Mangelhafte PMS2, ERCC1, Ku86, CCOI in Field Mängel bei der Progression zu Darmkrebs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die spezifischen Veränderungen bei DNA-Reparaturproteinen, deren Expression oder die Expression von Proteinen, die mit Apoptose in Zusammenhang stehen, zu bestimmen, die in Bereichen um Darmkrebs herum häufig auftreten und daher vermutlich eine zentrale Rolle bei der Progression zum Darmkrebs spielen. Dies wird erreicht, indem Gewebeproben zunächst in Formalinbehältern gesammelt werden – entweder von kolorektaler Mukosa aus Normalgewebe während einer Koloskopie als Kontrollgewebe oder von kolorektaler Mukosa in der Nähe von Darmkrebs aus Kolonresektionen als Versuchsgewebe – nach einer Fixierung durch Einlegen für vier Stunden. Diese Gewebeproben werden anschließend über Nacht in 70 %igem Alkohol überführt und danach in Paraffinblöcken eingebettet.

Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Gewebeschnitte aus den Blöcken zu schneiden und sie auf Objektträger zu übertragen. Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Immunfärbung der Gewebeschnitte für mögliche Proteine von Interesse mithilfe einer Sequenza-Halterung. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Betrachtung der Gewebeschnitte im Fotomikroskop.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die hohe Expressionsniveaus eines oder mehrerer Proteine in der Kolonschleimhaut ohne lokale Neoplasie sowie eine verminderte Expression dieser Proteine in Felddefekten um Darmkrebs herum zeigen, was auf die Bedeutung ihrer Reduktion beim Fortschreiten zum Darmkrebs hinweist. Beispielsweise zeigt dieses Bild eine braune Färbung, die auf ein hohes Expressionsniveau von E rcc in der Kolonschleimhaut ohne kolorektales Neoplasie hinweist. Dieses nächste Bild zeigt eine braune Färbung, die auf ein hohes Expressionsniveau von PMs, zwei in der Kolonschleimhaut eines Patienten ohne kolorektales Neoplasie hinweist, während ein Bereich der Kolonschleimhaut nahe einem Darmkrebs ein Krypta mit hoher PMs, zwei-Expression und einige mit niedriger Expression zeigt, sowie ein weiterer Bereich nahe einem Darmkrebs mit fehlender Expression von PS zwei.

Hi, ich bin Hoy Wynn aus dem Labor von Carol Bernstein am Department für Zellbiologie und Anatomie im College of Medicine der University of Arizona. Ich bin Kristi Luo. Ich bin Alex fta.

Ich bin Nadia Suna und wir alle stammen aus dem Bernstein-Labor. Heute zeigen wir Ihnen Gewebeschnitte, die während einer Koloskopie entnommen wurden, sowie ein Verfahren zum Schneiden von Schnitten aus diesen Gewebeproben. Anschließend demonstrieren wir die Verfahren zur Immunfärbung dieser Gewebeschnitte.

Wir zeigen Ihnen außerdem, wie wir unsere Gewebeschnitte mit dem Mikroskop untersuchen. Die Gewebeschnitte werden auf die Expression von Proteinen hin untersucht, die für das Fortschreiten von Darmkrebs von Bedeutung sein könnten. Mithilfe dieser Verfahren können wir Defizite in 2D NA-Reparaturproteinen nachweisen.

ERC eins und PMMS zwei scheinen zu den ersten Schritten bei der Initiation eines Felddefekts zu gehören, der zu einem Kolonkarzinom führen kann. Wir verwenden diese Verfahren auch, um andere Proteine von wahrscheinlicher Bedeutung in frühen Schritten der Progression zum Kolonkarzinom auszuschließen, wie beispielsweise das DNA-Reparaturprotein CO 86 und das apoptosebezogene Protein CCO eins. Beginnen wir also. Biopsien normaler kolonischer Schleimhautgewebe werden von Patienten während einer Vorsorgekoloskopie entnommen und in Gläser mit Formalin gegeben.

Nach vier Stunden wird das Formin durch 70 %igen Alkohol ersetzt. Ähnliche Gewebeproben werden aus Bereichen von Kolonresektionen entnommen, die ein beziehungsweise zehn Zentimeter von kolorektalen Karzinomen entfernt liegen und Adenome mit fortgeschrittener Neoplasie aufweisen. Die Gewebeproben werden zur Verarbeitung in Paraffinblöcke vor der Schnittführung an ein histologisches Labor geschickt.

