Name: Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Lernen Sie Präparationstechniken für Drosophila-Gehirne und -Retina zur Live-Bildgebung und Immunhistochemie. Dieses Protokoll demonstriert effektive Präparationsmethoden für neurobiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Welch Foundation (I-1657) und der NIH (RO1EY18884) unterstützt. PRH ist ein Eugene McDermott Scholar in Biomedical Research.

1. Einführung In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie Drosophila Gehirn und Netzhaut für Live-Imaging-und Immunhistochemie mit einem Fokus auf Sehzellen vorzubereiten. Zunächst werden wir zeigen, wie man für die Gehirnentwicklung Dissektionen vorzubereiten. Als nächstes werden wir zeigen zwei grundlegende Dissektionen häufig für die Immunhistochemie verwendet, die die Grundlage für die Live-Vorbereitungen zu bilden. Diese beiden Präparate sind im erwachsenen Gehirn und Auge Dissektionen. Als nächstes werden wir die Sektionen für die Live-Darstellung von den Erwachsenen und sich entwickelnde Gehirn mit Schwerpunkt auf ihre Verwendung für die Live-Darstellung von Photorezeptoren verwendet. Schließlich werden wir beschreiben, wie wir Bild lebendem Gewebe und zeigen einige Beispiele von Live-Bildgebung mit resonant konfokalen Mikroskopie. 2. Dissection Vorbereitung <ol><li> Für eine gute Dissektionen, müssen Sie scharfe Zange. Mit einer Verschärfung blockieren oder sehr feinen Schleifpapier (&gt; 1500), sanft passieren die Zange hin und her auf jeder Seite, bis die Enden mit einer feinen Spitze zu erfüllen. Wir verwenden eine Standard-Schleifstein. Wir werden nicht für die Schleiftechnik hier, aber beachten Sie, dass scharfe Zange wichtig für Live-Dissektionen sind. Wir schärfen Pinzette vor jeder Sektion. </li><li> Für erwachsene Gehirn Dissektionen, statt die Fliegen auf einen CO 2-Pad, um sie zu betäuben und sortieren die gewünschten Genotyp. Für Puppenstadium Dissektionen, einfach in die Flasche gelangen und entfernen Sie vorsichtig eine Puppe mit einer Pinzette, wobei darauf zu vermeiden, bricht der Puppenhülle. </li><li> Befeuchten Sie ein Kimwipe mit Wasser. Sie werden diese während der Präparation zu verwenden, um Schmutz von Ihrem Pinzette entfernen. Position einem Seziertisch Gericht auf der Bühne ein Stereoskop und füllen es mit HL3 Lösung 1. Alle Sektionen werden in HL3 durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Leben und gesund während der Dissektion Verfahren bleibt. Auch verwenden wir eine Dissektion Gericht, dass ein Bodenbelag der Sylgard zu Zange während der Präparation zu schützen. </li><li> Jetzt bereiten Fixierlösung, wenn Sie Immunhistochemie durchführen möchten. Legen Sie 180μL der HL3 in eine 500μL Mikrozentrifugenröhrchen. Add 20 &amp;mgr; l von 37% Formaldehyd zu einem 3,7% igen Formaldehyd-Lösung zu erhalten. </li><li> Schließlich ist die richtige Handhaltung für gute Dissektionen wichtig. Mit einer guten Handhaltung, wird Ihr Pinzette werden stetig und in der Lage kontrollierte, subtile Bewegungen. Zuerst legen Sie die Zange an der Seite des Daumens. Dann bringen Sie den Zeigefinger senkrecht nach unten, so dass die Spitze des Fingers auf der Oberseite liegt. Nun ruhen die Seite der Pinzette auf der Seite des Mittelfingers und Umzug in die Dissektion Gericht. Machen Sie physischen Kontakt mit dem Gericht mit Daumen und Mittelfinger. Bei einer Rast mit Daumen und Mittelfinger auf den Teller, Pflanze Handgelenk auf dem Mikroskoptisch. Auf diese Weise haben Sie drei Punkte fest auf Oberflächen während der Präparation und es ist jetzt möglich, sehr subtile Manipulationen der Zange zu machen. Diese Technik kann sich ein wenig umständlich auf den ersten, aber mit etwas Übung werden Sie bald ein Meister des Gehirns Dissektionen werden. </li></ol> 3. Adulten Gehirn <ol><li> Auf der CO 2-Pad, fliegen orientieren eines Erwachsenen Bauchseite mit dem Kopf weg von deiner Hand. Besorgen Sie sich die Thorax unterhalb des Kopfes. Wenn man es richtig macht, wird der Beine und Rüssel zu verlängern. Beim Betrachten unter einem Stereoskop, greifen die erweiterten Rüssel mit einer Pinzette auf den Kopf zu entfernen. Entsorgen Sie den Körper und tauchen den Kopf. Neuausrichtung auf den untergetauchten Kopf. Die gesamte Präparation wird unter Lösung durchgeführt werden. Es ist sehr wichtig, auf den Kopf mit einer Pinzette zu allen Zeiten zu halten. Andernfalls wird der Kopf schweben und ist schwer zu holen. Wenn der Kopf bewegt sich außerhalb des Fokus während der Dissektion, verschieben Sie diese einfach zurück in die Brennebene ohne Anpassung des Mikroskops. Diese scheinbar einfache Aufgabe kann am Anfang schwierig, aber halten Sie Ihren Kopf in Schwerpunkt wird einfacher geworden im Laufe der Zeit. </li><li> Beginnen Sie mit der Präparation, indem Sie zuerst reißt das Bindegewebe zwischen den Rüssel und das Auge. Reißen durch das Auge, während Sie fest mit mindestens einer Pinzette zu allen Zeiten. Seien Sie sicher, dass die Zehen der Zange nur knapp unter der Netzhaut oder die Nagelhaut, um eine Beschädigung des Gehirns darunter. Abwechselnd links und rechts, nutzen Sie Ihre Zange zu entreißen der Netzhaut, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Abreißen der Netzhaut wird die Chancen erhöhen, dass die Lamina an der optic lobe in diesem Dissektion bleibt. Weiter um die Rückseite des Kopfes, Reißen Nagelhaut auf dem Weg. Fegen Sie durch das andere Auge und beginnen Anfahren Nagelhaut. Solange Sie greifen Nagelhaut sind, wissen Sie, Sie sind