Name: Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie die immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit einem selbstgebauten Cytospin-Apparat. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die zuverlässige Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern.

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Teilfinanzierung für diese Arbeit wurde von der NSF-CAREER 0744556 (Rao) und ein Stipendium durch die VCU-HHMI Science Education und Research Program (Pascual) zur Verfügung gestellt.

Teil 1: Die Aussetzung immunzytochemische Färbung <ol><li> Die Zellen werden in einer einzigen Zellsuspension geerntet. </li><li> Die Zellen werden dann in 1,5-2ml Reaktionsgefäße überführt und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten. </li><li> Die Zellen werden durch Absaugen aus Überstand gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert - (ohne Mg 2 + und Ca 2 +) und dann wieder bei 200g für 4 Minuten zentrifugiert. Dies sollte zweimal durchgeführt werden. </li><li> Nach dem Waschen werden die Zellen dann durch Resuspendieren sie in 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixiert. </li><li> Die Zellen werden erneut zweimal mit 1 ml PBS gewaschen -. </li><li> Nach dem Waschen, Block-Zellen durch Resuspendieren sie in 1-ml-Block-Lösung (6% serum/94% PBS -). Inkubieren diese bei Raumtemperatur für 45 Minuten. </li><li> Nach, Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten und saugen aus Block-Lösung. Re-suspend-Zellen in 1 ml des primären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung). Die Zellen können entweder bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder bei 4 ° C über Nacht, bevor Sie den nächsten Schritt inkubiert werden. </li><li> Die Zellen werden dann zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen. </li><li> Nach, resuspendieren Zellen in 1 ml des sekundären Antikörper-Lösung (hergestellt mit Block-Lösung in der empfohlenen Verdünnung) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Nach 1 Stunde, sollten die Zellen dann wieder zweimal mit 1 ml Block-Lösung gewaschen. </li><li> Nach dem Waschen mit Block-Lösung, waschen Sie die Zellen wieder mit 1ml PBS -. </li><li> Nach den verschiedenen Waschungen wieder auszusetzen Zellen in 1ml von DAPI Kernfärbung (1:10000 Verdünnung von DAPI in PBS -) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten. </li><li> Nach 5 Minuten Zentrifugenröhrchen bei 200g für 4 Minuten. Saugen Sie die DAPI Kernfärbung Lösung und resuspendieren Zellen in 1 ml PBS -. </li></ol> Teil 2: Der Einbau von hPSCs in gleitet durch Zytospin Vorrichtung erzeugt <ol><li> Kunststoff Folien sind, indem sie die gewünschte Menge Löcher in ihnen mit einer Bohrmaschine vorbereitet. Der Durchmesser muss in den meisten 1mm größer als der größte Durchmesser der Mikropipette Spitze (n) verwendet werden. </li><li> Filterpapier ist es, die Parameter der Kunststoff-Objektträger mit der Schere geschnitten. </li><li> Die Löcher werden dann in den Filter-Papier. Die Größe der Bohrung (en) sollte groß genug sein, dass die Mikropipette Spitze (n) snuggly passt durch. </li><li> Nach einer der vorbereiteten Folien aus Kunststoff ist auf der Oberseite und einem Glasträger in an der Unterseite des Schnittes Filterpapier (Abbildung 1) platziert. Die Schichten sind mit Klebeband befestigt. </li><li> Es können maximal 100 &amp;mgr; (abhängig von der gewünschten Monoschicht Dichte) der angefärbten Zellsuspension aus Teil 1 wird dann in der Spitze der Mikropipette Spitze (n) platziert. </li><li> Falls erforderlich, kann das Gerät mit Zell-Lösung gewogen und ein Gegengewicht von ähnlichem Gewicht geschaffen. </li><li> Die Zytospin Apparate und Gegengewicht können, sind dann in einem Desktop-Zentrifuge gegeben und zentrifugiert bei 200g für 4 Minuten. </li><li> Nach dem Zentrifugieren wird die Zytospin Apparat sorgfältig in einer Weise, verdrängen die Zellen aus dem Glasträger doesnt demontiert. </li><li> Wenn nötig, überschüssige umliegenden PBS - auf Glasseite in abgesaugte. </li><li> Die Zellen können dann eine Anzeige mit einem Fluoreszenz-Mikroskop zu überprüfen, ob die gewünschte Zellmonolayer erreicht worden ist. </li></ol> Teil 3: Anschluss Dias <ol><li> Ein Tropfen der gewünschten Montage Medien direkt in der Mitte jeder Bereich mit mehreren Zellen gelegt. </li><li> Nach, ist ein Deckglas vorsichtig auf die Dias versucht, um Luftblasen zu vermeiden, wenn möglich, gesenkt werden. </li><li> Überschüssiges Eindeckmittel wird dann von Dias entfernt. </li><li> Nach, sind die Seiten der Deckgläser mit Nagellack versiegelt. </li><li> Die Folien können in einem dunklen Lagerraum aufbewahrt werden, bis Ergebnisse beobachtet und dokumentiert werden. </li></ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Für die Zwecke unseres Labors, ist ein 35-mm-Schale von Stammzell-Kulturen auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) gewachsen für die immunzytochemische Färbung Verfahren für den Einsatz mit dem Zytospin Apparat zugeteilt. Die Zellen werden dann mit Hilfe von enzymatischen Passagieren gesammelt, die Beseitigung so viel von der MEF-Schicht wie möglich, in einen Ein-Zell-Suspension. Wenn effektiver Stammzellen isoliert von der MEF-Schicht gewünscht wird, kann Kolonien manuell kommissioniert dann verdaut in Suspension. Wen...