Die Paraffinblöcke werden in einem Kühlschrank gekühlt, um das Schneiden mit einem Mikrotom zu erleichtern; dabei werden vier Mikrometer dicke Gewebeschnitte aus den Gewebeblöcken geschnitten und zur vergleichenden Untersuchung der Expression zweier Proteine auf dem Wasser aufgeschwemmt. Beispielsweise werden abwechselnd Gewebeschnitte auf zwei Objektträger aufgebracht: ERC one und PMS two erhalten jeweils abwechselnd einen Schnitt, bis auf jedem der beiden Objektträger drei Gewebeschnitte liegen. Zum Beispiel können die Schnitte eins, drei und fünf auf einem mit „ERCC one“ beschrifteten Objektträger platziert werden, während die Schnitte zwei, vier und sechs auf einem mit „PMS two“ beschrifteten Objektträger aufgebracht werden.

Das Verfahren für die Immunfärbung. Die zuvor vorbereiteten Gewebeschnitte sollten unter einem Abzug mit Unterdruck durchgeführt werden, damit der Experimentator keinen Dämpfen ausgesetzt ist. Der von uns verwendete Protokollansatz ist ziemlich standardisiert, jedoch notwendig, um Ergebnisse ähnlich zu unseren zu erhalten.

Wenn Sie dieses Protokoll in Ihrem Labor verwenden, sind möglicherweise Anpassungen erforderlich, um Variablen wie Wasserqualität, Mikrowellenleistung und Antikörperkonzentration zu berücksichtigen. In diesem Video werden wir PMs zwei immunhistochemische Verfahren demonstrieren, beginnend damit, dass die Objektträger entparaffiniert werden, indem sie jeweils dreimal drei Minuten in Xylol, anschließend jeweils dreimal zwei Minuten in 100 % Ethanol und danach jeweils zweimal zwei Minuten in 95 % Ethanol gegeben werden. Schließlich spülen Sie die Objektträger mit jeweils zwei Wechseln destilliertem Wasser ab.

Als Nächstes die Objektträger in eine Pufferlösung geben und in einer Mikrowelle zum Kochen bringen. Anschließend 10 Minuten auf mittlerer Stufe erhitzen. Dieser Schritt, der als hitzeinduzierte Epitopfreisetzung bezeichnet wird, löst die während der Formalinfixierung im Gewebeprobe gebildeten Quervernetzungen und ermöglicht es dem Antikörper, das Protein von Interesse nach einer Abkühlung auf Eis für 20 Minuten zu erkennen.

Die Objektträger werden jeweils drei Minuten lang in PBS und destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend werden die Objektträger 20 Minuten lang in eine Lösung mit 3 % Wasserstoffperoxid gegeben. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, die endogene Peroxidase-Aktivität im Gewebe zu blockieren.

Außerdem verringern wir durch die Hemmung dieser Aktivität die unspezifische Hintergrundfärbung, die durch den Antikörper verursacht werden könnte. Nach 20 Minuten in der endogenen Peroxidase-Blockade werden die Objektträger jeweils drei Minuten lang mit destilliertem Wasser und anschließend mit PBS gewaschen. Für die Immunfärbung werden die Objektträger in flache, schmale Färbehalter, sogenannte Sequina, gelegt und mit PBS gespült. Die Objektträger, die für PS zwei oder ERCC eins gefärbt werden, werden danach 10 Minuten lang einer Zusatzbehandlung mit drei Tropfen einer proprietären Lösung namens Sniper ausgesetzt, die die unspezifische Färbung von Hintergrundproteinen reduziert.

Nach dem Spülen mit TBST-Puffer werden die Objektträger zwei Stunden mit dem Antikörper gegen PS zwei inkubiert, anschließend die Objektträger dreimal mit Puffer gespült und dann 100 Mikroliter biotinyliertes sekundäres Antikörper hinzugefügt. Eine 1:100-Verdünnung hinzufügen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren; nach 30 Minuten die Objektträger dreimal mit TBST-Puffer spülen. Drei Tropfen Vector-Färbereagenz A B C zu jedem Objektträger geben und weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, nach der Inkubation.