nicht Zerkleinern des Gehirns! In diesem Sinne, weiterhin Kutikula und Netzhaut weg ziehen, bis das Gehirn wird aufgedeckt. </li><li> Sobald das Gehirn sichtbar ist, können Sie damit beginnen, entfernen Luftröhre des Gehirns (Abb. 1A) befestigt. Weiter auf Luftröhre und Nagelhaut ziehen, bis das Gehirn isoliert. An dieser Stelle sollten Sie auf den Boden der Schüssel für t Neuausrichtunger verbleibenden Schritte. Entfernen Sie die restlichen Luftröhre, weil Ihr Gehirn kann nicht anders während der Nacht Antikörper wäscht schweben. Für die Bildgebung der Photorezeptor-Terminals, ist es wünschenswert, die Lamina zu halten, aber Sie müssen auf die Netzhaut, die den Zellkörper und stark autofluoreszierenden Pigment enthält zu entfernen. Um dies zu tun, genau auf den buschigen und pigmentierte Zellen bleibt zu ziehen, ohne Beschädigung der Lamina. Dies ist eine feinere Geschick und Übung braucht. </li><li> Das erwachsene Gehirn am Leben gehalten für Stunden oder sogar Tage mit Bedingungen, die wir in Abschnitt 6 erörtert wird. Für die Immunhistochemie, ist das erwachsene Gehirn nun behoben werden in Formaldehyd. 2 Verwenden Sie ein P20 pipetteman eingestellt 5μL im erwachsenen Gehirn die Festsetzung Lösung, die Sie bereits erstellt haben, bewegen. Weiter Sezieren erwachsenen Gehirn für 20 Minuten, die Muß 4-10 Gehirn liefern. Lassen Sie den Kopf in Fix für weitere 40 Minuten, aber dieser Zeitraum kann für eine optimale primäre Antikörper-Färbung variieren. Entfernen Sie die Formaldehyd-Lösung und wäscht die Gehirne 3 mal für jeweils 5 Minuten in 400μL einer Lösung mit PBS und 0,4% TritonX-100, im Folgenden als PBS-Triton bezeichnet. Nach dem vollständigen Auswaschen der fix-Lösung, können Sie fügen primärer Antikörper-Lösung. </li></ol> 4. Adult Auge <ol><li> Beginnen Sie mit dieser Präparation wie bei den erwachsenen Gehirn beschrieben. Nach Eintauchen des Kopfes und Neuausrichtung des Mikroskops, durch Abreißen des Bindegewebes zwischen den Rüssel und das Auge zu starten. Oberhalb des Rüssels, trennen Sie die Nagelhaut aus dem Auge. Nun, trennen Sie die Nagelhaut von der Unterseite des Auges, arbeiten gegen die Rückseite des Kopfes. Mit einer Pinzette greifen die Mitte der Rückseite des Kopfes. Bei den anderen, greifen das Auge und ziehen. Lassen Sie den Blick auf den Boden der Schale absetzen (Abb. 1B). Die Lamina wird wahrscheinlich immer noch für das Auge angebracht werden und kann für die Live-Darstellung der Klemmen vollständig intakt Sehzellen zu diesem Zeitpunkt verwendet werden. Um weiterhin mit Live-Darstellung von Photorezeptor Zellkörper, Abschnitt 4.5 zu gehen. Die nächsten drei Abschnitte erläutern festen Auge Immunhistochemie. </li><li> Für die Immunhistochemie, bewegen Sie den Blick auf Fixierlösung mit einem P20 pipetteman eingestellt 5μL. Weiter Sezieren erwachsenen Augen für insgesamt 10 Minuten. Lassen Sie die Augen in fix für weitere 30 Minuten. Entfernen Sie das Update-Lösung und Verhalten wäscht als im erwachsenen Gehirn Dissektion beschrieben. </li><li> Wenn Sie schließlich wollen Image der ommatidial Struktur des Auges der Lamina muss jetzt entfernt werden. Liefert die feste Augen zu Ihrem Sezieren Schüssel und entfernen Sie alle Luftröhre oder Fettzellen, die möglicherweise noch angebracht. Als nächstes, während die Außenseite des Auges mit einer Pinzette entfernen der Lamina mit den anderen. Es sollte kommen, in einem Stück, Freilegung der cellbodies darunter (Abb. 1B). Achten Sie darauf, die Lamina nur zuschlagen! Andernfalls riskieren Sie, Ablösen der Photorezeptoren der Netzhaut. </li><li> Mit einem P20 pipetteman bewegen sich die Augen zu 400uL PBS-Triton in einem 500 ul Röhre. Schütteln Sie sie bei 4 Grad über Nacht auf die autofluoreszierenden rote Pigment von den Photorezeptoren zu entfernen. Am folgenden Tag können Sie verwerfen die Waschlösung und fügen primärer Antikörper-Lösung. </li><li> Für die Live-Darstellung von erwachsenen Augen verwenden wir nur pharate erwachsenen Fliegen, also spät Puppen kurz vor Schlüpfen. In diesem Stadium der Photorezeptor Zellkörper getrennt von Terminals in der Lamina während der Präparation. </li><li> Pharate erwachsenen Puppen haben klar definierte Flügel, Augen und Nagelhaut sichtbar durch die Puppenhülle. Wählen Sie eine Puppe, und entfernen Sie den vorderen Teil der Puppenhülle der Kopfbereich aussetzen. Entfernen Sie vorsichtig die dünne innere Membran, die zusätzlich umschließt den Entwicklungsländern zu fliegen. Besorgen Sie sich die Unterseite des Kopfes mit einer Pinzette und ziehen. Entsorgen Sie den Rest der Puppe und dabei den Kopf unter Wasser. </li><li> Gehen Sie wie im Auge dissection für die Immunhistochemie nachgewiesen. Am pharate erwachsenen Stadium, jedoch wird der Photorezeptor Zellkörper leichter lösen aus der Lamina, so dass Sie Bild der Zellkörper in die Netzhaut eingebettet. Auch bleibt die Lamina an der optic lobe, so dass Sie Bild der distalen Lamina. Wenn Sie zum Bild der proximalen Lamina, wo die Photorezeptor-Terminal Patronen sehen kann wollen, führen Sie dann das Auge Dissektion auf einen Erwachsenen fliegen, wo die Lamina stärker auf das Auge verbunden ist. </li></ol> 5. Entwickeln Auge Disc-Hirn-Komplexe <ol><li> Die Entwicklung von Auge Scheibe bei 20% Puppenstadium Entwicklung (P +20%) hat sich zu einem Favoriten für Live-Aufnahmen in unserem Labor, weil diese eine Schicht von relativ großen entwickelnden Zellen leichter zu beobachten ist mit der konfokalen Mikroskopie. 