Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein chronisch mit Salmonellen infiziertes Mausmodell zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Salmonellenlösung hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Mäuse mit Streptomycin zu versorgen, gefolgt von Salmonellen oder nur mit Streptomycin.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Salmonellen aus Fäkalien von Mäusen zu isolieren und Salmonelleninfektionen im Darm von Mäusen mit Hilfe von BL-Chroma-Platten nachzuweisen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Körpermasse der Maus zu beobachten und aufzuzeichnen und Veränderungen der Vitalität nach einer Salmonelleninfektion zu notieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass eine Infektion mit Salmonellen im Darm von Mäusen mit Salmonellen etabliert werden kann.

Hallo, ich bin Michelle P aus dem Labor von Dr. Johnson in der medizinischen Abteilung der University of Rochester. Ich bin auch aus dem Sun Lab und ich bin Y aus dem Sun Lab. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Etablierung des Alytic Lennar-infizierten Massenmodells.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserer Arbeit, um die Interaktion von Wirtsbakterien, die Signaltransduktion und die Tumorgenese zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Bereiten Sie vor dem Experimentieren genügend Luria-, Berti- oder LB-Brühplatten für jeden Salmonellenstamm vor und verwenden Sie sie während des gesamten Experiments.

Die Platten können gekühlt und mehrere Monate gelagert werden. Bereiten Sie als Nächstes die Salmonellenkultur vor. Nehmen Sie ein Fläschchen mit bei minus 80 Grad Celsius eingefrorenen Salmonellen heraus und lassen Sie es auf der Arbeitsplatte auftauen, um die Salmonellenflamme zu füllen.

Eine Impfschlaufe in ein Brötchen stecken und verbrennen und in den aufgetauten Bakterienfond eintauchen. Mache die Schlaufe im Zickzack auf dem oberen Drittel der LB-Platte hin und her. Flammen Sie die Schlaufe erneut und drehen Sie die Platte.

Führe die Schlaufe im Zickzack durch, um die vorherigen Streifen zu kreuzen und die Bakterien über das zweite Drittel der Platte zu verteilen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. Die Schlaufe erneut abflammen.

Lassen Sie die Schlaufe nicht in den Agar eindringen. Lassen Sie die Bienenvölker wachsen, indem Sie die Platten über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator lagern. Wenn es richtig gemacht wird, sollte die Salmonellenplatte einzelne Kolonien in mindestens einem Abschnitt ergeben.

Am nächsten Tag. Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Bakterienschlaufe einen Klon aus der LB-Platte und geben Sie ihn in sieben Milliliter LB in ein 12-Milliliter-Röhrchen. Schütteln Sie die Tube bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Stunden.

Verwenden Sie 0,05 Milliliter dieser Kultur zum Impfen. 50 Milliliter LB in einem Falcon-Röhrchen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für etwa 18 Stunden.

Schleudern Sie die 50 Milliliter große bakterielle Übernachtkultur bei Raumtemperatur bei 5.000 U/min für 10 Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie als Nächstes 1,5 Milliliter Hanks gepufferte Salzlösung oder HBSS in das Röhrchen, um die Bakterien zu resuspendieren, oder 100 Teile lb bis drei Teile HBSS. Bringen Sie dann das Gesamtvolumen mit HBSS oder einem Verhältnis von LB zu HBSS von eins zu 10 auf 15 Milliliter

Jede Maus benötigt 100 Mikroliter verdünnte Salmonellenkultur oder zwischen eins mal 10 bis sechs bis sechs mal 10 bis acht koloniebildenden Einheiten, bevor sie vier Stunden vor dem Versuch mit der Entnahme von Wasser und Nahrung von Mäusen beginnt. Bereiten Sie dann unmittelbar vor der Sonde eine Lösung von Streptomycin vor, indem Sie 7,5 Milligramm pulverisiertes Streptomycin in 100 Mikroliter HBSS verdünnen. Stellen Sie sicher, dass Sie für jede injizierte Maus ein zusätzliches Volumen vorbereiten, um den Verlust vor der Mausmöge auszugleichen.

Bereiten Sie zunächst eine Zuführnadel mit 100 Mikrolitern Streptomycin-Lösung vor. Nehmen Sie die erste Maus aus dem Käfig, um die Sonde zu erhalten, und halten Sie die Maus mit dem Gesicht zur Tischplatte. Fassen Sie die Haut über der Mausschulter fest mit Daumen und Mittelfinger und strecken Sie Kopf und Hals mit dem Zeigefinger, um die Speiseröhre gerade zu machen.