Einmal mit TBST waschen und die Objektträger von der Sequina in einen Objektträgerbehälter mit PBS überführen. Anschließend werden die Objektträger bis zu fünf Minuten in DAB-Substrat eingetaucht, wobei darauf geachtet werden muss, dass die braune Färbung nicht zu dunkel wird. Danach erfolgt eine Kontrastfärbung mit einer verdünnten Lösung von Hämatin für 10 Sekunden, gefolgt von einer gründlichen Spülung der Objektträger mit fließendem Wasser und anschließend mit entionisiertem Wasser. Die Objektträger werden dann zweimal je zwei Minuten in 95 % Ethanol, zweimal je zwei Minuten in 100 % Ethanol und zweimal je zwei Minuten in Xylol dehydriert.

Als letztes geben Sie einige Tropfen Einbettmedium auf jede Probe und legen Sie ein Deckglas auf. Nun wird Hein DW einen gefärbten Gewebeschnitt unter einem modischen Fotomikroskop auf die Expression von ERCC1 in den Krypten der Kolonschleimhaut untersuchen. Zunächst betrachten wir einen Kolonschnitt unter einem moischen Fotomikroskop mit einem 20x-Objektiv.

Der gelbe Pfeil zeigt auf eine Kolonkrypta. In dieser Krypta befinden sich etwa 200 Kolonkryptazellen. Dies sind die S-Stromazellen.

Dies ist ein Zottenlumen und dies ist das Kolonlumen, durch das der Kot transportiert wird. Es gibt drei verschiedene Arten von Kolonzottenzellen. Becherzellen haben eine Form, die einem Weinglas ähnelt, und ihre Kerne befinden sich am äußeren Rand der Zotte, hier dargestellt und in Rot hervorgehoben.

Sie weisen außerdem einen aufgeblähten Abschnitt auf, der mit weißen Mukin-Granula gefüllt ist und sich im inneren Bereich der Zelle innerhalb der hier gezeigten Krypta befindet. Die beiden anderen Zelltypen sehen in unseren Färbungsschnitten einander ähnlich. Es handelt sich um Enterocyten und enteroendokrine Zellen, deren Kerne sich ebenfalls am äußeren Rand der Krypta an der Basis der Zellen befinden, wie hier durch die roten Kreise markiert.

Dieser spezifische Abschnitt wurde auf ER CC eins gefärbt. Die braune Färbung zeigt die Lokalisation von ER C eins. Fast alle Kerne in allen Crips in diesem Abschnitt weisen einen normalen hohen Expressionsgrad von ER CC eins auf.

Die blaue Färbung stammt von Hämatoin, das wie hier gezeigt die DNA in den Kernen anfärbt. Die Kerne im Krypta weisen aufgrund der hohen Expression von ERCC1 mehr braune als blaue Färbung auf. Nun navigieren wir mit dem 10x-Objektiv durch das Gewebe.

Beachten Sie, wie die meisten Kolonkrypten hohe Expressionsebenen von EER CCC one aufweisen. Hier sehen wir einen Bereich mit wenigen Crypts, die eine geringere ER CCC one-Expression zeigen, was durch die blau gefärbten Kerne angezeigt wird. Wenn wir uns dem Ende des Gewebes nähern, bemerken wir einen weiteren Bereich mit niedrigerer ER CC one-Expression.

Wir kehren nun zurück und betrachten genauer die Krypten, die für ERCC1 defizient waren. Bei Betrachtung mit dem 20x-Objektiv können wir eine niedrigere ERCC1-Expression neben einer höheren ERCC1-Expression erkennen. Beachten Sie, wie das ERCC1-Protein im Zytoplasma der defizienten Krypta stärker exprimiert wird, was darauf hinweist, dass ERCC1 produziert wird, aber nicht in die Kerne eindringen kann.

Nun können wir mit dem 40x-Objektiv deutlicher erkennen, dass ERCC1 nicht in die Kerne dieser defizienten Krypta eindringen konnte, im Gegensatz zu den stark exprimierenden Kernen der Krypta, die wenig ERCC1 im Cytoplasma aufweisen. Dieses Gewebe wurde als Biopsie von einem Patienten mit vorangegangener Kolonkarzinomerkrankung entnommen. Als Nächstes wird Nadia Una einen gefärbten Gewebeschnitt auf die Expression von CCO1 in Krypten der kolorektalen Mukosa untersuchen. Wir können einen immunohistochemisch gefärbten Gewebeschnitt für Cytochrom-c-Oxidase 1 oder CCO1 mit einem 40x-Objektiv durchmustern.

