Experimentelle Metastase Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die metastatischen Fähigkeiten menschlicher Krebszellen mittels Injektion in die Schwanzvene zu testen. Bei immundefizienten Mäusen werden die Zellen für die Injektion vorbereitet. Anschließend werden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, wobei nach ein bis zwei Monaten Lungenmetastasen entstehen.

Die Mäuse werden seziert und die Lungemetastasen quantifiziert und kultiviert. Ergebnisse dieser Art von Assay zeigen das Ausmaß der Metastasen eines bestimmten Typs von Krebszellen an. Hallo, ich bin Sonali Mohanty aus dem Labor von Dr. LE in der Abteilung für Biomedizinische Genetik an der Universität von Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Metastasierung von Krebs zu untersuchen. Beginnen wir also.

Beginnen Sie mit Zellen, die bis zu etwa 70 % Konfluenz herangewachsen sind. Aspirieren Sie das Medium von der Platte und waschen Sie vorsichtig einmal mit einer XPBS-Lösung. Geben Sie anschließend zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsinlösung hinzu. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Ablösung der Zellen zu fördern.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, während sie sich ablösen. Geben Sie ein ausreichendes Volumen Medium mit FBS zu, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Anschließend in einen 50-Milliliter-Probengefäß überführen.

Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Sobald die Konzentration bestimmt wurde, zentrifugieren Sie etwa drei Minuten bei 200 × g, ohne das Zellpellet zu stören. Entfernen Sie vorsichtig das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen an Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), um eine Endkonzentration von etwa 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Als Nächstes filtrieren Sie durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb von Falcon. Um große Zellaggregate auszuschließen, platzieren Sie die Pipettenspitze direkt auf dem Filter, der über einem fünf Milliliter fassenden Kulturgefäß positioniert ist. Spritzen Sie die Suspension schnell durch den Filter in das Gefäß.

Zählen Sie die Zellen erneut mit Trypanblau, um die Vitalität zu bestimmen. Die Vitalität sollte vor der Injektion über 90 % liegen. Anschließend verdünnen Sie auf eine Endkonzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.

Auf Eis halten. Greifen Sie vorsichtig den Schwanz einer immundefizienten Maus und ziehen Sie sie in den Maushalter, sodass ihr Rücken an dem Schlitz anliegt und der Schwanz durch die kleine Öffnung hinten herausragt. Verschieben Sie den Ring langsam entlang des Schlitzes nach innen.

Sobald der Ring den Mund der Maus erfasst, fixieren Sie ihn an Ort und Stelle. Die Maus sollte sich nicht frei bewegen können, aber eine normale Atemfrequenz aufweisen. Lokalisieren Sie die großen Schwanzvenen.

Im Schwanz einer Maus sind vier Hauptblutgefäße vorhanden. Die Arterien befinden sich an der dorsalen und ventralen Seite des Schwanzes. Die Venen liegen an den seitlichen Seiten.

Ziehen Sie mindestens 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie eine halbe Nadel mit 30 Gauge und drücken Sie alle Luftblasen heraus. Das endgültige Volumen in der Spritze sollte 200 Mikroliter betragen.

Bereiten Sie die Injektion in das distale Ende des Schwanzes vor. Sollte der erste Versuch fehlschlagen, kann ein weiter proximal gelegener Bereich des Schwanzes für einen zweiten Versuch genutzt werden. Wischen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol ab und ziehen Sie den Schwanz gerade.

Halten Sie die Spitze mit dem Daumen und stützen Sie die Einstichstelle mit dem Zeigefinger ab. Führen Sie die Nadel in die Vene ein und injizieren Sie die Zellen. Achten Sie darauf, dass Nadel und Spritze während der Injektion parallel zur Vene verlaufen.

Andernfalls sticht die Nadel durch die Gefäßwand, und die Zellen werden in das benachbarte Schwanzgewebe injiziert. Ziehen Sie die Nadel zurück, falls der Eingriff erfolgreich verlaufen ist. Blut sollte aus der Injektionsstelle austreten.

