Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

In diesem Video zeige ich, wie man die OPH von Gehirn und Netzhaut für die Live-Bildgebung und Immunhistochemie mit Schwerpunkt auf Photorezeptorzellen vorbereitet. Zuerst zeige ich Ihnen, wie Sie sich auf Hirndissektionen vorbereiten können. Dann werde ich drei verschiedene Dissektionen demonstrieren, das erwachsene Gehirn, die erwachsene Netzhaut und das sich entwickelnde Auge.

Für jeden dieser Fälle kann das Gewebe für die Immunhistochemie oder die Abbildung von Leben fixiert werden. Zum Schluss werde ich beschreiben, wie wir lebendes Gewebe abbilden, und ich werde einige Beispiele für Live-Bildgebung mit konfokaler Resonanz-Scanning-Mikroskopie zeigen. Kommen wir also zur Sache.

Für gute Schnitte benötigen Sie eine scharfe Pinzette. Führen Sie die Pinzette mit einem Schleifblock oder sehr feinem Schleifpapier vorsichtig auf jeder Seite hin und her, bis sich die Enden treffen. An einer feinen Stelle verwenden wir einen handelsüblichen Schleifstein.

Ich werde hier nicht auf die Schärftechnik eingehen, aber ich werde sagen, dass eine scharfe Pinzette für Live-Dissektionen unerlässlich ist. Wir schärfen jeden Tag die Pinzette für Hirndissektionen bei Erwachsenen. Legen Sie die Fliegen auf ein CO2-Pad, um sie zu betäuben und den gewünschten Genotyp zu sortieren.

Für Pupillendissektionen greifen Sie einfach in das Fläschchen und entfernen vorsichtig eine Pupille mit Ihrer Pinzette, wobei Sie darauf achten müssen, dass das Pupillengehäuse nicht zerbricht. Heben Sie ein Kim-Tuch auf und befeuchten Sie es mit Wasser. Du wirst dies während der Dissektion verwenden, um Schmutz von deiner Pinzette zu entfernen.

Stellen Sie eine Präparierschale auf den Tisch eines Stereoskops und füllen Sie sie mit HL drei Lösung. Alle Dissektionen werden in HL drei durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Gewebe während der Dissektion lebendig und gesund bleibt. Außerdem verwende ich gerne eine Sezierschale, die eine untere Abdeckung aus Syl-Schutz hat, um meine Pinzette während der Dissektion zu schützen.

Bereiten Sie nun eine Befestigungslösung vor. Wenn Sie vorhaben, Immunhistochemie durchzuführen. Geben Sie 180 Mikroliter HL three in ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie 20 Mikroliter 37%iges Formaldehyd hinzu, um eine 3,7%ige Formaldehydlösung zu erhalten. Schließlich ist die richtige Handhaltung wichtig für gute Dissektionen mit guter Handhaltung. Ihre Pinzette wird stabil sein und in der Lage sein, kontrollierte, subtile Bewegungen auszuführen.

Lege zuerst die Pinzette an die Seite deines Daumens und führe dann den Zeigefinger gerade nach unten, so dass die Fingerspitze oben aufliegt. Legen Sie nun die Seite der Pinzette auf die Seite Ihres Mittelfingers und begeben Sie sich zur Sezierschale. Stellen Sie mit Daumen und Mittelfinger Körperkontakt mit der Schüssel her, während Sie Daumen und Mittelfinger auf die Schüssel legen.

Legen Sie Ihr Handgelenk auf den Mikroskoptisch. Hier lang. Während des Sezierens sind drei Punkte fest auf den Oberflächen platziert, und es ist jetzt möglich, die Pinzette nur noch sehr subtil zu manipulieren.

Auf dem CO2-Pad. Richten Sie eine erwachsene Fliege mit der Bauchseite nach oben aus, wobei Sie den Kopf von Ihrer Hand weg haben. Fassen Sie den Brustkorb direkt unter dem Kopf.

Wenn es richtig gemacht wird, strecken sich die Beine und der Probus aus, während Sie unter einem Stereoskop schauen, greifen Sie mit Ihrer Pinzette nach dem ausgefahrenen Rüssel, um den Kopf zu entfernen, werfen Sie den Körper weg und tauchen Sie den Kopf ein. Fokussieren Sie erneut auf den untergetauchten Kopf. Die gesamte Dissektion wird unter Lösung durchgeführt.