Ein Protein ist zytoplasmatisch und wird in den Kernen nicht exprimiert, weshalb die Kerne nur blau angefärbt sind; CCO1 wird im Zytoplasma exprimiert, was durch die braune Färbung sichtbar ist. In diesem Bildausschnitt sind zwei Kolonkrypten zu erkennen, von denen eine eine positive Expression von CCO1 aufweist und die andere einen Mangel an CCO1-Expression zeigt. Während man durch diesen Gewebeschnitt navigiert, fällt auf, dass die Mehrheit der Kolonkrypten eine positive Expression von CCO1 zeigt.

Nun wird Hoy Quinn CCO eine Immunfärbung zeigen, die die Stammzellregion des Krypts und deren Funktion darstellt. Wir betrachten nun einen Gewebeschnitt, der für CCO gefärbt wurde. Berichten zufolge befinden sich weniger als fünf Stammzellen an der Basis des Krypts, die insgesamt 2000 Zellen des Krypts hervorbringen.

Der Stammzellbereich ist hier in der roten Box gekennzeichnet. Eine Stammzelle mit einer Mutation oder Epimutation kann die gesamte Stammzellnische oder die Hälfte der Stammzellnische übernehmen. Hier sehen wir Crips mit hoher normaler Expression von ccl, wobei einer Stammzellen ohne Mutation angibt, der andere nicht.

Hier haben wir ein Beispiel dafür, wie eine Mutation zu einer veränderten Färbung eines gesamten Krypta-Farbstoffs geführt hat. Bei CCL1 fällt der vollständige Ausfall der CCL1-Expression in der gesamten Krypta auf, insbesondere im Vergleich zu einer normal gefärbten Krypta. Hier sehen wir ein Beispiel dafür, wie eine Mutation zu einer veränderten Färbung in der Hälfte einer Krypta geführt hat.

Beachten Sie, wie dieser Bereich der Krypta geringe Mengen an CCO1-Expression aufweist im Vergleich zu diesem Bereich der Krypta, der eine hohe CCO1-Expression zeigt. Nun wird Nadia Suna CCO1-immunogefärbte Krypten im Querschnitt zeigen und darauf hinweisen, dass einige Krypten Querschnitte aufweisen, die von mutierten Stammzellen stammen, denen cco fehlt. Eins Hier ist ein Gewebeschnitt, immungefärbt für CO1, der kolonale Krypten im Querschnitt zeigt.

Wir werden diesen Abschnitt mit einem 20x-Objektiv beobachten. Es sind zwei Paare von Fischgräten zu sehen, die einen positiven Ausdruck von CO eins zeigen, sowie eine Fischgrätstruktur, die einen Mangel an CCO O eins in einer Krypta aufweist. Diese Krypta zeigt einen Mangel an CCO O eins-Expression in der gesamten Struktur, wobei alle Stammzellen der Krypta zu CCO eins-defizienten Zellen geworden sind.

Diese beiden Krypten zeigen halbe Umwandlungen, bei denen ungefähr 50 % der Stammzellen einen Mangel an CCO1-Expression aufwiesen. Diese Stammzellen gingen in die betroffene Hälfte über. Nun wird Alex FTA einen Gewebeschnitt immunhistochemisch auf CCO1 untersuchen und Gewebebestandteile identifizieren, um einige andere Strukturen im Gewebe zu erkennen.

Wir werden einen Schnitt präparat für CCO betrachten; mit einem 10x-Objektiv, gekennzeichnet durch den roten Rahmen, ist ein lymphoides Nodul, die luminalen Randzellen, interstitielle Zellen, auch als S-Stroma-Zellen bezeichnet, sowie die Muscularis sichtbar, die sich durch das Gewebe zieht. Nun betrachten wir einen Objektträger mit Gewebe aus einem makroskopisch unauffälligen Bereich einer Resektion, entnommen, als bei einem Patienten ein Abschnitt seines Kolons entfernt wurde. Dieser Bereich, der sehr nahe einem Kolonkarzinom liegt, kann als ein Felddefekt angesehen werden, aus dem der Tumor hervorgegangen ist.

Einige Crips weisen höhere, andere niedrigere Expressionsniveaus auf. Für ERCC1 wird uns Christi Luau zeigen, wie dieses Gewebe bewertet wird. Hier sehen Sie ein zusammengesetztes Bild, das mit einem 10×-Objektiv von einem Gewebeschnitt aufgenommen wurde, der dicht benachbart zu einem Tumor liegt, und das für ERCC1 neben einem Krebs markiert ist.