Drücken Sie einen sauberen Wattebausch auf, um das Zahnseiden zu erleichtern, und tasten Sie den Schwanz nach oben ab, um verbleibende Probenreste in den Kreislauf zu befördern. Lassen Sie die Maus aus dem Halter los und bringen Sie sie zurück in den Käfig. Notieren Sie die Anzahl der Injektionsversuche und die Anzahl der injizierten Zellen in einem Laborbuch.

Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Injektion. Wie zuvor bietet dieser Schritt die Gewissheit, dass die Zellen während des gesamten Injektionsvorgangs lebendig bleiben. Am Ende eines Injektionsexperiments wird die Lebensfähigkeit der Zellen abnehmen, sollte jedoch über 80 % liegen. Als optionaler Schritt können die übrigen Zellen abzentrifugiert und die Pellets einmal mit PBS gewaschen werden.

Dann frieren Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Analysen wie die Western-Blotting ein. Um die Genexpression bei Knockdowns zu bestätigen, sezieren Sie die Mäuse nach ein bis zwei Monaten, um die Lokalisation der Metastasen zu bestimmen. Beginnen Sie damit, die euthanasierte Maus auf eine Präparationsstation zu legen.

Besprühen Sie die Maus großzügig mit Ethanol. Öffnen Sie den Rippenkorb, um Lunge und Herz freizulegen. Entfernen Sie diese dann vorsichtig und legen Sie sie in PBS.

Die Lunge ist der primäre Ort für Metastasen, da sie das erste Kapillarbett enthält, das die Zellen erreichen. Nachdem sie in den Kreislauf eingetreten sind, entfernen Sie das Herz und spülen Sie die Lungen in PBS aus, anschließend untersuchen Sie jedes Lungenlappen unter einem Stereomikroskop. Zählen Sie die Anzahl der nachweisbaren Metastasen auf beiden Seiten der Lunge und addieren Sie dann die Anzahl der Lungenmetastasen an allen vier Lappen, um die Gesamtanzahl der Lungenmetastasen zu bestimmen.

Anschließend einzelne Lungenmetastasen mittels Schere durch Exzision isolieren. Jede Metastase in einen 70-Mikrometer-Zellsieb überführen und mit dem Ende einer sterilen Nadelaufsatzkappe zerkleinern. Den Zellsieb mit mehreren Millilitern Medium ausspülen und die Zellen sammeln, die durch den Filter hindurchtreten.

In einer Kulturschale enthält jede Schale Zellen aus einem einzelnen Metastasenherd. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius, ohne sie zu stören. Anfangs wachsen sowohl Krebszellen als auch Fibroblasten auf den Platten, doch nach und nach sterben die Fibroblasten ab und werden durch Krebszellen ersetzt.

Wenn die Krebszellen resistente Gene gegen Medikamente tragen, selektieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antibiotika. Nach drei Tagen spülen Sie jegliches Blut oder Gewebeabfall sowie Ablagerungen auf der Schale mit PBS ab und geben frisches Medium hinzu. Beurteilen Sie die Reinheit der gewonnenen Zellen mittels Immunfärbung mit Antikörpern gegen menschenspezifische Proteine; hier wird ein Anti-Mensch-Mentin-Antikörper verwendet, auch wenn keine Medikamentenselektion erfolgt. Mehr als 99 % der Zellen sollten menschlichen Ursprungs sein.

Die neu gewonnenen Zellen können nun erneut in immundefiziente Mäuse injiziert werden, um am Ende dieses Assays ihre metastatischen Fähigkeiten zu testen. Eine stark metastasierende Krebszelllinie führt typischerweise zu zahlreichen Lungenmetastasen, während eine schwach metastasierende Krebszelllinie nur sehr wenige Lungenmetastasen hervorruft. Diese Bilder zeigen Lungenmetastasen zwei Monate nach der Injektion der humanen Melanom-Zelllinie.

Eine 3 7 5 sm. Die mit dieser Methode gewonnenen Zellen führen in der Regel zu stärkerer Metastasierung als die ursprüngliche Zelllinie, wenn sie getestet werden. Mit diesem Assay haben wir Ihnen erneut die Vorgehensweise zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays gezeigt.

Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen in die Schwanzvene, aber nicht in das umgebende Gewebe oder die Schwanzmuskulatur injiziert werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.