszyklus einer Pflanze. Pflanzen nutzen lichtabsorbierende Moleküle, sogenannte ...

Um Phytochromantworten in spezifischen Pflanzenzelltypen zu untersuchen. GAL4GFP-Enhancertrap- und UAS-BVR-transgene Linien werden gekreuzt, um phytochromdefiziente Pflanzen zu erzeugen. UAS-BVR wird mit GAL4GFP gekreuzt, und Protoplasten aus den Nachkommenblättern werden isoliert.Anschließend werden die Protoplasten mithilfe von FACS sortiert, um GFP-negative und GFP-positive Protoplasten in separaten Proben zu isolieren; die isolierten Protoplasten werden mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Um die Sammlung GFP-positiver Protoplasten zu bestätigen, wird RNA aus den Protoplasten extrahiert und spektral analysiert. Hallo, ich bin Sanka Pivar aus dem Labor von BARDA Montgomery am Department of Energy Plant Research Laboratory der Michigan State University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Blattprotoplasten aus einem atopischen ANA für die fluoreszenzunterstützte Zellsortierung und die zelltypspezifische Genexpressionsanalyse. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um gewebe- und organspezifische, phytochromabhängige Reaktionen zu untersuchen. Beginnen wir also.Die in diesem Verfahren verwendete Arabidopsis-ANA-Linie wurde mittels

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Ein Verfahren zur Isolierung von spezifischen Zelltypen aus pflanzlichem Material nachgewiesen ist. Diese Technik bedient sich transgene Marker exprimieren fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Zelltypen, Zell-Dissoziation und Fluorescence Activated Cell Sorting. Zusätzlich wird ein Wachstum Setup hier erleichtert Behandlung von...

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

Wir haben eine Technik, um Protein-Protein-Interaktionen in Anlage-Test entwickelt. Ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) ist in zwei nicht überlappende Fragmente aufgeteilt. Jedes Fragment wird in-frame, ein Gen von Interesse via Gateway-System geklont, wodurch Expression von Fusionsproteinen. Rekonstitution der YFP-Signal erfolgt nur, wenn der gerichtlichen Untersuchung Proteinen interagieren.

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

Gibberellin Wahrnehmung Sensor 1 (GPS1) ist der erste Förster Resonanz Energie Transfer-basierten Biosensor zur Messung der zellulären Ebenen der Gibberellin Phytohormone mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung. Dieses Protokoll berichtet über die Methode zu visualisieren und zelluläre Gibberellin Ebenen mit Hilfe der genetisch codierten nlsGPS1 Biosensor in Arabidopsis Hypocotyle und Wurzelspitzen zu quantifizieren.

Visualisierung zellulären Gibberellin-Ebenen mit NlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Lernen Sie FACS-gestützte zelltypspezifische Expressionsanalyse zur Untersuchung von Phytochrom-Antworten in Arabidopsis thaliana. Diese Methode ermöglicht die Isolierung spezifischer Zelltypen für genetische Analysen.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

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