Viele andere Crips weisen häufig einen Mangel an ER CCC one auf. Wir beginnen mit der Bewertung des ER C one-Expressionsniveaus unter Verwendung eines 40x-Objektivs, wobei die Crips je nach Expressionsspiegel von ER CC one eine Punktzahl von null bis vier erhalten. Jeder Gewebeschnitt auf dem Bild mit niedriger Auflösung wird anschließend mit einer Farbe markiert: blau für einen hohen Expressionsspiegel (vier), grün für einen ziemlich hohen Expressionsspiegel (drei), gelb für einen verminderten Expressionsspiegel (zwei), orange für einen sehr niedrigen Expressionsspiegel (eins) und null für fehlende Expression.

Stufe null. Hier ist der erste Schrei, den wir bewerten werden. Wie Sie sehen können, weisen die Kerne entlang dieses Randes nahezu vollständig einen Defizit auf.

Auf der anderen Seite. Es liegt eine geringe Expression vor, und wir kennzeichnen dies als Krypta-Stufe eins für sehr schwache Färbung und orangefarbene Punkte. Diese Krypta weist in fast allen ihren Kernen eine ziemlich starke Färbung auf und erhält einen grünen Punkt für Stufe drei.

Im Vergleich zeigen alle Kerne am Lumen eine sehr starke Färbung der Stufe vier. Dieser Krypt hat eine geringe Expression von ERC1 entlang dieser Kante, daher färben wir sie gelb für Stufe zwei.

Dieses Krypta weist einerseits eine hohe Expression an einer Kante und andererseits eine ziemlich hohe Expression an dieser Kante auf, weshalb wir einen grünen Punkt für die Gesamtexpressionstufe drei setzen. Dieses Krypta zeigt eine verminderte Expression von ERC eins und wird mit einem gelben Punkt als Stufe zwei markiert. Dieses Krypta weist eine hohe Expression der Stufe vier auf, weshalb wir ihm einen blauen Punkt geben.

Insgesamt scheint dies die Expressionsebene zwei zu reduzieren, was einen gelben Punkt ergibt. Wir betrachten Crips auf Ebene null, eins und zwei – rot, orange und gelb – als reduzierte oder fehlende Expression, während Ebene drei und vier – grün und blau – als relativ hohe Expression angesehen werden. Dieser Gewebeschnitt wies 44 Crips mit niedriger Expression und 23 Crips mit relativ hoher Expression auf.

Daher wiesen 67 % der Krypten in diesem Gewebeschnitt in der Nähe eines Karzinoms eine verminderte oder fehlende Expression von ERCC in Gewebeschnitten auf. Schnitte, die nacheinander aus einem Gewebeprobeblock angefertigt und abwechselnd auf verschiedene Objektträger aufgebracht wurden, ermöglichen es uns, dieselben kolonalen Krypten auf zwei Objektträgern zu untersuchen. Diese Gewebeschnitte wurden aus Gewebe stammen aus einem Bereich unmittelbar benachbart zu einem Kolonkarzinom.

Wir färbten einen Objektträger mit Antikörper gegen ERC eins und den anderen Objektträger mit Antibiotikum gegen PMs zwei. Diese Gewebeschnitte werden von Christi Luau gezeigt. Hier sehen wir einen von zwei aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten in der Nähe von kolorektalem Karzinom, die für EER CCC eins bei einem 10x-Objektiv gefärbt wurden.

Sie können feststellen, dass ER CCC eins stark angefärbt ist in der Nähe des Lumens, obwohl die meisten Krypten nicht angefärbt sind. Sie können außerdem dieselbe runde Färbung in den interstitiellen Zellen bei höherer Vergrößerung erkennen. Wir sehen, dass diese Krypta einen hohen Gehalt an ERCC eins aufweist.

Hier haben wir einen weiteren seriellen Schnitt eines Gewebes nahe einem kolorektalen Karzinom, immunhistochemisch gefärbt für PS zwei. Während wir durch diesen Gewebeschnitt navigieren, sehen wir, dass das Krypta, das für ER CCC eins angefärbt ist, ebenfalls für PMs zwei angefärbt ist. Bei höherer Vergrößerung erkennen wir einen starken Nachweis von pmms zwei in derselben Krypta.