3 </li><li> So wählen Sie einen 20% Puppe, für die Malpighischen Gefäße, einen grünen Punkt der erscheint unter dem Puppenstadium Fall aussehen, und vermeiden Sie Puppen, die eine &quot;dunkle Stelle&quot; 4 haben. Nach Auswahl einer P +20% Puppe, tauchen Sie es in HL3 in Ihrem Sezieren Teller und entfernen Sie vorsichtig eine vordere Teil des Puppenstadium Sack, wobei darauf geachtetnicht zu durchdringen die dünne innere Membran. Fassen Sie die innere Membran mit einer Pinzette und auseinanderziehen. </li><li> Vorsichtig durch die freigesetzten Inhaltsstoffe Suche auf das sich entwickelnde Gehirn und Auge-Discs, die ganz prominenten (Abb. 1C) zu finden. Das Auge Disc-Hirn-Komplex ist einfach in diesem Stadium der Metamorphose getrennt. Isolieren des Gehirns auf den Boden des Sezieren Gericht. Sorgfältig trennen die zentrale Gehirn von der Optik Lappen. Die Optik lobe / Auge Festplatte wird in Live-Bildgebung verwendet werden. </li></ol> 6. Live-Imaging: An dem Mikroskop <ol><li> Wenn Sie auf die Grafik für eine kurze Zeit in nur ein oder zwei Lösungen wünschen, können Sie Ihr Bild Gewebes auf einem Objektträger aus Glas. In diesem Fall bereiten die Folie, indem Sie zunächst die Beschichtung der Oberfläche mit Sylgard mit den Anweisungen des Herstellers. Legen Sie 20 &amp;mgr; l HL3 in der Mitte des Schlittens. Transportieren Sie Ihren seziert Gewebe in 20 weiteren ul HL3 auf die Folie. Das Gewebe darf NIEMALS an der Luft ausgesetzt werden. Darüber hinaus muss jede Belastung oder Stress aus Pipetten-Handling oder der Lösung Oberflächenspannung vermieden werden. </li><li> Für Live-Bildgebung, muss das Gewebe fest mit minimalem Handling und Kontakt gesichert werden. Wir sicher zu positionieren das Gehirn mit dem Wasser-Polymerisation chirurgische Kleber GluShield durch eine Mikroelektrode aufgetragen, eine Technik, die routinemäßig für embryonale Präparate für die Elektrophysiologie 5 verwendet. Besorgen Sie sich eine Glaselektrode, wie sie für elektrophysiologischen Ableitungen gezogen. Brechen Sie die Spitze und füllen Sie das Ende mit GluShield mit Unterdruck durch den Mund erzeugt. Brechen Sie nur genug von der Elektrode, Leim eindringen können. Verwenden Sie nun positive Druck, eine kleine Menge Leim auf die Sylgard gelten unter einem Rückgang von HL3. Jetzt schnell die Gewebe auf den Leim, die Aufrechterhaltung der gewünschten Orientierung für die Live-Bildgebung. Ein Wasser-Immersions-Objektiv kann nun für die Bildgebung verwendet werden. Wenn Sie eine durchlässige Membran Farbstoff hinzufügen möchten, können Sie es in das Bad während Bildgebung hinzuzufügen. </li><li> Wir verwenden ein Resonant konfokalen Mikroskop, die eine schnelle Bildgebung ermöglicht mit reduzierter Ausbleichen. 6 Für die Bildgebung über lange Zeiträume oder zum Austausch von Lösungen ganz oder mehrfach verwenden wir eine Perfusionskammer (Harvard IC30 konfokale Bildgebung Kammer), die zu einer Schlauchpumpe verbindet die langsam perfundiert Kultur-Lösung über die Live-Gewebe (Abb. 2A). Die Bewegung der Flüssigkeit konstant Austausch und minimal GluShield Kontakt reduzieren die Abflachung des Gewebes, das über längere Zeiträume Zeit 7 beobachtet wurde. Beachten Sie, dass für die Abbildung von Entwicklungsprozessen Zeiträume, das Auge Disc-Hirn-Komplex intakt bleiben und sollten minimal Kontakt mit dem Kleber haben muss. </li><li> Verwenden Sie ein Deckglas mit einem Tropfen Sylgard, dass rasiert um es dünn und flach beschichtet ist. Dispense 20 &amp;mgr; l HL3 auf die Mitte des Deckglases und kleben Sie die lebendes Gewebe, die Sylgard. Generieren Sie eine Dichtung, die damit entstehende Blasen durch die Kammer, ohne dass die lebendes Gewebe in die Luft (Abb. 2B) pass wird. Die Dichtung sollte dick genug sein, um zu vermeiden Zerkleinerung des Gewebes, aber dünn genug, um das Gewebe in der Nähe des konfokalen Mikroskop-Objektiv zu bringen, wir nutzen 250μm in unserer Einrichtung. Montieren Sie die Perfusionskammer, wobei darauf geachtet, um das Gewebe vollständig zu jeder Zeit unter Wasser zu halten. Begin Perfusion zunächst mit einer Rate nahe 100 &amp;mgr; pro Minute mit einer Schlauchpumpe. Diese Geschwindigkeit ist relativ schnell in Abhängigkeit von der Dichtungsdicke, dass die Kammer Höhe definiert. Für die Bildgebung in der Größenordnung von Stunden, müssen Sie 20-hydroxyecdysone und Antibiotika, aber nicht antimykotische hinzufügen, und führen Sie Perfusion bei viel niedrigeren Geschwindigkeiten um 10 &amp;mgr; l pro Minute. Schließlich haben wir Blase Sauerstoff in das Kulturmedium, dass die Perfusionskammer liefert. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Am Ende unserer Video-Protokoll zeigen wir ein Beispiel für Live-Bildgebung bei der Entwicklung von Sehzellen mit der Vorbereitung in Abschnitt 5 vorgestellt. Diese Vorbereitung nutzt Drosophila Transgenese, Zell-spezifisch ausdrücken fluoreszierenden Reporter. Die Membran-tagged myrRFP und der endosomalen Marker 2xFYVE-GFP 9: In dem gezeigten Beispiel sind zwei fluoreszierenden Reporter unter Kontrolle der Photorezeptor-spezifischen GMR-Gal4-Treiber 8 geäußert. Zwei-Kanal-3D-Datensätzen mit einem Begrenzungsrahmen 70x70x17.5μm und eine Voxelgröße von 137x137x700nm (512x512x26) wurden jeweils 1 min erreicht. Der Film zeigt einen ausgewählten Ebene im Laufe der Zeit in diesem 4D Datenmenge, die Dynamik der intrazellulären endosomalen Menschenhandel und Vesikelfusion Ereignisse enthüllt. Repräsentative Bilder für feste Gewebe Vorbereitungen des Auges und der Lamina sind in Abb.. 3.

