Name: Experimentelle Metastase Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie einen experimentellen Metastase-Assay zur Bewertung humaner Krebszellen durch Schwanzveneninjektionen in immundefiziente Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Lungenmetastasen und liefert wertvolle Einblicke in das metastatische Potenzial verschiedener Zelllinien für die Onkologieforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Protokoll wurde getestet und zunächst im Labor von Dr. Richard Hynes (MIT) optimiert. Die Finanzierung erfolgt durch die NYSTEM IDEA Award (für LX) und Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (für LX) zur Verfügung gestellt.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Wachsen Zellen auf ~ 70% konfluent in ihren spezifischen Medien mit Wachstumsfaktoren oder FBS (zB DMEM mit 10% FBS für MC-1-Zellen). Saugen Sie Medien aus Platte und vorsichtig waschen mehrmals mit 1 x PBS (8 g / l NaCl, 0,2 g / l KCl, 1,15 g / L Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / l KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Absaugen PBS und 2 mL von 0,05% Trypsin in Versen (0,014 g / L von Phenolrot und 0,2 g / L EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Schütteln Platte Zellablösung von Platte zu erleichtern. Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Es dauert in der Regel 2-5 Minuten für die Zellen zu lösen. </li><li> Fügen Sie ein großes Volumen von Medien mit FBS (oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor) auf die Trypsin-Aktivität zu löschen und sammeln Zellen in einem 50 mL Falcon-Röhrchen. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Legen Sie 10 &amp;mgr; l der Zellsuspension auf einen sauberen Hämazytometer. Die Anzahl der Zellen pro ml ist gleich der durchschnittlichen Anzahl der Zellen in jeder der fünf Plätze von 10 4 multipliziert. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 RPM (oder ~ 200 xg) in einer Tischzentrifuge für 3 Minuten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Medien, ohne die Zellpellet. Die Zellen in einem geeigneten Volumen Hanks Balanced Buffer Solution (HBSS) auf eine Endkonzentration von ca. 5 x 10 6 Zellen / ml erreichen. </li><li> Filter-Zellen durch eine Falcon 70 um Zellsieb auszuschließen großen Zellverbänden. Setzen Sie die Spitze der Pipette direkt auf die Filter über einen markierten 5mL Falcon Kultur Röhre. Schnell werfen die Suspension durch den Filter in die Kultur Röhre. </li><li> Zählen von Zellen erneut mit einer Hämazytometer und verdünnen, um eine Endkonzentration von 2,5 x 10 6 / ml. Keep Zellen auf Eis. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen. Mix einige Zellen mit Trypanblau und messen Sie den Prozentsatz der toten (blau)-Zellen über den gesamten Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers. Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte ≥ 90% vor der Injektion werden. </li></ol> 2. Intravenöse Injektion <ol><li> Wechseln Sie die Handschuhe. Vorsichtig packen den Schwanz eines immundefizienten Maus (nude, NOD-SCID oder NSG, Jackson Laboratory) und ziehen Sie ihn in die Maus restrainer, mit dem Rücken gegen den Schlitz und den Schwanz ragte aus der kleinen Öffnung in der Rückseite des restrainer . </li><li> Langsam schieben Sie den Ring nach innen entlang der Schlitz und verriegeln Sie ihn an Stelle einmal den Ring fängt den Mund der Maus. Die Maus sollte nicht in der Lage sein, sich frei zu bewegen, sollte aber normale Atemfrequenz haben. </li><li> Hier finden Sie die wichtigsten Schwanzvenen. Vier große Blutgefäße vorhanden sind in einem Maus-Schwanz. Blutgefäße auf der dorsalen und ventralen Seiten der Schwanz sind Arterien. Venen sind an den Seiten des Schwanzes. </li><li> Zeichnen Sie mehr als 200 ul der vorbereiteten Zellen in eine 1 ml Spritze. Bringen Sie die 30 G1 / 2 Zoll-Nadel-und Push-out Luftblasen, die eventuell existieren. Das endgültige Volumen der Zellen in der Spritze sollte 200 ul (dh 5 x 10 5 Zellen in insgesamt) werden. </li><li> Inject Zellen in die Schwanzvene. <ol class="lalpha"><li> Starten Sie vom distalen Ende des Schwanzes, so wenn der erste Versuch fehlschlägt, eine proximalen Bereich des Schwanzes könnte für einen zweiten Versuch verwendet werden. </li><li> Wischen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol. Ziehen Sie den Schwanz gerade. Halten Sie die Spitze der Schwanz mit Daumen und unterstützen den Punkt für die Injektion mit dem Zeigefinger. </li><li> Führen Sie die Nadel, um die Vene zu injizieren und Zellen. Achten Sie darauf, die Nadel und Spritze sind parallel zu den Venen während der Injektion, da sonst die Nadel wird durch die Gefäßwand stoßen und injizieren die Zellen in den angrenzenden Geweben Schwanz. </li><li> Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion. Blut sollte reichlich aus der Injektionsstelle, wenn die Injektion ging erfolgreich. Drücken Sie ein sauberes Stück Küchenpapier oder einem Wattestäbchen auf die Injektionsstelle zu erleichtern Blutgerinnung, und tasten den Schwanz nach oben, um restliche Probe in die Vene