Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Hallo, mein Name ist Rick Pasqua, Student im Stem Cell Engineering-Labor an der Abteilung für Chemische und Lebenswissenschaften der Virginia Commonwealth University. In diesem Video zeige ich, wie unser Labor eine kostengünstige, selbstgebaute STO-Spindelvorrichtung verwendet, um eine beobachtbare Monoschicht menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern zu erzeugen. Da viele IMMUNOCHEMISCHE Protokolle für hPSCs angepasst werden, die als Kolonien in Kammerobjektträgern kultiviert werden, können Probleme bei der Charakterisierung der Expression von Biomarkern auf einzelner Zellebene auftreten.

Die Anordnung der Zellen in einer einfachen Zellschicht erleichtert nicht nur die visuelle Analyse, sondern möglicherweise auch die Quantifizierung ihres Expressionsniveaus. Der von unseren Laboren verwendete Sinus-Spin-Apparat kann aus Materialien aufgebaut werden, die in den meisten Laboren vorhanden sind, benötigt nur eine kleine Zellprobe und kommt ohne spezifische Reagenzien aus. Noch wichtiger ist, dass er zuverlässig eine Ansammlung einzelner Zellen erzeugt, die zur Beobachtung geeignet sind. Im Folgenden finden Sie einige der benötigten Materialien, um den Cytosin-Apparat zusammenzustellen.

Kunststoff-Objektträger, da diese nicht unbedingt sauber sein müssen, können Sie alte Kammer-Objektträger verwenden, wenn Sie möchten. Vorher gereinigte Glas-Objektträger. Diese müssen gereinigt werden, da hier die Zell-Monoschicht angelegt wird.

Filterpapier, jede Art ist geeignet, und Mikropipettenspitzen. Unser Labor verwendet Spitzen von 1 bis 10 Mikroliter, bevor die Konstruktion beginnen kann. Zunächst sollten Löcher in die Kunststoffobjektträger gebohrt werden.

Dies kann mit einer Bohrmaschine durchgeführt werden. Der Durchmesser der Löcher hängt von der Größe der Mikropipettenspitze ab und sollte etwa der Breite des breitesten Abschnitts der für eine Standard-Mikropipettenspitze von eins zu zehn Mikroliter verwendeten Spitze entsprechen. Dies sollte bei etwa sieben Millimetern liegen.

Die Anzahl der Löcher, die Sie in die Kunststoffobjektträger einbringen, hängt vollständig von Ihrem geplanten Verwendungszweck ab. Für die immunchemische Färbung in unserem Labor verwenden wir beispielsweise üblicherweise zwei Löcher, eines für die positive Färbung und das andere für die negative Hintergrundkontrolle. Diese Objektträger können unbegrenzt oft wiederverwendet werden.

Schneiden Sie für das Filterpapier einfach ein Stück in den Abmessungen der Kunststoffplatte zu. Verwenden Sie die Öffnungen der Platte als Vorlage, um entsprechende Löcher im Filterpapier anzubringen. Die Größe des Lochs im Filterpapier sollte ausreichend groß sein, damit die Mikropipettenspitze wie hier gezeigt fest hineinpasst.

Dann müssen wir die entsprechende Anzahl von Mikropipettenspitzen zus schneiden, jeweils eine für jedes Loch, und zwar etwa zur Hälfte ihrer Länge. Dies dient als Unterlage für den Objektträger, auf der die zelluläre Monoschicht erzeugt wird. Danach wird das Filterpapier daraufgelegt.

Das Filterpapier dient dazu, überschüssiges Medium aus der Suspension beim Färben aufzunehmen. Anschließend wird der Plastikobjektträger aufgesetzt, der als feste Unterlage des Apparats fungiert. Dieser kann dann an allen vier Seiten mit handelsüblichem Klebeband abgedichtet werden.

Schließlich werden ganze Mikropipettenspitzen in die abgeschnittenen Enden der Apparatur eingeführt. Hier werden die Zellproben nach der Suspensionsfärbung platziert. Es kann außerdem hilfreich sein, zunächst zu markieren, an welcher Stelle auf dem Objektträger sich die abgeschnittenen Spitzen befinden, um eine bequemere Wiedererkennung zu ermöglichen.

Das von unserem Labor verwendete immunochemische Suspensionsfärbungsprotokoll beinhaltet zunächst die Gewinnung von Stammzellen in eine Einzelzell-Suspension, was üblicherweise durch enzymatische Behandlung mit Trypsin oder nicht-enzymatischen, auf EDTA basierenden Zell-Dissociationspuffern erfolgt. Anschließend werden die Zellen in 1 ml oder 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführt und mit ihrem standardmäßigen Wachstumsmedium versetzt. Danach werden sie vier Minuten lang bei 200 ×g zentrifugiert.

Dieselbe Zentrifugationsgeschwindigkeit wird für alle nachfolgenden Wasch- und Abzentrifugierungsschritte verwendet. Das Medium wird anschließend manuell abgesaugt; achten Sie dabei besonders darauf, dass das Zellpellet ungestört bleibt. Anschließend wird zweimal mit einem ml PBS gewaschen, wobei jedes Mal zentrifugiert und das Überstand abgesaugt wird.