Es ist sehr wichtig, sich immer mit der Pinzette am Kopf festzuhalten. Andernfalls schwebt der Kopf. Und denken Sie daran, dass ein schwebender Kopf immer schwer zu bergen ist.

Wenn sich der Kopf während der Dissektion unscharf bewegt, schieben Sie ihn einfach wieder in die Brennebene, ohne das Mikroskop zu verstellen. Diese scheinbar einfache Aufgabe mag anfangs schwierig sein, aber mit der Zeit wird es einfacher, den Kopf im Fokus zu behalten. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie zunächst das Bindegewebe zwischen dem Probus und dem Auge durchreißen.

Reißen Sie durch das Auge, während Sie es immer mit mindestens einer Pinzette festhalten. Achten Sie darauf, dass sich die Spitze der Pinzette nur knapp unter der Netzhaut oder Nagelhaut befindet. Um das darunter liegende Gehirn nicht zu schädigen, abwechselnd links und rechts.

Reiße mit deiner Pinzette die Netzhaut weg, die zum Hinterkopf hin arbeitet. Das Abreißen der Netzhaut erhöht die Chancen, dass die Lamina am Sehlappen befestigt bleibt. Während dieser Dissektion fahren Sie um den Hinterkopf herum fort, reißen Sie dabei die Nagelhaut ab, reißen Sie durch das andere Auge und beginnen Sie, die Nagelhaut wegzuziehen.

Solange du die Nagelhaut greifst, weißt du, dass du das Gehirn nicht zerquetschst. Ziehen Sie in diesem Sinne weiterhin Nagelhaut und Netzhaut weg, bis das Gehirn freigelegt wird. Sobald das Gehirn sichtbar ist, können Sie damit beginnen, die am Gehirn befestigte Luftröhre zu entfernen, weiter daran zu ziehen, die Luftröhre und die Nagelhaut, bis das Gehirn isoliert ist.

An diesem Punkt sollten Sie sich für die verbleibenden Schritte zur Bildgebung der Photorezeptor-Enden wieder auf den Boden Ihrer Schale konzentrieren. Es ist wünschenswert, die Lamina zu erhalten, aber Sie müssen die Netzhaut entfernen, die die Zellkörper und das stark autofluoreszierende Pigment enthält. Ziehen Sie dazu vorsichtig an den buschigen Zellkörperresten, ohne die Lamina zu beschädigen.

Dies ist eine feinere Fähigkeit und erfordert Übung. Entfernen Sie die verbleibende Luftröhre Da Ihr Gehirn sonst während der nächtlichen Antikörperwäsche schwimmen kann, kann das erwachsene Gehirn unter Bedingungen, die ich in Abschnitt sieben besprechen werde, stundenlang oder sogar über Nacht am Leben gehalten werden. Für die Immunhistochemie ist das erwachsene Gehirn nun bereit, fixiert und Formaldehyd gebildet zu werden.

Verwenden Sie eine P 20-Pipette auf fünf Mikroliter, um das Gehirn des Erwachsenen zu der bereits vorbereiteten Fixierlösung zu bewegen. Setzen Sie die Präparierung von erwachsenen Gehirnen 20 Minuten lang fort, was vier bis 10 Gehirne ergeben sollte. Lassen Sie das Gehirn und fixieren Sie es für weitere 40 Minuten.

Diese Dauer kann jedoch variieren. Für eine optimale Primärantikörperfärbung entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen Sie das Gehirn dreimal für jeweils fünf Minuten und 400 Mikroliter einer Lösung, die PBS und 0,4 % TRITTON X 100 enthält, im Folgenden als PBS Triton bezeichnet. Nachdem Sie die fixierte Lösung vollständig ausgewaschen haben, können Sie die primäre Antikörperlösung hinzufügen.

Beginnen Sie diese Dissektion wie für das Gehirn eines Erwachsenen beschrieben Nachdem Sie den Kopf eingetaucht und das Mikroskop neu fokussiert haben, beginnen Sie damit, das Bindegewebe zwischen dem Probus und dem Auge oberhalb des Probus zu zerreißen. Trenne die Nagelhaut vom Auge. Trennen Sie nun mit einer Pinzette die Nagelhaut von der Unterseite des Auges und arbeiten Sie sich in Richtung Hinterkopf vor.