<ol><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+lobe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li>
<li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li>
<li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li>
<li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+subtype+specification%3A+from+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li>
<li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaoptin%2C+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis%2C+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li>
<li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system%3A+optic+neuropile+expression+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li>
<li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li>
<li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li>
</ol>

Fluorescent Probes for Imaging Gebrauchte Hier beschreiben wir die Stärken und Schwächen der Drosophila visuelle System Vorbereitung für eine Auswahl von fluoreszierenden Sonden aus drei Klassen: (1) Probes, die ein lebendiges Gewebe Vorbereitung exogen aufgenommen werden, (2) fluoreszierende Proteine, die genetisch für Live-und kodiert sind feste Bildgebung, (3) Fluoreszenzfarbstoffen, die fixierten Gewebe für Immunhistochemie hinzugefügt werden. 1. Exogene Sonden: LysoTracker Grüne DND-26 oder Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Diese sind im Handel erhältlich fluoreszierenden membranpermeabel Verbindungen, die in stark angesäuert Fächer in der Zelle, allen voran Lysosomen ansammeln, späten Endosomen und Autophagosomen. LysoTracker bei nanomolaren Konzentrationen (wir verwenden in der Regel 50 nM) dringt in die L3 und P +20% Auge Disc voll in weniger als einer Minute. Da LysoTracker kontinuierlich sammelt und übt eine basische Wirkung, wir Bild in weniger als 5 Minuten. Im Gegensatz zu den Augen-Discs nicht LysoTracker nicht durchdringen das Gehirn ohne Unterbrechung des Gewebes. Allerdings ermöglicht eine sorgfältige Reißen der äußeren Membran das Eindringen von ein paar Zelldurchmesser in der Optik Lappen. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) Im Gegensatz zu LysoTracker, Lysosensor nicht in angesäuert Fächer anzuhäufen, sondern weist eine erhöhte Fluoreszenz bei sauren pH-Wert. Lysosensor hat Eindringen Eigenschaften, die sehr ähnlich LysoTracker sind. Wir verwenden Lysosensor bei einer Konzentration von 1 &amp;mgr;. 2. Genetisch kodierte Sonden: Für viele Live-Imaging-Experimente, drücken wir Gene, die mit verschiedenen fluoreszierenden Molekülen wie GFP, TagRFP 10 oder den pH-sensitive pHluorin 11 unter Steuerung des binären Gal4/UAS Ausdruck System 12 markiert. Gal4-Linien, die bei der Entwicklung von Photorezeptoren ausdrückliche gehören GMR-Gal4 (alle Photorezeptoren) 8 und mDelta0.5-Gal4 (Entwicklung von R4 und R7) 13. Mehrere Subtyp-spezifischen Gal4-Fahrer Linien bestehen, dass die Verwendung unterschiedlicher Rhodopsin Promotoren 14. Besonders nützlich Fluoreszenzsonden in Live-Aufnahmen sind Photokonvertierbare Proteine. Wir haben erfolgreich Dendra2, ein monomeres Grün-Rot-photoconvertable Protein 15 verwendet. Beachten Sie, dass Dendra2 ausgelegt ist, werden Photokonvertierbare mit einem 488nm Argon Laser-Linie. Wir sind jedoch nicht zur Umkehr zu erreichen mit sichtbarem blauen Licht mit unserem Set-up in entweder konventionell oder resonant konfokalen Scanning-Modus. Im Gegensatz dazu ist die Umwandlung mit 405nm UV-Laser effizienter. 3. Immunhistochemie: Für die feste erwachsenen Auge haben wir oft die Wahl zwischen Rhodamin-Phalloidin (Invitrogen, Inc.) oder anti-Chaoptin (a Photorezeptor-spezifischen Antikörpers 16) zu rhabdomeric Struktur (Abb. 1A) zu visualisieren. Eine gute Möglichkeit, Lamina Patrone Struktur zu analysieren ist, anti-chaoptin 16, der Glia-Marker anti-Ebenholz 17 und anti-sec6 18 (Abb. 1B) zu kombinieren. Wie in Abb.. 3, zeichnet sich diese Kombination aus Antikörpern, die großen präsynaptischen (chaoptin) und postsynaptische (sec6) Prozesse sowie epithelialen Gliazellen (schwarz) in der Lamina 19. Montage der Perfusionskammer Für Live-Bildgebung, beschäftigen wir eine Perfusionskammer, dass langsame Austausch von Lösungen ermöglicht, ohne die Gewebe Vorbereitung. Eine Demonstration von Perfusionskammer Montage ist in dem Video enthalten und schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Versammlung der Perfusionskammer ist in Abb. dargestellt. 2A. Beginnen Sie mit dem Verlegen der Dichtung über die Probe zuerst, und dann mit der Montage weiterhin wie dargestellt. Der Zweck der Dichtung ist es, einen Raum zwischen den Boden der Kammer und der Deckel, ein Raum, in dem das Gewebe versiegelt und wird durch die Lösung fließen zu schaffen. Der Raum im Inneren der Dichtung muss der Einlass (Lösung tritt hier), das Gewebe prep, und der Ausgang durch die die Lösung verlässt die Kammer. Zwei Merkmale der Dichtung sind entscheidend: Erstens, die Dichtung muss dick genug sein für das Gehirn noch dünn genug, um Bildgebung mit einem hochauflösenden Objektiv zulassen. Die ideale Dichtungsdicke hängt am Set-up-Parameter. Zweitens bietet eine Kerbe in die Dichtung ein Fach, dass eine Blase passieren ohne Berührung der Probe (Abb. 2B) ermöglicht. Imaging am Mikroskop Wir verwenden ein 63x (Blende 1,3) Glycerin Immersionslinse für die Perfusionskammer oder 63x Wasser Immersionslinse direkt in das Kulturmedium auf einer Folie. Glycerine Objektive bieten mehr Arbeitsabstand als Öl-Objektiven. Wir verwenden eine Resonanz konfokalen Mikroskop, das mit einer wesentlich höheren Preisen als bei einem herkömmlichen Scanner (8000 Hz im Vergleich zu 1400 Hz, jeweils) scannt. Resonant Scanning ermöglicht die 3-dimensionale Aufnahmen im Laufe der Zeit bei schnellener Bildraten. Darüber hinaus schnellere Scan-Geschwindigkeit deutlich reduzieren Laser Phototoxizität 6, die ein wichtiges Anliegen für wiederholte Scans von lebendem Gewebe ist. Ein Gleichgewicht der Laserintensität und PMT-Spannung (Gewinn) muss erreicht werden, um Signal zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Lärm-und Bleichen werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Höhe der Laser Auswirkungen auf eine Region von Auflösung und Zoom bestimmt wird. Zum Beispiel ist eine Region der Wahl mit der gleichen Auflösung auf 256x256, 2-facher als bei 512x512, Zoom 1x gescannt, doch die maximal mögliche Live-Imaging-Geschwindigkeit ist 4-mal schneller bei 256x256, 2-facher. Für die Aufzeichnung der Aktivität von schnell bewegten intrazellulären Kompartimenten, haben wir erfolgreich mit folgenden Einstellungen aufgenommen: 5 Bildern pro z-Stapel mit einer Rate von einem z-Stapel pro 10 Sekunden mit einer Scan-Geschwindigkeit von 8000 Hz und 2x Line Mittelung. Für lange Imaging-Sessions auf der Skala von Stunden haben wir oft reduzieren die Bildrate auf einen pro mehrere Minuten und wählen Sie größere Flächen wie die Vorbereitung ist eher zu verlagern. Drosophila Visual System Anatomy Abbildung 3 zeigt die Anatomie des Drosophila erwachsenen Auge (Abb. 3A), das erwachsene Gehirn (Abb. 3B) und die 20% -25% Puppenstadium Auge CD / Gehirn-Komplex (Abb. 3C). 3A veranschaulicht die erwachsenen Auge sowohl mit als auch ohne die Lamina und Fettzellen befestigt. Während der erwachsenen Auge Dissektion, die Lamina, die in der Mitte des Auges in eine Schüssel von der Photorezeptor Zellkörper (links) gebildet eingebettet ist, muss ohne Unterbrechung die Zellkörper unten (rechts) entfernt werden. Für das erwachsene Gehirn Dissektion, sollte man in der Lage sein, die Photorezeptor Zellkörper, die Lamina, die Optik Lappen, die zentrale Gehirn, und der Luftröhre (Abb. 3B) zu unterscheiden. Die Photorezeptoren und Luftröhre müssen für diese Präparation entfernt werden, während die Lamina an der optic lobe. Zur Unterstützung bei der Identifizierung der 20-25% Puppenstadium Auge CD / Gehirn komplex ist, ist ein Live-Bild in Abbildung 3C dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Neuronales Anatomiediagramm, das Gehirn, Sehlappen und Zellkörper zeigt; Dissektion von Lamina, Photorezeptoren." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A) erwachsenen Gehirn. (B) erwachsenen Auge. (C) 20% -25% Puppenstadium eye-disc/brain komplex. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Mikrofluidisches Aufbaudiagramm mit Probenfluss, Objektivlinse, Einlässen, Auslässen, Pumpe, Dichtung, Basis." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. (A) Perfusionskammer Montage-und (B) Dichtung Positionierung relativ zu der Probe. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Fluoreszierende Mikroskopie-Bilder; Zelluläre Strukturen, grüne/rote Marker, experimenteller Vergleich." data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. (A) Adult Rhabdomerlänge Färbung mit anti-chaoptin. (B) Adult Lamina Färbung mit anti-chaoptin (grün, Photorezeptoren), anti-Ebenholz (rot, Glia) und sec6 (blau, Interneuronen).