in Umlauf zu schieben. </li><li> Lassen Sie die Maustaste aus dem restrainer und senden es an den Käfig. Notieren Sie sich die Einspritzung (zB wie viele Versuche es brauchte, um die Zellen zu injizieren und wie viel Zellen injiziert wurden) in einem Labor-Notebook. </li><li> Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Injektion, wie im Abschnitt der Probenvorbereitung beschrieben, Schritt 9. Dieser Schritt bietet die Gewissheit, dass Zellen am Leben zu bleiben während der Injektion Prozess. Am Ende der Injektion Experiment wird die Lebensfähigkeit der Zellen zurückgehen, aber sollte über 80% betragen. </li><li> (Optional) Spin down die übrig gebliebenen Zellen und spülen Sie die Pellets mit PBS einmal. Einfrieren des Pellets bei -80 oC für zukünftige Analysen (zB Western Blots, die Genexpression oder Niederschlägen zu bestätigen). </li></ol></li><li> In der Regel nach ein oder zwei Monaten werden die Mäuse seziert und die Standorte von Metastasen sind grob bestimmt. Lung ist der primäre Ort für die Metastasierung, da es das erste Kapillarbett, dass die Zellen nach denen sie begegnen enthältin den Kreislauf eintreten. </li><li> Nach dem Spülen mit PBS, jeder Lappen der Lunge (oder anderen Geweben mit Metastasen) wird unter einem Binokular (Abbildung 1) beobachtet. Die Zahl der nachweisbaren Metastasen auf beiden Seiten der Lunge wird gezählt und die Anzahl von Lungenmetastasen auf allen vier Lappen sind addiert als die Gesamtzahl von Lungenmetastasen. 1 Lungenmetastasen sind leichter erkannt werden, wenn die Lunge in Formalin fixiert werden über Nacht , da sich die Metastasen werden als weißliche Flecken im Gegensatz zu den benachbarten dunkelbraun Lungengewebe apppear. </li></ol> 3. Kultivierung von Zellen aus Lungenmetastasen <ol><li> Lungenmetastasen sind aus injizierten Mäusen isoliert. Jeder sollte getrennt kultiviert werden. </li><li> Jeder Metastasierung wird durch das Ende einer Nadelkappe (steril) auf einem 70 um Zellsieb zerkleinert. </li><li> Spülen Sie die Zelle Sieb mit mehreren ml Medium gesammelt und Zellen, die den Filter passieren in der Kulturschale. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für mindestens 4 Tage ohne Störung. </li><li> Wegspülen Blut oder Gewebereste auf die Schale mit PBS. </li><li> Fügen Sie frisches Medium. Am Anfang, sowohl Krebszellen und Fibroblasten auf den Platten wachsen, aber nach und nach, die Fibroblasten werden aussterben und durch Krebszellen ersetzt werden. Wenn die Krebszellen keine resistenten Gene in sich tragen, markieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antibiotika. </li><li> Die Reinheit des gewonnenen Zellen wird durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen human-spezifische Proteine ​​untersucht. Wir benutzen ein Anti-Human-Vimentin-Antikörper (NCL-VIM-V9, Novocastra). Die Zellen haben wir gewonnen werden, enthalten in der Regel über 99% der menschlichen Zellen, auch in Abwesenheit des Medikaments Auswahl. Die neu gewonnenen Zellen könnten wieder in immundefizienten Mäusen injiziert werden, um ihre Fähigkeiten zu testen metastasiertem, wie oben beschrieben. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Am Ende dieses Tests, ein hoch metastasiertem Krebs-Zelllinie in der Regel wirft viele Lungenmetastasen (Abbildung 1), 1, während nur sehr wenige Lungenmetastasen aus einem schlecht metastasiertem Krebs-Zelllinie kommen wird. </li><li> Die Zellen stammen mit dieser Methode in der Regel ergeben sich weitere Metastasen als die Stammlinie, wenn sie getestet werden wieder in diesem Test. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Repräsentative Bilder Mauslungen nach Schwanzvene Injektionen von Krebszellen. 5 x 10 5 des metastasierenden Melanoms menschlichen Zelllinie, SM-Zellen, 4 wurden in die Schwanzvene von immundefizienten Mäusen injiziert. Zwei Monate später wurden die Lungen isoliert und Metastasen gefunden wurden zerstreut unter den normalen Lungengewebe.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Metastasierung ist die häufigste Todesursache bei Krebspatienten. Es umfasst vier wesentliche Schritte: Ablösung von Krebszellen aus ihrem primären loci, die Einfahrt in den Verkehr (intravasation), deren Ausfahrt aus dem Verkehr (Extravasation), und das Überleben und Wachstum in einem entfernten Organ. Metastase in der menschlichen gilt als ein langsamer Prozess und oft nach Jahren der Latenz manifestiert. Zur Untersuchung ihrer Progression rechtzeitig wurde die oben relativ schnell Versuchsansatz in immundefizienten M...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 2,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Äthanol</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Falcon-Röhrchen</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m-Zellfilter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Falcon-Kulturröhrchen</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12;-Gauge-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Mausfixierungsgerät</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentelle metastase assay

