Name: Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Etablierung eines chronischen Salmonella-Infektionsmodells bei Mäusen zur Untersuchung persistierender Darmkolonisation über 27 Wochen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde von der NIDDK KO1 DK075386 gewähren und die American Cancer Society RSG-09-075 bis 01-MBC bis Jun Sun unterstützt.

Dieses Protokoll umfasst drei Teile: Bakterienkultur, Maus Magensonde und Nachweis von Salmonellen. 1. Salmonella Wachstum Zustand. <ol><li> Bereiten Sie die Salmonella Luria-Bertani Broth (LB)-Platte, bei 37 ° C über Nacht inkubieren. </li><li> Wählen Sie einen Klon aus der LB-Platte und in 7 ml LB in einer 12 ml-Tube, und schütteln bei 37 ° C für ca. 5 Stunden. </li><li> Inoculate 50 ml LB mit 0,05 ml einer stationären Phase der Kultur und bei 37 ° C ohne Schütteln für etwa 18 Stunden. </li><li> Spin Nacht Bakterienkultur bei Raumtemperatur mit 6000 rpm für 10 Minuten auszusetzen, die Bakterien in HBSS mit Verhältnis 100:3 (LB: HBSS). Zum Beispiel: Jede 50 ml LB-Kultur wird in 1,5 ml HBSS suspendiert werden. </li><li> Für das Tier Magensonde weiter verdünnen, der Bakterienkultur bei 1:10-Verhältnis. Zum Beispiel: Jede 1,5 ml LB-Kultur wird in 15 ml HBSS suspendiert werden. </li></ol> 2. Salmonellen-Infektion Modell *. <ol><li> Bereiten Sie den Streptomycin-Lösung. Jede Maus wird 7,5 mg Streptomycin in 100 ul HBSS gegeben werden. Zum Beispiel, bereiten insgesamt 90 mg Streptomycin in 1,2 ml HBSS für 10 Mäuse. Immer etwas mehr Volumen bei der Vorbereitung des Streptomycin-Lösung. </li><li> Ziehen Sie Wasser und Essen 4 Stunden vor orale Gabe Behandlung. </li><li> Gavage Mäuse mit Streptomycin mit 7,5 mg Streptomycin (100 ul HBSS für Kontroll-Mäuse). Besorgen Sie sich die Haut über der Maus Schulter fest mit dem Daumen und Mittelfinger, strecken den Kopf und Hals mit dem Zeigefinger an der Speiseröhre gerade machen. Richten Sie die Kugel-Spitze der Fütterung Nadel auf dem Dach des Mundes und auf der rechten Seite der Rückseite des Rachens, dann vorsichtig Pass hinunter in die Speiseröhre und injizieren Sie die 100 ul Lösung. Kein Widerstand sollte zu spüren sein. </li><li> Bei 20 Stunden nach der Streptomycin-Behandlung, zurückgezogen Wasser und Nahrung wieder, bevor die Mäuse mit Bakterien infiziert sind. </li><li> Gavage jeder Maus mit 100 ul Suspension in HBSS behandelt oder mit sterilem HBSS (Kontrolle) durch orale Gabe. Die Magensonde Verfahren ist das gleiche wie 2,3) Magensonde Mäuse mit Streptomycin. </li></ol> * Tierversuche wurden unter Verwendung spezifischer-Pathogen-freien weibliche C57BL / 6 Mäuse (Taconic, Hudson, NY), die 6-7 Wochen alt waren wie zuvor 1 beschrieben durchgeführt. Das Protokoll wurde von der University of Rochester University Committee on Animal Resources (UCAR) zugelassen. 3. Nachweis von Salmonellen in Darm. <ol><li> Sammeln Sie mit der Maus Kot (ca. 100 mg). </li><li> Transfer Stuhlprobe in ein 1,5 Mikro-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS und kräftig vortexen. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation bei 6000 rpm für 5min. Überstand wird verworfen und 200 ul PBS ist es, die Pellets zugegeben und gevortext. </li><li> Streak die 200 ul PBS mit einem Einweg-Zell-Streuer auf einer BBL CHROMagar Platte Salmonellen zu erkennen. Salmonellen erscheinen mauve (rosa bis violett, siehe Abb.1). Wenn 200 ul liefert zu viele Kolonien auf der Platte, verwenden Sie 100 ul oder 50 ul für den Streifen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse. Wenn das Protokoll korrekt geschehen ist, kann Salmonella typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm mehr als 6 Monaten nachgewiesen werden. Salmonellen könnten durch fäkale Kultur über 6 Monate (Abb. 1) festgestellt werden. Als typisches aus diesem Modell kommen, wiegen Körper Verlust und Tod auftreten innerhalb von 4 Wochen nach der Infektion. Abhängig von der Salmonella-Stämme zur Infektion verwendet, können einige Mäuse nicht mehr als 6 Monate überleben. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Intestinal Salmonellen in der Salmonella-Spezies erscheinen mauve (rosa bis violett) in Farbe, durch metabolische Unterschiede in der Gegenwart von ausgewählten Chromogene. Andere Bakterien sind entweder gehemmt oder produzieren blau-grüne oder farblose Kolonien. <img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Survival-Anteile von Mäusen mit Salmonella Mutante PhoP c, c PhoP infiziert Avra-und PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra für 4 Wochen (28 Tage). Tabelle 1. Körpergewicht von Mäusen mit Salmonella für 4 Wochen infiziert. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 0 </td><td> 1 Woche </td><td> 2 Wochen </td><td> 3 Wochen </td><td> 4 Wochen </td></tr><tr><td> Kontrolle </td><td> 16,78 ± 1,05 </td><td> 16,91 ± 1,28 </td><td> 18,26 ± 1,23 </td><td> 19,31 ± 1,26 </td><td> 20,26 ± 1,15 </td></tr><tr><td> PhoP c </td> 16,89 ± 1,03 <td> 17,14 ± 1,19 </td><td> 17,43 ± 1,63 * </td><td> 18,68 ± 1,78 </td><td> 20,05 ± 1,11 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> 16,91 ± 1,12 </td><td> 16,96 ± 1,39 </td><td> 17,06 ± 2,14 ** </td><td> 18,71 ± 2,18 </td><td> 20,15 ± 1,56 </td></tr><tr><td> PhoP c AvrA-/AvrA + </td><td> 16,94 ± 0,96 </td><td> 17,17 ± 1,02 </td><td> 17,63 ± 1,42 * </td><td> 18,44 ± 2,03 </td><td> 20,09 ± 1,17 </td></tr></tbody></table> * Im Vergleich zu der Kontrollgruppe p &lt;0,05 ** Im Vergleich zu Gruppe p &lt;0,01 Kontrolle Tabelle 2. Salmonella-Stämme in dieser Studie verwendet. <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Beschreibung </td><td> Referenz oder Quelle </td></tr><tr><td> Salmonella 14028s </td><td> Wild-Typ S. typhimurium </td><td> ATCC </td></tr><tr><td> PhoP c </td><td> Non-pathogenen Komplexes Regulator-Mutanten </td><td> Miller et al., 1990 </td></tr><tr><td> PhoP c Avra- </td><td> Avra-Mutation </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr><tr><td> PhoP c AvrA-/AvrA + </td><td> PhoP c Avra-mit ergänzt Plasmid kodiert Avra </td><td> Collier-Hyams et al., 2002 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Zur Nutzung dieses Systems ist es notwendig, für den Forscher lernen, wie man die Tiere eine Magensonde. Wir Detail eine Methodik für die Vorbereitung Bakterienkultur und Magensonde die Mäuse. Wir zeigen auch, wie die Salmonellen Persistenz im Magen-Darm (GI-Trakt) zu überwachen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll einschließlich: <ol><li> Streptomycin-Vorbehandlung: Streptomycin-Vorbehandlung loswerden könnte einige kommensalen Darmflora und machen die Mäuse anfällig für die Infektion mit Salmo...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani-Brühe</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Fütterungsnadel</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Zellverteiler</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