Special Equipment: <ol><li> Dissection Scope: Leica Mz12.5 mit Digitalkamera </li><li> Leica TCS SP5 konfokale Tandem-Scanner-Mikroskop für konventionelle und resonant Scannen leben Mikroskopie, darunter Blau (488 nm), Grün (561nm), orange (594nm) und weit-roten (633 nm)-Laser sowie spezielle 63x, 1,4 Glycerin und ein 63x, 1,3 Eintauchen in Wasser Linsen. </li><li> Harvard Instruments konfokalen Imaging Chamber RC-30 und Schlauchpumpe Modell 720 </li><li> Sutter Pipette Puller P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

erstellung von entwicklungs-und adult drosophila brains und retinae für live imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Die<em&gt; Drosophila</em&gt; Gehirn und visuelle System sind weit Modellsysteme genutzt, um neuronale Entwicklung, Funktion und Degeneration zu studieren. Hier zeigen wir drei Präparaten des Gehirns und des visuellen Systems, dass der Bereich aus den Entwicklungsländern Auge Disc-Hirn-Komplexes in den Entwicklungsländern Puppen auf einzelne Auge und Gehirn Dissektion von erwachsenen Fliegen zu decken. Alle Protokolle sind für die Live-Kultur der Vorbereitungen optimiert. Allerdings stellen wir auch die Voraussetzungen für eine feste Gewebe immunhistochemisch gegebenenfalls. Schließlich zeigen wir leben Bildgebung Bedingungen für diese Präparate mit herkömmlichen und resonant 4D konfokale Bildgebung leben in einer Perfusionskammer. Zusammen bieten diese Protokolle als Grundlage für Live-Aufnahmen auf verschiedenen Zeitskalen von funktionellen intrazellulären Assays auf der Skala von Minuten zu Entwicklungsstörungen oder degenerative Prozesse auf der Skala von vielen Stunden.

Dieses Protokoll beschreibt drei<em&gt; Drosophila</em&gt; Vorbereitungen: 1) erwachsenen Gehirn Dissektion, 2) erwachsenen Netzhaut Dissektion und 3) die Entwicklung Auge Disc-Hirn-Komplexe Dissektion. Der Schwerpunkt liegt auf spezielle Herstellungstechniken und Bedingungen für die Live-Imaging gelegt, obwohl alle Vorbereitungen für feste Gewebe Immunhistochemie verwendet werden können.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Das Gehirn und das visuelle System von Drosophila sind weit verbreitete Modellsysteme zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion und Degeneration. Hier zeigen wir drei ...