Hier sind beide Krypten gepaart. Sie könnten den hohen Expressionsgrad von ERC eins hier bemerken. Ebenso weist die gleiche für PMs zwei gefärbte Krypt eine hohe Expression auf.

Diese benachbarten Crips weisen nicht die hier und hier gezeigte hohe Expression auf, und benachbarte Crips, die für PMs zwei vorgesehen sind, zeigen ebenfalls hier und hier keine hohe Expression. Wir verwenden außerdem Immunhistochemie, um die Häufigkeit von Crips zu bestimmen, die für KU 86 und CCO eins defizient sind. Auf dieser Folie wird Poin einen gesamten Gewebeschnitt, der in der Nähe eines Kolonkarzinoms gewonnen wurde, durchgehen und für KU 86 immunohistochemisch einfärben.

Wir sehen, dass einige Crips in diesem krebsspezifischen Gewebeschnitt für KU 86 defizient sind. Wir verwenden außerdem die Immunhistochemie, um die Häufigkeit von Crips zu bestimmen, die für K Kuku 86 und CCL one ne im Kolonkarzinom defizient sind. Auf dieser Folie betrachten wir einen Teil eines immungefärbten Gewebeschnitts für KU 86 mithilfe eines 10x-Objektivs.

Während wir uns durch das Gewebe bewegen, erkennen wir, dass die meisten Krypten einen hohen Expressionsgrad von KU 86 aufweisen. Wie jedoch durch die roten Rahmen hervorgehoben wird, gibt es einige Krypten, die einen Mangel an KU 86 aufweisen. Auf dieser Folie wird Alex FTA einen gesamten Gewebeschnitt aus einem neurokolorektalen Karzinom durchgehen und eine Immunfärbung für CCO 1 durchführen.

Wir betrachten nun einen Gewebeschnitt, der einen Zentimeter entfernt von einem Kolonkarzinom entnommen wurde, immunhistochemisch gefärbt für CCO1 mit einem 10×-Objektiv. Wir können eine Krypta mit hoher Expression von CCO1 sowie einen Verbund von Krypten mit geringen Expressionsniveaus von cco beobachten. O1 hier ist eine effiziente Krypta.

Dieser Bereich weist einen hohen Expressionsgrad auf, während dieser Bereich einen niedrigen Expressionsgrad aufweist. Während ich durch diesen Gewebeschnitt schwenke, können wir feststellen, dass die meisten Crips einen hohen Expressionsgrad haben. Ich habe zuvor alle diese Crips erfasst.

Es gibt insgesamt 189 Crips, von denen 45 einen Mangel an CCO1 aufweisen, was einer Häufigkeit von etwa 23,8 % mangelhaften Crips in diesem Krypta entspricht. Etwa die Hälfte der Krypta exprimiert NCC O1 stark, während die andere Hälfte der Krypta einen Mangel an CCC O1 aufweist. Wir stellen fest, dass CCO1-mangelhafte Crips in der Nähe von Darmkrebs nicht so häufig vorkommen wie PMMS2- oder ERCC1-mangelhafte Crips. CCO1-mangelhafte Crips weisen in der Nähe von Darmkrebs tendenziell eine Häufigkeit von 10 bis 20 % mangelhafter Zellen auf, während ERCC1- und PMMS2-mangelhafte Crips in der Nähe von Darmkrebs meist bei 70 bis 90 % mangelhafter Zellen liegen. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man immungefärbte Gewebeschnitte aus der Kolonschleimhaut für Proteine präpariert, die bei der Progression zu Darmkrebs eine wichtige Rolle spielen könnten.

Wir haben Ihnen außerdem gezeigt, wie man diese Gewebeproben auf Defizite bestimmter Proteine, die in den Crips enthalten sind, untersucht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, drei Gewebeschnitte pro Objektträger anzubringen. Beim Auftragen des Mediums können Bläschen entstehen, die den Antikörper transportieren und verhindern, dass Crips oder Teile von Crips ausreichend angefärbt werden, da eine Blase die Reaktion des Antikörpers mit dem Gewebeschnitt verhindert.

Krypten haben normalerweise einen Durchmesser von 60 Mikrometern, und Gewebeschnitte sind vier Mikrometer dick, sodass bis zu 15 Gewebeschnitte durch dieselbe Krypte verlaufen können. Es ist in der Regel möglich, dieselbe Krypte anhand ihrer Morphologie als Leitmerkmal auf mehreren auf einem Objektträger platzierten Gewebeschnitten zu identifizieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.