Experimentelle Metastase Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Metastasierungsfähigkeit menschlicher Krebszellen durch Injektionen in die Schwanzvene zu testen. Bei immundefizienten Mäusen werden die Zellen für die Injektion vorbereitet. Die Zellen werden dann in immundefiziente Mäuse injiziert, die nach ein bis zwei Monaten Lungenmetastasen erzeugen.

Die Mäuse werden präpariert und Lungenmetastasen quantifiziert und kultiviert. Die Ergebnisse dieser Art von Assays geben Aufschluss über das Ausmaß der Metastasen einer bestimmten Art von Krebszelle. Hallo, ich bin Sonali Mohanty von Dr.LE's Lab in der Abteilung für Biomedizinische Genetik an der University of Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie mit Zellen, die auf etwa 70 % Co-Flüssigkeit gezüchtet sind, saugen Sie Medien von der Platte an und waschen Sie sie vorsichtig einmal mit einem XPBS. Fügen Sie als nächstes zwei Milliliter 0,05% Trypsin invers hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellablösung zu erleichtern.

Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, wie sie sich lösen. Fügen Sie ein großes Volumen an Medien hinzu, die FBS enthalten, um die Trips in der Aktivität zu unterdrücken. Dann in ein 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Sobald die Konzentration bestimmt wurde, zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei etwa der 200-fachen Schwerkraft, ohne das Küvettenpellet zu stören. Entfernen Sie vorsichtig das Medium Resus und suspendieren Sie ein angemessenes Volumen von Hank's Balance Buffer Solution oder HBSS, um eine Endkonzentration von etwa fünfmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Als nächstes filtrieren Sie durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb der Falcon. Um große Zellaggregate auszuschließen, setzen Sie die Spitze der Pipette direkt auf den Filter und legen Sie sie über ein Fünf-Milliliter-Kulturröhrchen. Werfen Sie die Suspension schnell durch den Filter in das Rohr aus.

Zählen Sie die Zellen erneut mit Trianblau, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Die Lebensfähigkeit sollte vor der Injektion mehr als 90 % betragen. Dann auf eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter verdünnen.

Bleiben Sie auf Eis. Greifen Sie vorsichtig den Schwanz einer immungeschwächten Maus und ziehen Sie sie in die Mäusehalterung, wobei der Rücken gegen den Schlitz stößt und der Schwanz aus der kleinen Öffnung im Rücken herausragt. Schieben Sie den Ring langsam entlang des Schlitzes nach innen.

Sobald der Ring den Mund der Maus erfasst, verriegeln Sie ihn. Die Maus sollte sich nicht frei bewegen können, aber eine normale Atemfrequenz haben. Finde die wichtigsten Schwanzvenen.

In einem Mausschwanz sind vier große Blutgefäße vorhanden. Die Arterien befinden sich an der dorsalen und ventralen Seite des Schwanzes. Die Venen befinden sich an den Seiten.

Ziehen Sie mindestens 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie eine 30-Gauge-Halbnadel und drücken Sie alle Luftblasen heraus. Das endgültige Volumen in der Spritze sollte 200 Mikroliter betragen.

Bereiten Sie die Injektion in das distale Ende des Schwanzes vor. Wenn also der erste Versuch fehlschlägt, könnte eine weiter proximale Region des Schwanzes für einen zweiten Versuch verwendet werden. Nachdem Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol abgewischt haben, ziehen Sie den Schwanz gerade.

Halten Sie die Spitze mit dem Daumen fest und stützen Sie die Injektionsstelle mit dem Zeigefinger ab. Führen Sie die Nadel in die Vene ein und injizieren Sie die Zellen. Stellen Sie sicher, dass Nadel und Spritze während der Injektion parallel zur Vene sind.

Andernfalls sticht die Nadel durch die Gefäßwand und die Zellen werden in das benachbarte Schwanzgewebe injiziert. Ziehen Sie die Nadel zurück, wenn der Eingriff erfolgreich verlaufen ist. Blut sollte aus der Injektionsstelle perfundiert werden.