chronisch salmonellen infected maus-modell

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Die bakterielle Infektion Mausmodell ist ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung von Bereichen wie Infektion, Entzündung, Immunologie, Signaltransduktion und Tumorgenese. Viele Forscher haben den Vorteil der Colitis induziert durch genommen<em&gt; Salmonellen</em&gt; Typhimurium für die Studien über die frühe Phase der Entzündung und Infektion. Allerdings sind nur wenige Berichte über die chronische Infektion<em&gt; In vivo</em&gt;. Mäuse, die mit<em&gt; Salmonellen</em&gt; Persistent Existenz im Magen-Darm-Trakt erlauben uns, die langfristige Wirt-Bakterien-Interaktion, der Signaltransduktion und Tumorgenese zu erkunden. Wir haben eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit etablierten<em&gt; Salmonellen</em&gt; Typhimurium Kolonisierung in der Maus Darm über 6 Monate. Zur Nutzung dieses Systems ist es notwendig, für den Forscher lernen, wie man die Bakterienkultur vorzubereiten und eine Magensonde den Tieren. Wir Detail eine Methodik für die Vorbereitung Bakterienkultur und eine Magensonde Mäusen. Wir zeigen auch, wie die Erkennung<em&gt; Salmonellen</em&gt; Persistenz im Magen-Darm-Trakt. Insgesamt wird dieses Protokoll Hilfe Forscher mit der bakteriellen Infektion Mausmodell grundlegend wichtig, biologischen und mikrobiologischen Fragen zu beantworten.

Stellen Sie eine chronische bakterielle Infektion Mausmodell mit persistierenden<em&gt; Salmonellen</em&gt; Typhimurium Kolonisation im Darm für 27 Wochen.