Experimental Metastasis Assay

Metastasierung ist die häufigste Todesursache bei Krebspatienten. Um zu verstehen, den Mechanismus der Metastasierung, war eine experimentelle Metastasierung Assay etabliert mit immundefizienten Mäusen. Dieser Artikel umreißt die Verfahren in diesem Test beteiligt, inklusive Probenvorbereitung, intravenöse Injektion, und Kultivieren von Zellen aus der Lunge Metastasen. Kurz gesagt, wurden einer vorher festgelegten Anzahl von menschlichen Krebszellen vorbereitet<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und direkt in den Kreislauf von immundefizienten Mäusen durch ihren Schwanz Venen gespritzt. Eine kleine Anzahl von Zellen überleben die Turbulenzen an den Kreislauf an und wachsen als Metastasen in inneren Organen, wie Lunge. Die injizierten Mäuse sind nach einer gewissen Zeit seziert. Die Verteilung im Gewebe von Metastasen unter einem Binokular bestimmt. Die Anzahl der Metastasen in einem bestimmten Gewebe wird gezählt und es direkt korreliert mit dem metastatischen Fähigkeit der Krebszellen injiziert. Der entstandene Metastasen sind isoliert und kultiviert<em&gt; In-vitro-</em&gt; Als Zell-Linien, die oft zeigen verbesserte metastatischen Fähigkeiten als die Stammlinie, wenn wieder in immundefizienten Mäusen injiziert. Diese hoch metastatischen Derivate werden nützliche Tools zur Identifizierung von Genen oder molekularen Signalwege, die metastatischen Progression zu regulieren.

