Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Um Phytochromantworten in spezifischen Pflanzenzelltypen zu untersuchen. GAL4GFP-Enhancertrap- und UAS-BVR-transgene Linien werden gekreuzt, um phytochromdefiziente Pflanzen zu erzeugen. UAS-BVR wird mit GAL4GFP gekreuzt, und Protoplasten aus den Nachkommenblättern werden isoliert.

Anschließend werden die Protoplasten mithilfe von FACS sortiert, um GFP-negative und GFP-positive Protoplasten in separaten Proben zu isolieren; die isolierten Protoplasten werden mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie analysiert. Um die Sammlung GFP-positiver Protoplasten zu bestätigen, wird RNA aus den Protoplasten extrahiert und spektral analysiert. Hallo, ich bin Sanka Pivar aus dem Labor von BARDA Montgomery am Department of Energy Plant Research Laboratory der Michigan State University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung von Blattprotoplasten aus einem atopischen ANA für die fluoreszenzunterstützte Zellsortierung und die zelltypspezifische Genexpressionsanalyse. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um gewebe- und organspezifische, phytochromabhängige Reaktionen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Die in diesem Verfahren verwendete Arabidopsis-ANA-Linie wurde mittels eines bipartiten Enhancer-Trap-Ansatzes erzeugt. Ein Elternteil stammt aus einer Bibliothek von Enhancer-Trap-Linien mit unterschiedlichen Mustern der gal- oder Expression. Elternteil eins exprimiert außerdem GFP unter der Kontrolle einer upstreamen Aktivierungssequenz (UAS).

Kurz gesagt, aktiviert der Transkriptionsfaktor GA vier jedes Gen, das unter Kontrolle des UAS steht. In der Elternlinie eins aktiviert GA vier GFP. Eltern eins wurde mit Eltern zwei gekreuzt, in Eltern zwei steht das BVR-Gen unter Kontrolle von GAL vier mittels UAS.

Die aus dem Kreuzungsvorgang hervorgehende Linie ist U-A-S-B-V-R kreuzt G 4G FP. In den Elternlinien verläuft die Biosynthese des Phytochrom-Chromophors über ein LA von Häm zu Biliverdin, abgekürzt bv. Doch in der Nachkommenschaft blockiert das Genprodukt von BVR die Biogenese des Phytochrom-Chromophors, indem es das BV-Vorläufermolekül reduziert. Diese Enhancer-Trap-BVR-Nachkommenschaftslinie wurde bestätigt und kann verwendet werden, um zu untersuchen, wie eine Verringerung der aktiven Phytochromkonzentration unterschiedliche Pflanzengewebe beeinflusst.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Boden und Töpfe zur Pflanzenkultivierung vorbereiten, um Blattprotoplasten zu gewinnen. Sterilisieren Sie etwa 2000 Samen pro Probe und Experiment auf Boden in Töpfen. Wasser wird in die Unterseite des Tabletts mit den Töpfen gegeben, und das gesamte Tablett wird mit Frischhaltefolie abgedeckt.

Züchten Sie die Pflanzen fünf Wochen lang unter weißer Beleuchtung bei 22 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit. Nach den ersten fünf bis sechs Tagen wird die Keimung der Samen bestätigt und die Plastikfolie wird von der Schale entfernt. Um Protoplasten zu isolieren, bereiten Sie zunächst Puffer TEX vor; für einen Liter Puffer wiegen Sie GA's B fünf Salze MES, Calciumchlorid, Ammoniumnitrat und Saccharose ab.

Lösen Sie die Bestandteile vollständig in etwa 900 Millilitern deionisiertem destilliertem Wasser, abgekürzt DD H2O, auf und stellen Sie den pH-Wert mit einmolarer KOH auf 5,7 ein. Anschließend wird das Endvolumen auf einen Liter aufgefüllt und das Gemisch filtratsterilisiert.

Sammeln Sie anschließend grüne, gesunde Blätter von den Pflanzen. Sammeln Sie etwa 250 Milliliter locker in einem Becher gefüllte Blätter. Spülen Sie die Blätter mit 40 Millilitern ab.

Mehrfaches Waschen mit DD-H2O, gefolgt von zwei Spülgängen mit steriler DD-H2O unter Verwendung eines Skalpells der Größe 20. Die Blätter in dünne Streifen schneiden und das Gewebe gleichmäßig auf zwei sterile 50-mL-Kunststoffröhrchen verteilen. Die Verdauungslösung für die Blätter (1 x) wird hergestellt, indem ein 5-mL-Aliquot einer 10 x-Stammlösung, die durch Auflösen von 2 % (Gewicht pro Volumen) MazE R10 und 4 % (Gewicht pro Volumen) Cellulase Onozuka R10 in TEX-Puffer hergestellt wurde, mit 45 mL frischem TEX-Puffer verdünnt wird.

Fügen Sie etwa 25 Milliliter einer x Blattdigestion hinzu. Mischen Sie die Blattstreifen in jedem Reagenzglas, sodass das gesamte Blattgewebe bedeckt ist. Fahren Sie mit dem Vakuum fort und infiltrieren Sie das Blattgewebe in der Digestion.

Mischen Sie in offenen Röhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Vakuum-Exsikkators, der an eine Wasserstrahlpumpe angeschlossen ist. Bewahren Sie die Röhrchen mit dem Blattgewebe und der Blattverdauungslösung in Aluminiumfolie eingewickelt auf, um eine Lichteinwirkung zu vermeiden. Anschließend erfolgt eine dreistündige Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Rüttler mit sanftem Schütteln.