Der nächste Schritt beinhaltet die Fixierung der Zellen mithilfe von 4 %iger Formaldehyd- oder PFA-Reagenzien, die zur Herstellung dieser Lösung benötigt werden und im begleitenden Text zu diesem Video aufgelistet sind. Die Zellen werden in der 4 %igen Formaldehydlösung inkubiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Es wird empfohlen, diesen Schritt vor der extrazellulären Suspensionsfärbung und der Verwendung der Zytospin-Vorrichtung durchzuführen.

Anschließend werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um Rückstände des PFA zu entfernen. Die Zellen sollten dann blockiert werden, um unspezifische Färbungen zu verhindern. Nach den PBS-Waschschritten des vorherigen Schritts wird die Waschlösung abgesaugt und 1 ml der Blockierungslösung hinzugefügt.

Dies sollte dann etwa 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Während des Wartens auf die Blockierungslösung können Sie den primären Antikörper vorbereiten, indem Sie ihn auf die empfohlene Verdünnung in der Blockierungslösung verdünnen. Bewahren Sie dies bei vier Grad Celsius auf.

Nachdem die Zellen etwa 45 Minuten in der Blockierungslösung inkubiert wurden, pelletieren Sie diese durch Zentrifugation, aspirieren die Lösung ab und resuspendieren die Zellen in der Primärantikörperlösung. Zum Nachweis unspezifischer Bindung und als Hintergrundkontrolle ist es am besten, mindestens eine Probe als negative Kontrolle beizubehalten, der kein Primärantikörper hinzugefügt wird und die lediglich in PBS resuspendiert ist.

Alle Proben werden etwa eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Falls gewünscht, können fixierte Zellen über Nacht in der primären Antikörperlösung in Suspension belassen und anschließend zweimal mit der Blockierungslösung gewaschen werden. Die sekundäre Antikörperlösung kann während des Waschvorgangs vorbereitet werden.

Sekundäre Antikörper sind in der Regel lichtempfindlich. Dimmen Sie daher nach Möglichkeit das Laborlicht und bedecken Sie alle verwendeten Behälter mit Aluminiumfolie, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern. Antifa-Reagenzien können in das Protokoll integriert werden, müssen jedoch vorsichtig eingesetzt werden, da sie ein höheres Hintergrundsignal verursachen können, ähnlich wie ein primärer Antikörper, der in der empfohlenen Konzentration in der Blockierungslösung verdünnt ist. Geben Sie nach Abschluss der Waschschritte eine Vis auf alle Proben, unabhängig davon, ob ein primärer Antikörper hinzugefügt wurde.

Lassen Sie dies etwa eine Stunde lang an einem dunklen Ort, beispielsweise in einem Gefäß, stehen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit je einem ml Blockierungslösung. Die Zellen sollten nun bereit sein für die Kernfärbung mit DPI-Farbstoff.

Bereiten Sie die DPI-Lösung zunächst in einer Verdünnung von 1 zu 10.000 in PBS vor, waschen Sie die Zellen einmal mit einem ml PBS, dann resuspendieren Sie sie in DPI und lassen Sie sie etwa fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Wie der sekundäre Antikörper ist DAPI lichtempfindlich, treffen Sie daher die erforderlichen Maßnahmen, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern. Waschen Sie einmal mit einem ml PBS und resuspendieren Sie abschließend erneut.

Suspendieren Sie erneut in einem ml PBS. Die Suspension sollte nun gebrauchsfertig für eine Zytospin-Vorrichtung sein. Geben Sie maximal 100 Mikroliter der Einzelzelllösung in die Spitze der Mikropipettenspitzen.

Es wird jedoch eine geringere Menge empfohlen, um ein unnötiges Überlaufen oder Tropfen zu vermeiden. Anschließend stellen Sie die Zytospin-Vorrichtung und das Gegengewicht in eine Tischzentrifuge und zentrifugieren sie vier Minuten lang bei 1000 U/min. Danach nehmen Sie die Zytospin-Vorrichtung vorsichtig auseinander, wobei Sie darauf achten, die Ablösung der Zellen vom Objektträger so weit wie möglich zu vermeiden.

Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, ob das Stehenlassen stattgefunden hat, bevor Sie montieren. Dies sind Aufnahmen einer monolayerartigen Anordnung von BG-one-V-Zellen, die mit SSCA-vier-Zelloberflächenmarkern aus der Zytospin-Vorrichtung gefärbt wurden. Beachten Sie, wie isoliert die Zellen voneinander sind, was Einzelzellbeobachtungen und -aufzeichnungen ermöglicht.

Was an diesem Protokoll vorteilhaft ist, ist die Möglichkeit, eine einlagige Zellschicht zu erzeugen, die praktikabel, kosteneffizient und leicht an jede routinemäßige Analyse von Stammzellkulturen anpassbar ist. Ich hoffe daher, dass Sie aus diesem Video Nutzen ziehen und das Protokoll für Ihre eigene Forschung verwenden können.