Immunzytochemische Analyse von menschlichen pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines Self-Made Cytospin Apparatus

Hallo, mein Name ist Rick Pasqua, Student des Stem Cell Engineering Lab hier am Department of Chemical and Life Sciences an der Virginia Commonwealth University. In diesem Video zeige ich, wie unser Labor eine kostengünstige und selbstgebaute STO-Spin-Apparatur verwendet, um eine beobachtbare Monoschicht aus menschlichen pluripotenten Stammzellen für die Quantifizierung von Zelloberflächenmarkern zu erzeugen. Angesichts der Tatsache, dass viele IMMUNOCHEMISCHE Protokolle für h PSCs angepasst sind, die in Kammerobjektträgern als Kolonien gezüchtet werden, kann es zu Problemen bei der Charakterisierung der Expression der Biomarker auf der Ebene der einzelnen Zellen kommen.

Die Tatsache, dass sich die Zellen in einer Monoschicht befinden, hilft nicht nur bei der visuellen Analyse dieser Zellen, sondern möglicherweise auch bei der Quantifizierung ihrer Expression. Die Sinus-Spin-Apparatur, die unsere Labore verwenden, kann aus Materialien konstruiert werden, die in den meisten Labors zu finden sind, erfordert nur eine kleine Zellprobe und benötigt keine Art von spezifischem Reagenz. Und was noch wichtiger ist, es ist in der Lage, eine Ausbreitung einzelner Zellen für die Beobachtung zuverlässig zu reproduzieren. Hier sind einige der Dinge, die Sie benötigen, um den Cytosin-Apparat zu konstruieren.

Kunststoff-Objektträger, da diese nicht unbedingt sauber sein müssen, können Sie auf Wunsch auch alte Kammer-Objektträger verwenden. Vorgereinigte Objektträger. Diese müssen gereinigt werden, da hier die Zellmonoschicht entsteht.

Filterpapier, Jede Art sollte es tun, und Mikropipettenspitzen. Ein bis 10 Mikroliter Spitzen sind das, was unser Labor verwendet, bevor mit dem Bau begonnen werden kann. Zuerst sollten Löcher in die Kunststoffrutschen gebohrt werden.

Dies kann mit einer Bohrmaschine erfolgen. Der Durchmesser der Löcher hängt von der Größe der Mikropipettenspitze ab und sollte etwa der Breite des breitesten Abschnitts der Spitze entsprechen, der für eine Standard-Mikropipettenspitze von ein bis 10 Mikropipetten verwendet wird. Dieser sollte bei etwa sieben Millimetern liegen.

Die Anzahl der Löcher, die Sie in die Kunststoffrutschen bohren, hängt ganz von Ihrem Verwendungszweck ab. Für die immunchemische Färbung unseres Labors verwenden wir beispielsweise in der Regel zwei Löcher, eines für die positive Färbung und das andere für die negative Hintergrundkontrolle. Diese Folien können unbegrenzt oft wiederverwendet werden.

Für das Filterpapier schneiden Sie einfach ein Stück davon zu den Parametern des Kunststoffobjektträgers aus. Verwenden Sie die Löcher des Objektträgers als Referenz für das Bohren von Löchern auf dem Filterpapier. Die Größe des Lochs auf dem Filterpapier sollte groß genug sein, damit die Mikropipettenspitze genau wie hier gezeigt anliegt.

Dann müssen wir die entsprechende Anzahl von Mikropipettenspitzen ausschneiden, eine für jedes Loch bei etwa der Hälfte seiner Länge. Dies dient als Basis des Glasobjektträgers, auf dem die zelluläre Monoschicht erstellt wird. Als nächstes wird das Filterpapier darauf gelegt.

Das Filterpapier dient dazu, das überschüssige Medium aus der Suspensionsfärbung zu absorbieren. Abgerundet wird dies dann durch die Kunststoffrutsche, die als feste Stütze des Geräts dient. Dieses kann dann an allen vier Seiten mit normalem Haushaltsklebeband abgedichtet werden.

Schließlich werden dann ganze Mikropipettenspitzen in die geschnittenen Spitzen des Geräts eingeführt. Dies wird der Ort sein, an dem die zellulären Proben nach der Suspensionsfärbung platziert werden. Es kann auch hilfreich sein, zunächst zu markieren, wo sich die Schnittspitzen auf dem Objektträger befinden, um eine bessere Erkennung zu ermöglichen.

Das in unserem Labor verwendete Protokoll zur Färbung immunchemischer Suspensionen beinhaltet die erste Ernte von Stammzellen in eine Einzelzellsuspension, die in der Regel durch enzymatisches Ing unter Verwendung von Trypsin oder nicht-enzymatischen EDTA-basierten Zelldissoziationspuffern erfolgt. Die Zellen werden dann auf zwei ml Mikrozentrifugenröhrchen und ihr Standard-Wachstumsmedium überführt. Diese werden dann vier Minuten lang bei 200 g zentrifugiert.

Für alle nachfolgenden Wasch- und Schleuderschritte wird die gleiche Zentrifugationsgeschwindigkeit verwendet. Das Medium wird dann manuell abgesaugt, seien Sie beim Ansaugen besonders vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Zellpellet ungestört bleibt. Diese wird dann mit einem ml PBS gewaschen, wobei jedes Mal zweimal heruntergeschleudert und abgesaugt wird.

Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen mit 4%-Paar-Formaldehyd- oder PFA-Reagenzien zu fixieren, die für die Herstellung benötigt werden oder in der begleitenden Beschreibung für dieses Video aufgeführt sind. Die Zellen werden in der 4%-Paar-Formaldehydlösung inkubiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen. Es wird empfohlen, dass dieser Schritt vor der ex-extrazellulären Suspension, Färbung für die Verwendung der Zytospin-Vorrichtung, durchgeführt wird.

Anschließend werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um Spuren des PFA zu entfernen. Anschließend sollte die Zelle verstopft werden, um eine unspezifische Färbung zu verhindern. Nach den PBS-Waschungen im vorherigen Schritt aspirieren Sie die Wäsche und fügen Sie einen ml der Blockierungslösung hinzu.

Diese sollte dann ca. 45 Minuten bei Raumtemperatur belassen werden. Während Sie auf die Blockierungslösung warten, können Sie den Primärantikörper vorbereiten, indem Sie ihn auf die empfohlene Verdünnungs- und Blockierungslösung verdünnen. Lagern Sie diesen bei vier Grad Celsius.

Nachdem sich die Zellen etwa 45 Minuten lang in der Blockierungslösung befunden haben, wird diese heruntergeschleudert und in der primären Antikörperlösung erneut suspendiert. Zum Nachweis unspezifischer Bindungen und zur Hintergrundkontrolle ist es am besten, mindestens eine Probe als negativ aufzubewahren. Wurden in keinem primären Antikörper angewendet und ist einfach in PBS suspendiert.

Alle Proben werden etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur gelagert. Falls gewünscht, können fixierte Zellen über Nacht in der primären Antikörperlösung in Suspension gelassen und zweimal mit Blocklösung gewaschen werden. Die sekundäre Antikörperlösung kann während des Waschens hergestellt werden.

Sekundäre Antikörper sind in der Regel lichtempfindlich, daher dimmen Sie nach Möglichkeit das Laborlicht und decken Sie alle verwendeten Behälter mit Aluminiumfolie ab, um ein Fluoreszenzbleichen zu verhindern. Antifa-Reagenzien können in das Protokoll aufgenommen werden, aber bei ihrer Verwendung ist Vorsicht geboten, da dies zu einem höheren Hintergrund führen kann, als wenn der primäre Antikörper auf die empfohlene Konzentration in der Blockierungslösung verdünnt wird. Tragen Sie ein Visier auf alle Proben auf, unabhängig davon, ob ihnen nach Beendigung des Waschvorgangs Primärproben zugesetzt wurden oder nicht.

Lassen Sie dies an einem dunklen Ort, z. B. in einem Glas, etwa eine Stunde lang stehen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem ml Blockierungslösung. Die Zelle sollte nun bereit für die Kernfärbung mit DPI-Farbstoff sein.

Bereiten Sie die DPI-Lösung zunächst in einer Verdünnung von 1 bis 10.000 in PBS vor, waschen Sie die Zellen einmal in einem ml PBS, reanimieren Sie sie dann, suspendieren Sie sie in dpi und lassen Sie sie etwa fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Wie der Sekundärantikörper ist DAPI lichtempfindlich, nehmen Sie also die notwendigen Anpassungen vor, um Fluoreszenz und Bleichen zu verhindern. Einmal mit einem ml PBS waschen und zum Schluss reusen.

Erneut in einem ml PBS suspendieren. Diese sollte dann für die Verwendung mit einer Zytospin-Apparatur bereit sein. Geben Sie maximal 100 Mikroliter der Einzelzelllösung in die Oberseite der Mikropipetuptierspitzen.

Es wird jedoch eine geringere Menge empfohlen, um unnötiges Überlaufen oder Nachtropfen zu vermeiden. Danach. Legen Sie eine Zytospinnapparatur und das Gegengewicht in eine Tischzentrifuge und drehen Sie sie vier Minuten lang mit 1000 U/min herunter. Zerlegen Sie anschließend die Zytospin-Apparatur vorsichtig so, dass die Wahrscheinlichkeit einer Ablösung der Zellen vom Objektträger minimiert wird.

Vergewissern Sie sich, dass das Stehen unter dem Fluoreszenzmikroskop stattgefunden hat, bevor Sie montieren. Dies sind Bilder, die von einer Monoschicht einer BG-Ein-V-Zelle aufgenommen wurden, die mit SSCA-Vierzell-Oberflächenmarkern aus dem Zytospin-Apparat gefärbt wurde. Beachten Sie, wie isoliert die Zellen voneinander sind, was Beobachtungen und Aufzeichnungen einzelner Zellen ermöglicht.

Das Gute an diesem Protokoll ist, dass es in der Lage ist, Monolayer-Zellen zu reproduzieren, die machbar, kostengünstig und leicht anpassbar für jede Routineanalyse von Stammzellkulturen sind. Damit hoffe ich, dass Sie dieses Video zeichnen und das Protokoll der Verwendung in Ihrer eigenen Forschung finden.