Dieser Artikel beschreibt die Verfahren der experimentellen Metastasierung Assay, mit denen die metastatische Potential von humanen Krebszelllinien zu bestimmen.

Experimentelle Metastase Assay

Metastasen sind die häufigste Todesursache bei Krebspatienten. Um den Mechanismus der Metastasierung zu verstehen, wurde ein experimenteller Metastasierungsassay etabliert ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die metastatischen Fähigkeiten menschlicher Krebszellen mittels Injektion in die Schwanzvene zu testen. Bei immundefizienten Mäusen werden die Zellen für die Injektion vorbereitet. Anschließend werden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, wobei nach ein bis zwei Monaten Lungenmetastasen entstehen.Die Mäuse werden seziert und die Lungemetastasen quantifiziert und kultiviert. Ergebnisse dieser Art von Assay zeigen das Ausmaß der Metastasen eines bestimmten Typs von Krebszellen an. Hallo, ich bin Sonali Mohanty aus dem Labor von Dr. LE in der Abteilung für Biomedizinische Genetik an der Universität von Rochester.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Metastasierung von Krebs zu untersuchen. Beginnen wir also.Beginnen Sie mit Zellen, die bis zu etwa 70 % Konfluenz herangewachsen sind. Aspirieren Sie das Medium von der Platte und waschen Sie vorsichtig einmal mit einer XPBS-Lösung. Geben Sie anschließend zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsinlösung hinzu. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Ablösung der Zellen zu fördern.Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, während sie sich ablösen. Geben Sie ein ausreichendes Volumen Medium mit FBS zu, um die Trypsinaktivität zu stoppen. Anschließend in einen 50-Milliliter-Probengefäß überführen.Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Sobald die Konzentration bestimmt wurde, zentrifugieren Sie etwa drei Minuten bei 200 × g, ohne das Zellpellet zu stören. Entfernen Sie vorsichtig das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen an Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), um eine Endkonzentration von etwa 5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen.Als Nächstes filtrieren Sie durch einen 70-Mikrometer-Zellsieb von Falcon. Um große Zellaggregate auszuschließen, platzieren Sie die Pipettenspitze direkt auf dem Filter, der über einem fünf Milliliter fassenden Kulturgefäß positioniert ist. Spritzen Sie die Suspension schnell durch den Filter in das Gefäß. Zählen Sie die Zellen erneut mit Trypanblau, um die Vitalität zu bestimmen. Die Vitalität sollte vor der Injektion über 90 % liegen. Anschließend verdünnen Sie auf eine Endkonzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter.Auf Eis halten. Greifen Sie vorsichtig den Schwanz einer immundefizienten Maus und ziehen Sie sie in den Maushalter, sodass ihr Rücken an dem Schlitz anliegt und der Schwanz durch die kleine Öffnung hinten herausragt. Verschieben Sie den Ring langsam entlang des Schlitzes nach innen.Sobald der Ring den Mund der Maus erfasst, fixieren Sie ihn an Ort und Stelle. Die Maus sollte sich nicht frei bewegen können, aber eine normale Atemfrequenz aufweisen. Lokalisieren Sie die großen Schwanzvenen.Im Schwanz einer Maus sind vier Hauptblutgefäße vorhanden. Die Arterien befinden sich an der dorsalen und ventralen Seite des Schwanzes. Die Venen liegen an den seitlichen Seiten.Ziehen Sie mindestens 200 Mikroliter der vorbereiteten Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie eine halbe Nadel mit 30 Gauge und drücken Sie alle Luftblasen heraus. Das endgültige Volumen in der Spritze sollte 200 Mikroliter betragen.Bereiten Sie die Injektion in das distale Ende des Schwanzes vor. Sollte der erste Versuch fehlschlagen, kann ein weiter proximal gelegener Bereich des Schwanzes für einen zweiten Versuch genutzt werden. Wischen Sie die Injektionsstelle mit 70 % Ethanol ab und ziehen Sie den Schwanz gerade.Halten Sie die Spitze mit dem Daumen und stützen Sie die Einstichstelle mit dem Zeigefinger ab. Führen Sie die Nadel in die Vene ein und injizieren Sie die Zellen. Achten Sie darauf, dass Nadel und Spritze während der Injektion parallel zur Vene verlaufen.Andernfalls sticht die Nadel durch die Gefäßwand, und die Zellen werden in das benachbarte Schwanzgewebe injiziert. Ziehen Sie die Nadel zurück, falls der Eingriff erfolgreich verlaufen ist. Blut sollte aus der Injektionsstelle austreten.Drücken Sie einen sauberen Wattebausch auf, um das Zahnseiden zu erleichtern, und tasten Sie den Schwanz nach oben ab, um verbleibende Probenreste in den Kreislauf zu befördern. Lassen Sie die Maus aus dem Halter los und bringen Sie sie zurück in den Käfig. Notieren Sie die Anzahl der Injektionsversuche und die Anzahl der injizierten Zellen in einem Laborbuch.Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Injektion. Wie zuvor bietet dieser Schritt die Gewissheit, dass die Zellen während des gesamten Injektionsvorgangs lebendig bleiben. Am Ende eines Injektionsexperiments wird die Lebensfähigkeit der Zellen abnehmen, sollte jedoch über 80 % liegen. Als optionaler Schritt können die übrigen Zellen abzentrifugiert und die Pellets einmal mit PBS gewaschen werden.Dann frieren Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Analysen wie die Western-Blotting ein. Um die Genexpression bei Knockdowns zu bestätigen, sezieren Sie die Mäuse nach ein bis zwei Monaten, um die Lokalisation der Metastasen zu bestimmen. Beginnen Sie damit, die euthanasierte Maus auf eine Präparationsstation zu legen.Besprühen Sie die Maus großzügig mit Ethanol. Öffnen Sie den Rippenkorb, um Lunge und Herz freizulegen. Entfernen Sie diese dann vorsichtig und legen Sie sie in PBS. Die Lunge ist der primäre Ort für Metastasen, da sie das erste Kapillarbett enthält, das die Zellen erreichen. Nachdem sie in den Kreislauf eingetreten sind, entfernen Sie das Herz und spülen Sie die Lungen in PBS aus, anschließend untersuchen Sie jedes Lungenlappen unter einem Stereomikroskop. Zählen Sie die Anzahl der nachweisbaren Metastasen auf beiden Seiten der Lunge und addieren Sie dann die Anzahl der Lungenmetastasen an allen vier Lappen, um die Gesamtanzahl der Lungenmetastasen zu bestimmen.Anschließend einzelne Lungenmetastasen mittels Schere durch Exzision isolieren. Jede Metastase in einen 70-Mikrometer-Zellsieb überführen und mit dem Ende einer sterilen Nadelaufsatzkappe zerkleinern. Den Zellsieb mit mehreren Millilitern Medium ausspülen und die Zellen sammeln, die durch den Filter hindurchtreten. In einer Kulturschale enthält jede Schale Zellen aus einem einzelnen Metastasenherd. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius, ohne sie zu stören. Anfangs wachsen sowohl Krebszellen als auch Fibroblasten auf den Platten, doch nach und nach sterben die Fibroblasten ab und werden durch Krebszellen ersetzt.Wenn die Krebszellen resistente Gene gegen Medikamente tragen, selektieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antibiotika. Nach drei Tagen spülen Sie jegliches Blut oder Gewebeabfall sowie Ablagerungen auf der Schale mit PBS ab und geben frisches Medium hinzu. Beurteilen Sie die Reinheit der gewonnenen Zellen mittels Immunfärbung mit Antikörpern gegen menschenspezifische Proteine; hier wird ein Anti-Mensch-Mentin-Antikörper verwendet, auch wenn keine Medikamentenselektion erfolgt. Mehr als 99 % der Zellen sollten menschlichen Ursprungs sein.Die neu gewonnenen Zellen können nun erneut in immundefiziente Mäuse injiziert werden, um am Ende dieses Assays ihre metastatischen Fähigkeiten zu testen. Eine stark metastasierende Krebszelllinie führt typischerweise zu zahlreichen Lungenmetastasen, während eine schwach metastasierende Krebszelllinie nur sehr wenige Lungenmetastasen hervorruft. Diese Bilder zeigen Lungenmetastasen zwei Monate nach der Injektion der humanen Melanom-Zelllinie.Eine 3 7 5 sm. Die mit dieser Methode gewonnenen Zellen führen in der Regel zu stärkerer Metastasierung als die ursprüngliche Zelllinie, wenn sie getestet werden. Mit diesem Assay haben wir Ihnen erneut die Vorgehensweise zur Durchführung eines experimentellen Metastasenassays gezeigt.Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, darauf zu achten, dass die Zellen in die Schwanzvene, aber nicht in das umgebende Gewebe oder die Schwanzmuskulatur injiziert werden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine experimentelle Lungenmetastasen und CTL Immuntherapie Mausmodell für die Analyse von...

Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Mit quantitative PCR, zeigen wir, wie die etablierten chick CAM-Modell verwendet werden, um quantitativ zu analysieren die Metastasierung von humanen Tumorzellen zu entfernten Organen sein.

Quantitative Analyse von Krebs Metastasen mit einem Vogelembryo Modell

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Etablierung eines spontanen Metastasen-Mausmodells von Xenotransplantaten oder PDXs von Darmkrebspatienten. Diese Xenotransplantatmodelle ahmen teilweise die Merkmale menschlicher Karzinome nach und verstehen die kritischen Aspekte menschlicher Malignome, einschließlich Invasion und Metastasierung.

Mausmodelle für spontane Metastasen: Eine Plattform zur Untersuchung des Metastasierungspotenzials von orthotopisch injizierten kolorektalen Krebszellen

Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Tumor Zelle Ansammlung in der Lunge in einem Tiermodell der Tumor Metastasen.

Lung Tumor Zelle Rekrutierung Assay

Dieses Protokoll beschreibt die quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR) verwenden, um Tumorzellen spezifische mRNA, die Metastasen in der Maus Lungengewebe zu erkennen.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastasierung spielt eine tiefgreifende Rolle bei der Virulenz von Krebs und ist schätzungsweise für 90% der Todesfälle verantwortlich.  Wir berichten über ein Protokoll für ein metastasiertes Melanommodell in Mäusen, das nützlich ist, um die Wirksamkeit von Therapeutika gegen dieses klinische Phänomen zu bestimmen.

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung des Protokolls für die pulmonalen Metastasen-Assay (PuMA) zur Verfügung zu stellen. Dieses Modell erlaubt Forschern, metastasierendem Osteosarkom (OS) Zellwachstum im Lungengewebe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokale Laserscanning-Mikroskop zu studieren.

Praktische Überlegungen an einem Studium von metastasierendem Lungenkrebs Besiedlung in Osteosarkom mit pulmonalen Metastasen-Assay

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Lernen Sie einen experimentellen Metastase-Assay zur Bewertung humaner Krebszellen durch Schwanzveneninjektionen in immundefiziente Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Lungenmetastasen und liefert wertvolle Einblicke in das metastatische Potenzial verschiedener Zelllinien für die Onkologieforschung.

Experimentelle Metastase Assay

Weitere Videos entdecken