Wie Sie in diesem Video sehen werden, zeige ich Ihnen, wie man Gehirne und Netzhäute für die Live-Bildgebung und Immunhistochemie vorbereitet, wobei der Schwerpunkt auf Photorezeptorzellen liegt. Zunächst zeige ich Ihnen, wie Sie sich auf Gehirndissektionen vorbereiten. Anschließend demonstriere ich drei verschiedene Dissektionen: das adulte Gehirn, die adulte Netzhaut und das sich entwickelnde Auge.Für jedes dieser Gewebe kann die Probe entweder für die Immunhistochemie fixiert oder lebend abgebildet werden. Abschließend beschreibe ich, wie wir lebendes Gewebe abbilden, und zeige einige Beispiele der Live-Bildgebung unter Verwendung der Resonanz-Scanning-Konfokalmikroskopie. Beginnen wir also.Für die Goodness-Schnitte benötigen Sie scharfe Pinzetten. Führen Sie die Pinzette mit einem Schleifblock oder sehr feinem Schleifpapier vorsichtig hin und her, bis die Spitzen beider Seiten genau aufeinandertreffen. Für eine besonders feine Spitze verwenden wir einen herkömmlichen Schleifstein.Ich werde die Schärfe-Technik hier nicht behandeln, aber ich möchte betonen, dass scharfe Pinzetten für lebende Präparationen unerlässlich sind. Wir schleifen Pinzetten täglich für die Gehirnpräparation von erwachsenen Tieren. Legen Sie die Fliegen auf ein CO2-Kissen, um sie zu betäuben, und sortieren Sie das gewünschte Genotyp aus.Bei der Pupillenpräparation greifen Sie einfach mit der Pinzette in das Gefäß und entfernen vorsichtig eine Pupille, wobei Sie darauf achten sollten, die Pupillenkapsel nicht zu beschädigen. Formen Sie ein Kim-Tuch zu einem kleinen Ballen und befeuchten Sie es mit Wasser. Dieses verwenden Sie während der Präparation, um Rückstände von der Pinzette zu entfernen.Platzieren Sie eine Präparationschale auf dem Objekttisch eines Stereomikroskops und füllen Sie sie mit HL3-Lösung. Alle Präparationen werden in HL3 durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Präparationsvorgangs lebendig und gesund bleibt. Außerdem bevorzuge ich eine Präparationschale, deren Boden mit Sylgard beschichtet ist, um meine Pinzette während der Präparation zu schützen.Bereiten Sie nun eine Fixierungslösung vor, falls Sie eine Immunhistochemie durchführen möchten. Geben Sie 180 Mikroliter HL3 in ein 500-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Geben Sie 20 Mikroliter 37 % Formaldehyd hinzu, um eine 3,7 %ige Formaldehydlösung zu erhalten. Schließlich ist die richtige Handposition wichtig für gute Präparationen mit guter Handposition. Ihre Pinzette wird stabil sein und in der Lage zu kontrollierten, feinen Bewegungen.Platzieren Sie zunächst die Pinzette an der Seite Ihres Daumens und führen Sie dann den Zeigefinger gerade nach unten, sodass die Fingerspitze darauf aufliegt. Legen Sie nun die Seite der Pinzette an die Seite Ihres Mittelfingers und bewegen Sie sich zur Präparierschale. Berühren Sie die Schale physisch mit Ihrem Daumen und Mittelfinger, während diese auf der Schale aufliegen.Stützen Sie Ihr Handgelenk auf der Mikroskoptischplatte ab. So. Auf diese Weise haben Sie drei fest verankerte Auflagepunkte während der Dissektion, wodurch nun äußerst feine Bewegungen mit der Pinzette möglich sind.Auf dem CO2-Kissen. Positionieren Sie eine erwachsene Fliege mit der Bauchseite nach oben, sodass der Kopf von Ihrer Hand wegzeigt. Greifen Sie den Thorax direkt unterhalb des Kopfes.Wenn der Vorgang korrekt durchgeführt wird, strecken sich die Beine und der Rüssel unter dem Stereomikroskop; fassen Sie den ausgefahrenen Rüssel mit der Pinzette, um den Kopf zu entfernen, entsorgen Sie den Körper und tauchen Sie den Kopf ein. Stellen Sie erneut auf den eingetauchten Kopf scharf. Die gesamte Dissektion erfolgt unter Flüssigkeit.Es ist sehr wichtig, den Kopf stets mit der Pinzette festzuhalten. Andernfalls wird der Kopf wegdriften. Und denken Sie daran: Ein treibender Kopf ist immer schwer wiederzugewinnen.Falls der Kopf während der Dissektion aus dem Fokus gerät, bringen Sie ihn einfach wieder in die Fokusebene zurück, ohne das Mikroskop zu justieren. Diese scheinbar einfache Aufgabe kann am Anfang schwierig sein, doch mit der Zeit wird es leichter, den Kopf scharf zu halten. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie zuerst das Bindegewebe zwischen dem Rüssel und dem Auge einreißen.Ziehen Sie durch das Auge, während Sie es stets mit mindestens einer Pinzette festhalten. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Pinzette gerade unterhalb der Netzhaut oder der Cuticula liegt. Wechseln Sie dabei abwechselnd zwischen links und rechts, um das darunterliegende Gehirn nicht zu beschädigen.Benutzen Sie Ihre Pinzette, um die Netzhaut abzulösen, wobei Sie sich in Richtung der Hinterseite des Kopfes bewegen. Das Abreißen der Netzhaut erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Lamina am Optischen Lappen angeheftet bleibt. Setzen Sie während dieser Präparation die Arbeit entlang der Hinterseite des Kopfes fort, wobei Sie die Kutikula unterwegs abreißen, durch das andere Auge hindurchtrennen und mit dem Ablösen der Kutikula beginnen.Solange Sie die Cuticula fassen, wissen Sie, dass Sie das Gehirn nicht zerquetschen. Mit diesem Ziel im Hinterkopf ziehen Sie weiterhin Cuticula und Retina ab, bis das Gehirn sichtbar wird. Sobald das Gehirn sichtbar ist, können Sie mit der Entfernung der am Gehirn anhängenden Tracheen beginnen; ziehen Sie weiter, bis das Gehirn isoliert ist, wobei Sie Tracheen und Cuticula entfernen.Zu diesem Zeitpunkt sollten Sie sich für die verbleibenden Schritte zur Abbildung der Fotorezeptor-Terminale wieder auf den Boden Ihrer Petrischale fokussieren. Es ist wünschenswert, die Lamina beizubehalten, jedoch müssen Sie die Retina entfernen, die die Zellkörper enthält und stark autofluoreszierendes Pigment aufweist. Ziehen Sie hierzu vorsichtig an den buschigen Resten der Zellkörper, ohne die Lamina zu beschädigen.Dies ist eine feinere Fähigkeit, die Übung erfordert. Entfernen Sie die restliche Luftröhre, da andernfalls Ihr Gehirn während der mehrstündigen oder sogar über Nacht durchgeführten Antikörperwäschen schwimmen könnte. Das adulte Gehirn kann mithilfe von Bedingungen, die ich im Abschnitt sieben erläutern werde, über mehrere Stunden oder sogar über Nacht am Leben erhalten werden. Für die Immunhistochemie ist das adulte Gehirn nun bereit, fixiert und mit Formaldehyd behandelt zu werden.Verwenden Sie eine auf fünf Mikroliter eingestellte P-20-Pipette, um das erwachsene Gehirn in die zuvor vorbereitete Fixierungslösung zu überführen. Setzen Sie die Dissektion erwachsener Gehirne 20 Minuten lang fort, wodurch vier bis zehn Gehirne erhalten werden sollten. Lassen Sie die Gehirne weitere 40 Minuten fixieren.Diese Dauer kann jedoch variieren. Für eine optimale Primärantikörper-Färbung entfernen Sie die Formaldehydlösung und waschen die Gehirne dreimal für jeweils fünf Minuten mit 400 Mikrolitern einer Lösung aus PBS und 0,4 % TRITTON X-100, im Folgenden als PBS-Triton bezeichnet. Nach dem vollständigen Auswaschen der Fixierungslösung können Sie die Primärantikörperlösung hinzufügen.Beginnen Sie diese Dissektion wie für das erwachsene Gehirn beschrieben. Nachdem der Kopf untergetaucht und das Mikroskop neu fokussiert wurde, beginnen Sie damit, das Bindegewebe zwischen dem Proboscis und dem über dem Proboscis liegenden Auge aufzureißen. Lösen Sie dann die Cuticula vom Auge. Trennen Sie nun mit einer Pinzette die Cuticula von der Unterseite des Auges aus, wobei Sie sich in Richtung Hinterkopf bewegen.Greifen Sie für diese Dissektion die Mitte der Hinterkopfregion. Es ist in Ordnung, das Gehirn mit der anderen Pinzette zu zerdrücken. Greifen Sie das Auge und ziehen Sie es auseinander.Lassen Sie das Auge auf dem Boden der Schale zur Ruhe kommen. Die Lamina