Richten Sie die Kugelspitze der Fütterungsnadel entlang des Gaumens und auf die rechte Seite des hinteren Teils des Rachens. Geben Sie es dann vorsichtig in die Speiseröhre und injizieren Sie die 100 Mikroliter Streptomycin-Lösung. Es sollte kein Widerstand zu spüren sein.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Versuchs- und Kontrollmäuse, die sich in Versuchen befinden. Nach etwa 20 Stunden nach der Strp de m und der Sonde und vier Stunden vor der Salmonellensonde ist bei Mäusen, die eine Salmonellensonde oral erhalten, Wasser und Futter zu entziehen. Versorgen Sie jede Maus auf die gleiche Weise wie zuvor mit 100 Mikrolitern Salmonellenlösung in HBSS.

Setzen Sie nach der Sonde jede Maus in einen neuen Käfig um, um mit der Kotsammlung zu beginnen. Beginnen Sie etwa acht Stunden nach der Sonde und entfernen Sie die Fäkalien sofort nach dem Abtropfen aus dem Käfig. Sammeln Sie 100 Milligramm Fäkalien von Mäusen als Versuchsprobe.

Entnehmen Sie je nach Studiendauer täglich oder wöchentlich Proben für die Analyse von Fäkalien-Salmonellen. Übertragen Sie die Stuhlprobe mit einem Milliliter PBS in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 800 U/min kräftig. Den Überstand fünf Minuten lang in eine saubere 1,5-Milliliter-Röhrchenzentrifuge bei 6.000 U/min überführen.

Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter PBS zum Pelletswirbel hinzu, um ihn zu resuspendieren. Erkennen Sie als Nächstes Salmonellen mit einer BB l Roag-Platte. Verwenden Sie 10 bis 100 Mikroliter Fäkalienlösung pro Platte, die Sie auf der Platte verteilen, wie in Abschnitt zwei gezeigt.

Die Salmonellenarten erscheinen aufgrund von Stoffwechselunterschieden in Gegenwart ausgewählter Chromogene farbig gefärbt. Zählen Sie die Salmonellenkolonien auf dem Teller, um das Ausmaß der Infektion zwischen einzelnen Mäusen zu vergleichen. In diesem experimentellen Verfahren verwendeten wir spezifische, pathogenfreie weibliche C 57 schwarze sechs Mäuse, die sechs bis sieben Wochen alt waren.

Die Mäuse wurden mit Salmonellen und Streptomycin plus HBSS infiziert. Zu den verwendeten Salmonellenstämmen gehören Salmonella typhimurium Wildtyp-Stamm A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, nicht-pathogener Salmonellenmutantenstamm und drei FPC-Stämme aus dem Labor von Dr. James Madera, die das Virulenz-assoziierte AAV R-Altersgen in PSKW 29 tragen, Plasmid mit niedriger Kopie. Mit Hilfe dieses Protokolls kann eine tyrische Salmonellenbesiedlung im Darm der Maus nachgewiesen werden.

Die chronische Salmonelleninfektion wurde durch Stuhlanalyse gemessen, und es wurden Körpergewichts- und Darmgewebeproben für die Immunfluoreszenzfärbung entnommen. In der Regel treten Körpergewichtsverlust und Tod innerhalb von vier Wochen nach der Infektion auf. Hier sind die Überlebensanteile vier Wochen nach der Infektion dargestellt.

Sobald die Mäuse vier Wochen nach der Infektion überleben, nehmen die Mäuse an Körpergewicht zu und die Todesfälle nehmen in den verbleibenden 23 Wochen ab. Insgesamt infizierten sich über 65 % der Mäuse mit Salmonellenstämmen, FSY fsy, A VRA null oder fsy. Ein VRA-Heterozygot kann bei einer persistierenden Salmonelleninfektion im Darm über sechs Monate überleben.

Nach der akuten Infektion trugen die Überlebenden immer noch Salmonellen, die sechs Monate nach der Infektion mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode nachgewiesen werden konnten. Immunfluoreszenzanalysen von Gewebeproben aus dem Darm von Mäusen zeigen die Invasion von Salmonellen in die Darmschleimhaut 27 Wochen nach der Infektion. In diesem Bild sind die Zellkerne blau gefärbt und die befallenen Salmonellen grün dargestellt.

Wie in der Kontrollgruppe gezeigt, gibt es keine hellgrüne Färbung, was auf keine Salmonellenbesiedlung hinweist. Während bei den mit Salmonellen infizierten Mäusen 27 Wochen nach der Infektion eine hellgrüne Färbung in der Darmschleimhaut zu sehen ist. Dies zeigt die Persistenz der Salmonelleninfektion bei der Streptomycin-vorbehandelten Maus.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine chronische Infektion einiger im Mausmodell induziert. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Kultur frisch für die Garage vorzubereiten, die Garagenfähigkeiten zu korrigieren und das Vorhandensein von ANA zu erkennen, um sicherzustellen, dass Ihr Experimentmodell funktioniert. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.