Drücken Sie einen sauberen Wattebausch, um die Verwendung von Zahnseide zu erleichtern, und tasten Sie den Schwanz nach oben, um eventuelle Probenreste in den Kreislauf zu drücken. Lösen Sie die Maus aus dem Rückhaltesystem und setzen Sie sie wieder in den Käfig ein. Notieren Sie die Anzahl der Injektionsversuche und die Anzahl der injizierten Zellen in einem Labornotizbuch.

Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Injektion. Wie zuvor bietet dieser Schritt die Gewissheit, dass die Zellen während des gesamten Injektionsprozesses am Leben bleiben. Am Ende eines Injektionsexperiments nimmt die Lebensfähigkeit der Zellen ab, sollte aber über 80 % bleiben. Als optionaler Schritt schleudern Sie die übrig gebliebenen Zellen herunter und spülen Sie die Pellets einmal mit PBS aus.

Anschließend frieren Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Analysen wie Western Blotting ein. Um die Genexpression bei Knockdowns zu bestätigen Nach ein bis zwei Monaten werden die Mäuse präpariert, um die Orte der Metastasen zu bestimmen. Beginnen Sie damit, die euthanasierte Maus auf eine Sezierstation zu legen.

Besprühen Sie die Maus großzügig mit Ethanol. Schneiden Sie den Brustkorb auf, um die Lunge und das Herz freizulegen. Schneiden Sie sie dann vorsichtig aus und geben Sie sie in PBS.

Die Lunge ist die primäre Stelle für Metastasen, da sie das erste Kapillarbett enthält, auf das die Zellen treffen. Nachdem sie in den Kreislauf gelangt sind, entfernen Sie das Herz und spülen Sie die Lunge in PBS, dann beobachten Sie jeden Lungenlappen unter einem Präpariermikroskop. Zählen Sie die Anzahl der nachweisbaren Metastasen auf beiden Seiten der Lunge und dann die Anzahl der Lungenmetastasen auf allen vier Lappen zusammen, um die Gesamtzahl der Lungenmetastasen zu bestimmen.

Isolieren Sie anschließend einzelne Lungenmetastasen durch Exzision mit einer Schere. Übertragen Sie jede Metastase in ein 70-Mikrometer-Zellsieb und zerkleinern Sie sie mit dem Ende einer sterilen Nadelkappe. Spülen Sie das Zellsieb mit mehreren Millilitern Medium und sammeln Sie die Zellen, die den Filter passieren.

In einer Kulturschale enthält jede Schale die Zellen aus einer Metastase. Inkubieren Sie die Zellen mindestens vier Tage lang ungestört bei 37 Grad Celsius. Anfangs wachsen sowohl Krebszellen als auch Fibroblastenzellen auf den Platten, aber nach und nach sterben die Fibroblastenzellen ab und werden durch Krebszellen ersetzt.

Wenn die Krebszellen arzneimittelresistente Gene tragen, wählen Sie die Zellen mit entsprechenden Antibiotika aus. Nach drei Tagen waschen Sie Blut- oder Gewebereste sowie Ablagerungen auf der Schale mit PBS ab und fügen Sie frisches Medium hinzu. Beurteilen Sie die Reinheit der abgeleiteten Zellen durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen humane spezifische Proteine, und Anti-Human-Antikörper werden auch ohne Wirkstoffauswahl verwendet. Mehr als 99% der Zellen sollten menschlich sein.

Die neu gewonnenen Zellen können nun erneut in immundefiziente Mäuse injiziert werden, um am Ende dieses Assays ihre metastasierenden Fähigkeiten zu testen. Eine hochmetastasierte Krebszelllinie führt in der Regel zu vielen Lungenmetastasen, während nur sehr wenige Lungenmetastasen von einer schlecht metastasierten Krebszelllinie stammen. Diese Bilder zeigen Lungenmetastasen zwei Monate nach der Injektion der humanen Melanomzelllinie.

A 3 7 5 qm. Die Zellen, die mit dieser Methode gewonnen werden, verursachen bei der Untersuchung in der Regel mehr Metastasen als die Elternlinie. Auch hier haben wir Ihnen das Verfahren zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays gezeigt.

Bei diesem Eingriff ist es sehr wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen in die Schwanzvene injiziert werden, nicht aber in das Schwanz- und Schwanzgewebe. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.