Nach drei Stunden die Schüttelgeschwindigkeit für zwei Minuten erhöhen, um die Protoplasten freizusetzen. Die grobe Protoplastensuspension durch zwei Lagen steriler Mullbinde filtrieren, um Abris zu entfernen, und das Filtrat in einem sterilen Glasbecher auffangen. Das Filtrat durch ein steriles Nylonnetz mit 100 Mikrometer Porenweite in eine sterile Petrischale filtrieren.

Sammlen Sie den Durchlauf und überführen Sie ihn in ein neues steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie etwa 15 bis Milliliter frischen TEX-Puffer, um die sterile Petrischale zu waschen, und sammeln Sie dabei eventuelle Protoplasten von der Oberfläche ein. Zentrifugieren Sie den Durchlauf bei 100 × g und 10 °C für 15 Minuten unter Verwendung einer Schwenkkopfzentrifuge mit einer Beschleunigung von sechs und einer Verzögerung von null, sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist.

Verwenden Sie eine sterile neun Zoll lange Glas-Pasteurpipette, die an eine peristaltische Pumpe angeschlossen ist, um etwa 25 bis 30 Milliliter der Flüssigkeit unterhalb der schwimmenden Protoplastenschicht zu entfernen, die residuelle und pelletierte Rückstände enthält, ohne die schwimmende Protoplastenschicht zu stören, wobei etwa 10 bis 50 Milliliter verbleiben. Nach dem Entfernen der pelletierten Rückstände frischen TEX-Puffer auf ein Endvolumen von 40 Milliliter hinzufügen. Während die Protoplasten vorsichtig resuspendiert werden, die Entfernung der Rückstände und die erneute Resuspension der verbleibenden schwimmenden Protoplasten wiederholen.

Noch zweimal, um so viel zelluläres D-Trümmermaterial wie möglich zu entfernen. Die Zentrifugationszeit wird bei der ersten Wiederholung auf 10 Minuten und bei der letzten Wiederholung auf fünf Minuten verkürzt. Verwenden Sie abschließend eine sterile Ein-Milliliter-Transferpipette, um die schwimmenden Protoplasten abzusaugen und in ein neues 15-Milliliter-Gefäß zu überführen.

Fortfahren Sie direkt mit der Sortierung, bevor die Sortierung erfolgt. Untersuchen Sie die Protoplasten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie oder kurz CLSM unter Verwendung eines 488-Nanometer-Lasers zur Anregung, um die Integrität der Protoplasten und das Vorhandensein von GFP-Fluoreszenz in der Protoplasten-Pool zu bestätigen. Minimale Mengen an Tagesschmutz sind erforderlich, um ein Verstopfen der Sortierdüse zu vermeiden; sortieren Sie isolierte PROTOPLASTEN in TEX-Puffer mittels Fax.

Unter Verwendung einer 200-Mikrometer-Düse an einem Makrosortierkopf bei Ereignisraten zwischen 6.000 und 15.000 und einem Systemdruck von etwa neun PSI gemäß einem angepassten Protokoll, verwenden Sie Wildtyp-PROTOKLASTEN ohne GFP, um die Autofluoreszenzschwellenwerte zur Sammlung von GFP-positiven Protoplasten zu bestimmen, wobei eine mit Luft gekühlte Argonne-Laservorrichtung verwendet wird, die bei 100 Milliwatt an einer 488-Nanometer-Argonlinie betrieben wird. Zur Identifizierung der GFP-Fluoreszenz verwenden Sie einen 530/30-Bandpassfilter, nachdem die GFP-positiven Protoplasten gesammelt wurden. Untersuchen Sie die sortierten Protoplasten erneut wie zuvor vor Beginn der Sortierung unter dem Mikroskop zur Expressionsanalyse.

Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den sortierten Protoplasten. Anschließend kann cDNA für die Hybridisierung hergestellt werden. Die cDNA wird dann zur Hybridisierung auf TH one OPSYS Ametri-Genomarrays für das gesamte Genom eingesendet.

Hier sind einige repräsentative Ergebnisse der Sortierung von Protoplasten des Wildtyp-Kontrollstamms. Protoplasten weisen keine Signale im GFP-positiven Tor auf. GFP-positive Signale hingegen werden bei Protoplastenproben, die aus GAL4GFP-Linien isoliert wurden, vor der Sortierung nachgewiesen, während Protoplasten, die aus Wildtyp-Pflanzen isoliert wurden, keinerlei GFP-Fluoreszenz in CLSM-Analysen aufweisen.

Während in Protoplastenproben von GAL-4G-FP-Linien nach FACS eine Mischung aus Protoplasten mit und ohne GFP-Fluoreszenz detektiert wird, weist die CLSM-Analyse auf die Isolierung von GFP-positiven PROTOPLASTEN aus einer repräsentativen GAL-4G-FP-Linie hin. RNA ist aus isolierten Protoplasten extrahierbar, und ein Milliliter liefert eine ausreichende Menge an RNAA für den Nachweis mittels Fluorospektrometrie. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Blattprotoplasten aus Atopie-ANA für die fluoreszenzgestützte Zellsortierung und die zelltypspezifische Genexpressionsanalyse isoliert.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sanft mit den Protoplasten umzugehen und ihre Lichtexposition zu begrenzen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.