wird wahrscheinlich noch am Auge befestigt sein und kann für die Live-Bildgebung der Photorezeptor-Terminale aus vollständig intakten Photorezeptorzellen verwendet werden. Die nächsten drei Abschnitte erläutern, wie das Auge für die Immunhistochemie vorbereitet wird.Bei der Immunhistochemie versetzen Sie das Auge in eine Fixierungslösung. Setzen Sie die Dissektion erwachsener Augen mit einem auf fünf Mikroliter eingestellten P-20-Pipetten-Set 10 Minuten lang fort. Lassen Sie die Augen anschließend weitere 30 Minuten zur Fixierung stehen.Entfernen Sie die Fixierungslösung und führen Sie die Waschschritte wie bei der Dissektion des adulten Gehirns beschrieben durch. Wenn Sie letztendlich die materielle Struktur des Auges abbilden möchten, muss dieses entfernt werden. Geben Sie die fixierten Augen nun zurück in die Dissektionschale und entfernen Sie eventuell noch anhängende Tracheen oder Fettzellen.Halten Sie dann die Außenseite des Auges mit einer Pinzette fest und entfernen Sie die Lamina mit der anderen. Diese sollte sich vollständig ablösen und die darunterliegenden Zellkörper freilegen. Achten Sie darauf, ausschließlich die Lamina zu fassen. Andernfalls besteht die Gefahr, dass die Zellkörper von der Retina abgelöst werden.Unter Verwendung einer P-20-Pipette überführen Sie die Augen in 400 Mikroliter PBS mit Triton in ein 500-Mikroliter-Röhrchen. Schwenken Sie sie vorsichtig über Nacht bei vier Grad, um am folgenden Tag das autofluoreszierende rote Pigment aus den Photorezeptoren zu entfernen. Sie können die Waschlösung entsorgen und für die Live-Bildgebung adulter Augen ohne Lamina das primäre Antikörperreagenz hinzufügen.Wir verwenden nur erwachsene Frettchen-Fliegen, die sich im späten Puppenstadium kurz vor der Verpuppung befinden. In diesem Stadium trennen sich die Zellkörper der Photorezeptoren von den Endigungen im Lamina während der Frettchen-Präparation. Erwachsene Puppen weisen gut definierte Flügel, Augen und Cuticula auf, die durch das Pupillengehäuse sichtbar sind.Wählen Sie eine Puppe aus und tauchen Sie sie in HL drei ein. Entfernen Sie den vorderen Teil des Puppenkokons, um den Kopfbereich freizulegen. Entfernen Sie vorsichtig die dünne innere Membran, die die sich entwickelnde Fliege zusätzlich umgibt.Greifen Sie mit der Pinzette die Basis des Kopfes und ziehen Sie daran. Entsorgen Sie den Rest der Puppe, während Sie den Kopf unter Wasser halten. Fahren Sie wie bei der Augendissektion für die Immunhistochemie im erwachsenen Fer-Raten-Stadium beschrieben fort.Jedoch lösen sich die Photorezeptorzellkörper leichter von der Lamina, sodass Sie die in der Retina liegenden Zellkörper abbilden können. Außerdem bleibt die Lamina mit dem Optiklappen verbunden, sodass die distale Lamina abgebildet werden kann. Wenn Sie die proximale Lamina abbilden möchten, wo die terminalen Photorezeptorkartuschen sichtbar sind, führen Sie die Augendissektion an einer adulten Fliege durch, bei der die Lamina fester mit dem Auge verbunden ist.Die sich entwickelnde Augenscheibe bei 20 % Pupillenentwicklung ist in unserem Labor zu einem bevorzugten Objekt für Live-Bildgebung geworden. Da diese einlagige Schicht relativ großer sich entwickelnder Zellen mittels konfokaler Mikroskopie leicht beobachtbar ist. Um eine 20 %-Puppe auszuwählen, achten Sie auf die Ian-Röhren, einen grünen Fleck, der unterhalb der Pupillenhülle erscheint, und vermeiden Sie Puppen mit einem dunklen Körper, der sich nach der 20 %igen Pupillenentwicklung bildet.Nachdem Sie eine Puppe ausgewählt haben, tauchen Sie diese in Ihrer Präparierschale in HL3 ein und entfernen vorsichtig einen vorderen Teil des Pupillensacks, wobei Sie darauf achten, die dünne innere Membran nicht zu durchdringen. Greifen Sie die innere Membran mit der Pinzette und ziehen Sie sie auseinander.Suchen Sie sorgfältig in den freigelegten Inhalten nach den sich entwickelnden Gehirn- und Augenscheiben, die recht auffällig sind. Isolieren Sie das Gehirn am Boden der Präparierschale. Trennen Sie das Zentralgehirn vorsichtig vom Opticallappen. Der Optic-Lobe-I-Disc-Komplex wird für die Live-Bildgebung verwendet. Wenn Sie das Gewebe nur für einen kurzen Zeitraum in einer oder zwei Lösungen abbilden möchten, können Sie es direkt auf einem Objektträger untersuchen. Bereiten Sie in diesem Fall den Objektträger vor, indem Sie die Oberfläche gemäß den Herstelleranweisungen mit Syl-Guard beschichten.Geben Sie 20 Mikroliter HL drei in die Mitte des Objektträgers. Transportieren Sie Ihr disseziertes Gewebe in weiteren 20 Mikrolitern HL drei auf den Objektträger. Das Gewebe darf niemals der Luft ausgesetzt werden.Außerdem müssen jegliche Belastungen oder Deformationen durch das Pipettieren vermieden werden. Für die Live-Bildgebung muss das Gewebe fest fixiert sein. Beschaffen Sie eine Glas-Mikroelektrode, wie sie für elektrophysiologische Ableitungen gezogen wird.Brechen Sie die Spitze ab und füllen Sie das Ende mit Kleber unter Verwendung des negativen Luftdrucks, der durch den Mund erzeugt wird. Brechen Sie nur so viel von der Elektrode ab, dass der Kleber eindringen kann. Verwenden Sie nun positiven Druck, um eine kleine Menge Kleber auf die Dichtleiste unter einem Tropfen HL drei aufzutragen. Setzen Sie nun schnell das Gewebe auf den Kleber und bewahren Sie dabei die gewünschte Orientierung für die Live-Bildgebung bei. Ab sofort kann eine Wassereintauchlinse zur Bildgebung verwendet werden. Falls Sie einen membranpermeablen Farbstoff hinzufügen möchten, können Sie diesen dem Bad hinzufügen. Bei der Bildgebung über längere Zeiträume oder beim vollständigen oder mehrfachen Austausch der Lösungen verwenden wir eine Perfusionskammer, die mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist, die langsam die Kulturösung über das lebende Gewebe perfundiert.Verwenden Sie einen Deckgläser, der mit einem Tropfen Sylgard beschichtet und abgeschliffen wurde, um ihn dünn und flach zu machen. Geben Sie 20 Mikroliter HL drei in die Mitte des Deckgläschens. Bringen Sie das lebende Gewebe auf dem Sylgard auf und verkleben Sie es.Erzeugen Sie eine Dichtung, die es Blasen ermöglicht, die Kammer zu durchqueren, ohne das lebende Gewebe der Luft auszusetzen. Die Dichtung sollte dick genug sein, um eine Zerquetschung des Gewebes zu vermeiden, aber dünn genug, um das Gewebe nahe an die Objektivlinse des konfokalen Mikroskops heranzuführen. Bauen Sie die Perfusionskammer zusammen, wobei Sie darauf achten, das Gewebe jederzeit vollständig untergetaucht zu halten.So können Lösungsaustausche mit Geschwindigkeiten bis zu 100 Mikrolitern pro Minute durchgeführt werden. Bei Bildgebung über einen Zeitraum von Stunden müssen Sie möglicherweise 20 Hydroxy-Dyson und Antibiotikum hinzufügen, jedoch kein Antimykotikum, und die Perfusionsgeschwindigkeit auf etwa 10 Mikroliter pro Minute deutlich verringern. Außerdem leiten wir Sauerstoff in das Kulturmedium, das die peristaltische Pumpe versorgt.Nun verfügen Sie über alle erforderlichen Fähigkeiten, um die Drosophila-Gehirne und -Netzhäute erfolgreich zu dissezieren. Außerdem können Sie lebende, sich entwickelnde Augenscheiben oder adulte Photorezeptoren abbilden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Eine einfache, kostengünstige und effektive Methode zur Herstellung von Drosophila-Embryonen für die Live-imaging-Analyse vorgestellt. Unser Protokoll sieht vor Feuchtigkeit und Gasaustausch und komprimiert nicht die Drosophila-Embryo. Diese Methode eignet sich für GFP-basierte Live-Darstellung von Drosophila-Embryonen mit einem Stereomikroskop oder aufrecht zusammengesetzte Mikroskop.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Vorbereitung von Adult Drosophila Augen für Thin Schnitte und mikroskopische Untersuchung