Greife für diese Dissektion in die Mitte des Hinterkopfes. Es ist in Ordnung, das Gehirn mit der anderen Zange zu zerquetschen. Greifen Sie nach dem Auge und ziehen Sie es auseinander.

Lassen Sie das Auge am Boden der Schüssel ruhen. Die Lamina wird wahrscheinlich weiterhin am Auge befestigt sein und kann für die Live-Bildgebung der Photorezeptor-Endungen von vollständig intakten Photorezeptorzellen verwendet werden. In den nächsten drei Abschnitten wird erklärt, wie das Auge auf die Immunhistochemie vorbereitet wird.

Bewegen Sie für die Immunhistochemie das Auge in die Fixierlösung. Mit einer P 20 Pfeife Petman, die auf fünf Mikroliter eingestellt ist, die Präparierung der Augen von Erwachsenen für insgesamt 10 Minuten fortsetzen. Lassen Sie die Augen und fixieren Sie sie für weitere 30 Minuten.

Entfernen Sie die fixierte Lösung und führen Sie die Waschungen durch, wie in der Gehirndissektion für Erwachsene beschrieben. Möchte man letztlich die materielle Struktur des Auges abbilden, dann muss diese entfernt werden. Lege nun die fixierten Augen wieder in deine Präparierschale und entferne eventuell noch anhaftende Luftröhren oder Fettzellen.

Während Sie dann mit einer Pinzette die Außenseite des Auges festhalten, entfernen Sie mit der anderen die Lamina. Es sollte sich in einem Stück lösen und die darunter liegenden Zellkörper freilegen. Achten Sie darauf, nur die Lamina zu greifen, da Sie sonst Gefahr laufen, die Zellkörper von der Netzhaut zu lösen.

Bewegen Sie die Augen mit einer P 20 Pfeife Eman auf 400 Mikroliter PBS Triton in einer 500 Mikroliter Tube. Wiegen Sie sie über Nacht vorsichtig bei vier Grad, um am nächsten Tag das autofluoreszierende rote Pigment von den Photorezeptoren zu entfernen. Sie können die Waschlösung verwerfen und eine primäre Person hinzufügen, um die Live-Bildgebung der Augen von Erwachsenen ohne die Lamina

Wir verwenden nur adulte Frettchenfliegen, die kurz vor Elo im Spätstadium sind. In diesem Stadium trennen sich die Photorezeptorzellkörper während der Dissektion von den Terminals in der Lamina. Adulte Puy haben gut definierte Flügel, Augen und Nagelhaut, die durch die Pupille sichtbar sind.

Wähle eine Puppe aus und tauche sie in HL drei ein. Entfernen Sie den vorderen Teil des Pupillengehäuses, um die Kopfregion freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig die dünne Innenmembran, die die sich entwickelnde Fliege zusätzlich umschließt.

Fassen Sie die Basis des Kopfes mit Ihrer Pinzette und ziehen Sie. Entsorgen Sie den Rest der Puppe, während Sie den Kopf unter Wasser halten. Gehen Sie vor wie in der Augendissektion für die Immunhistochemie im Ferratenstadium des Erwachsenen beschrieben.

Die Photorezeptor-Zellkörper lösen sich jedoch leichter von der Lamina, so dass Sie die in der Netzhaut eingebetteten Zellkörper abbilden können. Außerdem bleibt die Lamina am Sehlappen befestigt, so dass Sie die distale Lamina abbilden können. Wenn Sie die proximale Lamina abbilden möchten, wo die Photorezeptor-terminalen Patronen zu sehen sind, dann führen Sie die Augendissektion an einer erwachsenen Fliege durch, bei der die Lamina stärker am Auge befestigt ist.

Die sich entwickelnde Augenscheibe mit 20% Pupillenentwicklung hat sich zu einem Favoriten für die Live-Bildgebung in unserem Labor entwickelt. Denn diese einzelne Schicht relativ großer sich entwickelnder Zellen ist mit der konfokalen Mikroskopie leicht zu beobachten. Um eine 20%ige Puppe auszuwählen, suchen Sie nach den Ian-Tubuli, einem grünen Fleck, der unter dem Pupillengehäuse erscheint, und vermeiden Sie Puppen, die einen dunklen Körper haben, der sich nach 20%iger Pupillenentwicklung bildet.