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek-Permanox-Kammerobjektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Material für wiederverwendbare Kunststoff-Objektträger</td></tr><tr><td>Superfrost/Plus-Mikroskop-Objektträger, vorgereinigt</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>0,1–10&amp;mu;L Filter-Spitzen</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser für Mikroskopie</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Einbettmedium</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, von Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegen-Serum</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Anti-SSEA-4 monoklonaler Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Primärantikörper für SSEA-4-Färbung</td></tr><tr><td>Ratte-Anti-SSEA-3 monoklonaler Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Primärantikörper für SSEA-3-Färbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Sekundärantikörper für SSEA-4-Färbung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-markiertes Ziege-Anti-Ratte-IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Sekundärantikörper für SSEA-3-Färbung</td></tr><tr><td>DAPI, Dihydrochlorid</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

immunzytochemische analyse von menschlichen pluripotenten stammzellen mit hilfe eines self-made cytospin apparatus

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), dass menschliche embryonale Stammzellen (hES) und der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) enthalten, werden spannende Zellquellen aufgrund ihrer grenzenlosen Selbst-Erneuerung Fähigkeiten und ihr Potenzial, in verschiedenen Zelltypen zu differenzieren. Die pluripotenten Zustand hPSCs ist in der Regel durch Techniken wie qPCR, Immunzytochemie beurteilt und von anderen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In vivo</em&gt; Differenzierung Strategien in verschiedenen Zelltypen. Unter diesen haben immunzytochemische Techniken zur Routine Charakterisierung der undifferenzierten Zustand der hPSCs auf der Analyse der Kandidat intra-und Zell-Oberflächen-Biomarkern entwickelt worden. Angesichts der Tatsache, dass hPSCs als Kolonien, Probleme bei der Quantifizierung der Expression dieser Marker an den einzelnen Zell-Ebene auf einer routinemäßigen entstehen wachsen. Durchflusszytometrie-Analysen dienen dazu, dieses Problem zu lösen, sondern bedürfen Zellzahlen und die Verwendung von Reagenzien, die normalerweise nicht förderlich für die routinemäßige Qualitätskontrolle Beurteilung HPSC Kulturen. So hat die Entwicklung von praktischen und reproduzierbare Mittel zur Schaffung von Monolayer Zellproben mit erhaltener Integrität für Marker Auswertung viele Vorteile in der Stammzellforschung. Diese großen Nutzen immunzytochemische Analyse, weil einzelne Zellen aus dem Monolayer leicht beobachtet werden können und quantifiziert für die Expression spezifischer Marker. Mit diesem Ziel wurde ein self-made Zytospin Apparat konstruiert und optimiert für den Einsatz mit immunzytochemische Färbung. Zwei Zelloberflächen-Marker (SSEA3/SSEA4) Expression wurden in einer Variante BG01 Stammzell-Linie für die Zwecke dieses Protokolls analysiert.