Dieses Video beschreibt eine Methode, um intakte Gehirne von erwachsenen Fliegen unter eine Brückenrutsche zu montieren und zeigt das Protokoll, das an immungefärbten Gehirnen für die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wurde.

Montage von adulten Drosophila-Gehirnen: Eine Methode zur Vorbereitung von Objektträgern für die konfokale Bildgebung

Quelle: Hellerman, M. B.B.. , et al. Live-Imaging des Drosophila J. Vis. Exp. (2015){TAG_ 28}}Das Video zeigt eine Live-Imaging-Technik zur Untersuchung der Augenmusterung bei einer Drosophila melanogaster-Puppe. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte Marker ermöglichen die Visualisierung der zellulären Organisation und Differenzierung während der Bildung der sich entwickelnden Augenstruktur.

Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Dieses Papier stellt eine Operationsmethode für sezieren Drosophila pupal Netzhaut zusammen mit Protokolle für die Verarbeitung von Gewebe für Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Extraktion.

Dissektion der Drosophila Pupal Netzhaut Immunohistochemistry, westlichen Analyse und RNA-Isolation

Dieses Protokoll beschreibt drei Schritte zur Vorbereitung von Larven und adulten Drosophila-Sehlappen für die Bildgebung: 1) Dissektion des Gehirns, 2) Immunhistochemie und 3) Montage. Der Schwerpunkt liegt auf Schritt 3, da unterschiedliche Montageausrichtungen erforderlich sind, um spezifische Optikkeulenstrukturen sichtbar zu machen.

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

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Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

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Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

Lernen Sie Präparationstechniken für Drosophila-Gehirne und -Retina zur Live-Bildgebung und Immunhistochemie. Dieses Protokoll demonstriert effektive Präparationsmethoden für neurobiologische Studien.

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

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