Nachdem Sie eine Puppe ausgewählt haben, tauchen Sie sie in HL drei in Ihre Präparierschale und entfernen Sie vorsichtig einen vorderen Teil des Pupillensacks. Achten Sie darauf, die dünne Innenmembran nicht zu durchdringen. Fassen Sie die innere Membran mit Ihrer Pinzette und ziehen Sie sie auseinander.

Durchsuchen Sie den veröffentlichten Inhalt sorgfältig, um die sich entwickelnden Gehirn- und Augenscheiben zu finden, die ziemlich prominent sind. Isolieren Sie das Gehirn am Boden der Präparierschale. Trennen Sie vorsichtig das Zentralhirn vom Sehlappen.

Der Scheibenkomplex des Papillenlappens I wird für die Live-Bildgebung verwendet. Wenn Sie für einen kurzen Zeitraum in nur einer oder zwei Lösungen abbilden möchten, können Sie Ihr Gewebe auf einem Objektträger abbilden. Bereiten Sie in diesem Fall den Objektträger vor, indem Sie zuerst die Oberfläche gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Syl-Schutz beschichten.

20 Mikroliter HL drei geben. Transportieren Sie in der Mitte des Objektträgers Ihr präpariertes Gewebe in 20 zusätzlichen Mikrolitern HL drei zum Objektträger. Das Gewebe darf niemals der Luft ausgesetzt werden.

Darüber hinaus muss jegliche Belastung durch die Handhabung der Pipette vermieden werden. Für die Live-Bildgebung muss das Gewebe fest fixiert werden. Besorgen Sie sich eine Glaselektrode, wie sie für elektrophysiologische Aufzeichnungen gezogen wird.

Brechen Sie die Spitze ab und füllen Sie das Ende mit Klebestich unter Verwendung des durch den Mund erzeugten negativen Luftdrucks, brechen Sie nur so viel von der Elektrode ab, dass Klebstoff eindringen kann. Tragen Sie nun mit Überdruck eine kleine Menge Kleber unter einem Tropfen HL drei auf den Schwellerschutz auf. Setzen Sie nun das Gewebe schnell auf den Kleber und behalten Sie die gewünschte Ausrichtung für die Live-Bildgebung bei.

Für die Bildgebung kann nun eine Wasserimmersionslinse verwendet werden. Wenn Sie einen membrandurchlässigen Farbstoff hinzufügen möchten, können Sie ihn dem Bad hinzufügen. Bei der Bildgebung für die Bildgebung über lange Zeiträume oder um Lösungen vollständig oder mehrmals auszutauschen, verwenden wir eine Perfusionskammer, die mit einer Peristaltikpumpe verbunden ist, die die Kulturlösung langsam über das lebende Gewebe leitet.

Verwenden Sie ein Deckglas, das mit einem Tropfen Syl Guard beschichtet ist, der rasiert wird, um ihn dünn und flach zu machen. Geben Sie 20 Mikroliter HL drei in die Mitte des Deckels. Schieben Sie das lebende Taschentuch in den Schwellerschutz und kleben Sie es fest.

Generieren Eine Dichtung, die es ermöglicht, dass Blasen durch die Kammer strömen, ohne das lebende Gewebe der Luft auszusetzen. Die Dichtung sollte dick genug sein, um ein Zerquetschen des Gewebes zu vermeiden, aber dünn genug, um das Gewebe in die Nähe der konfokalen Mikroskoplinse zu bringen. Bauen Sie die Profusionskammer zusammen und achten Sie darauf, dass das Gewebe immer vollständig unter Wasser bleibt.

So kann der Lösungsaustausch mit einer Geschwindigkeit von bis zu 100 Mikrolitern pro Minute durchgeführt werden. Für die Bildgebung auf der Stundenskala müssen Sie möglicherweise 20 Hydroxy Dyson und Antibiotikum, aber kein Antimykotikum hinzufügen und eine Reichhaltigkeit mit viel langsameren Geschwindigkeiten von etwa 10 Mikrolitern pro Minute durchführen. Außerdem blasen wir Sauerstoff in das Kulturmedium, das die Peristaltikpumpe versorgt.

Jetzt verfügen Sie über alle Fähigkeiten, die für eine erfolgreiche Dissektion des Drosophila-Gehirns und der Netzhaut erforderlich sind. Sie können auch sich live entwickelnde Augenscheiben oder erwachsene Photorezeptoren abbilden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.