Suspension immunzytochemische Färbung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Zell-Oberflächen-Marker (SSEA-3/SSEA-4) wurde basierend auf der Verwendung einer self-made Zytospin Apparat zu einer Monoschicht von Zellen für die Beobachtung und Quantifizierung erstellen erreicht.

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), zu denen humane embryonale Stammzellen (hESCs) und humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gehören, sind vielversprechende Zellen ...

Hallo, mein Name ist Rick Pasqua, Student im Stem Cell Engineering-Labor an der Abteilung für Chemische und Lebenswissenschaften der Virginia Commonwealth University. In diesem Video zeige ich, wie unser Labor eine kostengünstige, selbstgebaute STO-Spindelvorrichtung verwendet, um eine beobachtbare Monoschicht menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern zu erzeugen. Da viele IMMUNOCHEMISCHE Protokolle für hPSCs angepasst werden, die als Kolonien in Kammerobjektträgern kultiviert werden, können Probleme bei der Charakterisierung der Expression von Biomarkern auf einzelner Zellebene auftreten.Die Anordnung der Zellen in einer einfachen Zellschicht erleichtert nicht nur die visuelle Analyse, sondern möglicherweise auch die Quantifizierung ihres Expressionsniveaus. Der von unseren Laboren verwendete Sinus-Spin-Apparat kann aus Materialien aufgebaut werden, die in den meisten Laboren vorhanden sind, benötigt nur eine kleine Zellprobe und kommt ohne spezifische Reagenzien aus. Noch wichtiger ist, dass er zuverlässig eine Ansammlung einzelner Zellen erzeugt, die zur Beobachtung geeignet sind. Im Folgenden finden Sie einige der benötigten Materiali

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Immunzytochemie ist eine leistungsfähige Methode, um die Präsenz, subzelluläre Lokalisation und relative Häufigkeit eines Antigens von Interesse in kultivierten Zellen zu bestimmen. Dieses Protokoll stellt eine einfach zu folgen Reihe von Schritten, mit denen man Antikörper zu schonen und das Beste aus der eigenen Färbung wird.

Immunzytochemie: Human Neural Stem Cells

Pluripotenten Stammzellen in Suspension wachsende Differenzierung in Embryoidkörpern (EBS). Hier zeigen wir, wie eine hohe Qualität EB Kryoschnitten nützlich für die Untersuchung zellulärer und molekularer Aspekte der Embryogenese zu erhalten, unter Wahrung ihrer Organisation als Aggregate.

Analyse von pluripotenten Stammzellen mit Kryoschnitte von Embryoid Bodies

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von zerebralen Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Humane iPSCs werden dazu angeregt, Embryoidkörper (EBs) zu bilden. Die EBs werden unter Verwendung eines Induktionsmediums über einem Polymergerüst kultiviert, wodurch die Differenzierung in neurale Stammzellen, Vorläuferzellen und unreife Neuronen gefördert wird. Schließlich werden die EBs in eine Matrix eingebettet und in ein Erhaltungsmedium für die Bildung von zerebralen...

Generierung von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten zerebralen Organoiden

Hier präsentieren wir unsere etablierte Methode zur menschlichen Körperzellen in gentechnikfreien menschlichen iPS-Zellen mit Sendai-Virus, das konsequente Ergebnis-und Effizienzsteigerung zeigt neu zu programmieren.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

Die regelmäßige Charakterisierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um die Aufrechterhaltung ihres pluripotenten Zustands zu gewährleisten, ist ein wichtiger Schritt, bevor diese Zellen für andere Anwendungen verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur kleinskaligen Vermehrung von humanen iPSCs, die speziell entwickelt wurde, um ihre einfache und routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie zu ermöglichen.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Lernen Sie die immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit einem selbstgebauten Cytospin-Apparat. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die zuverlässige Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern.

Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

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