Chronisch Salmonellen Infected Maus-Modell

Das bakteriell infizierte Mausmodell ist ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung von Bereichen wie Infektion, Entzündung, Immunologie, Signaltransduktion und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell mit chronischer Salmonelleninfektion zu etablieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Salmonellenlösung hergestellt wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Mäuse entweder mit Streptomycin und anschließend mit Salmonellen oder nur mit Streptomycin zu gavagieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Salmonellen aus dem Fäkalienmaterial von Mäusen zu isolieren und eine Salmonelleninfektion im Darm von Mäusen mithilfe von BL-Chromaplatte zu detektieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Beobachtung und Dokumentation der Körpermasse der Maus sowie die Erfassung von Veränderungen der Vitalität nach einer Salmonelleninfektion. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass eine Infektion mit Salmonellen im Darm von Mäusen, die mittels Gavage mit Salmonellen infiziert wurden, etabliert werden kann.Hallo, ich bin Michelle P aus dem Labor von Dr. Johnson der Abteilung für Innere Medizin an der University of Rochester. Ich komme ebenfalls aus dem Sun-Labor und ich bin Y aus dem Sun-Labor. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Erstellung eines mit Alytic Lennar infizierten Massenmodells zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Signaltransduktion bei der Interaktion zwischen Wirt und Bakterien sowie die Tumorgenese zu untersuchen. Beginnen wir also. Bereiten Sie vor dem Experiment ausreichend Luria-Berti- oder LB-Brüheplatten für jeden Salmonella-Stamm vor und halten Sie diese für den gesamten Versuchsverlauf bereit.Die Platten können gekühlt und mehrere Monate lang gelagert werden. Bereiten Sie anschließend die Salmonella-Kultur vor. Entnehmen Sie ein Gefäß mit der Stammlösung von Salmonella, das bei minus 80 Grad Celsius eingefroren ist, und lassen Sie es auf der Arbeitsfläche auftauen, um Salmonella anzupflanzen.Ein Inokulationsloop in einem Bunsenbrenner erhitzen und in die aufgetaute Bakterienkultur eintauchen. Das Loop im Zickzackmuster hin und her auf dem oberen Drittel der LB-Platte bewegen. Das Loop erneut abbrennen und die Platte drehen.Führen Sie die Schleife im Zickzack, um die vorherigen Striche zu überqueren, und verteilen Sie die Bakterien auf dem zweiten Drittel der Platte. Wiederholen Sie dies einmal mehr. Brennen Sie die Schleife erneut ab.Lassen Sie die Schleife nicht in das Agar eindringen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius, um das Wachstum von Kolonien zu ermöglichen. Bei korrekter Durchführung sollten auf der Salmonellenplatte in mindestens einem Bereich einzelne Kolonien sichtbar sein.Am nächsten Tag einen Klon von der LB-Platte mit einem sterilen Zahnstocher oder Bakterien-Öse aufnehmen und in sieben Milliliter LB in einem 12-Milliliter-Röhrchen geben. Das Röhrchen etwa fünf Stunden bei 37 °C schütteln.Verwenden Sie 0,05 Milliliter dieser Kultur, um 50 Milliliter LB in einem Falcon-Röhrchen zu beimpfen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für etwa 18 Stunden.Zentrifugieren Sie die 50 Milliliter bakterielle Übernachtkultur bei Raumtemperatur mit 5.000 U/min für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie anschließend 1,5 Milliliter Hank’s Buffered Salt Solution oder HBSS in das Röhrchen, um die Bakterien zu resuspendieren, oder verwenden Sie ein Verhältnis von 100 Teilen LB zu drei Teilen HBSS. Anschließend wird das Gesamtvolumen mit HBSS auf 15 Milliliter aufgefüllt oder ein Verhältnis von ein Teil LB zu zehn Teilen HBSS verwendet.Jedes Maus benötigt 100 Mikroliter verdünnte Salmonellenkultur, entsprechend einer Konzentration von ein mal 10 hoch sechs bis ein mal 10 hoch acht koloniebildenden Einheiten, sowie Entzug von Wasser und Futter vier Stunden vor Beginn des Gavagierens. Bereiten Sie unmittelbar vor dem Gavagieren eine Streptomycinlösung zu, indem Sie 7,5 Milligramm Streptomycin-Pulver in 100 Mikroliter HBSS verdünnen. Für jede zu behandelnde Maus sollte zusätzlich etwas Volumen vorbereitet werden, um Verluste vor dem Gavagieren auszugleichen.Bereiten Sie zunächst eine Fütterungssonde mit 100 Mikroliter Streptomycinlösung vor. Entnehmen Sie die erste Maus aus dem Käfig, um die Gavage durchzuführen, und halten Sie die Maus mit dem Gesicht zur Arbeitsfläche hin. Greifen Sie fest mit Daumen und Mittelfinger die Haut über der Schulter der Maus und strecken Sie mit dem Zeigefinger Kopf und Hals, um die Speiseröhre zu begradigen.Leiten Sie die Kugelspitze der Fütterungsnadel entlang des Gaumens in Richtung der rechten Seite des hinteren Pharynx. Führen Sie sie dann vorsichtig in die Speiseröhre ein und injizieren Sie die 100 µL Streptomycinlösung. Es sollte kein Widerstand spürbar sein.Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Versuchs- und Kontrollmäuse, die Experimenten unterzogen werden. Etwa 20 Stunden nach strp de m und Gavage und vier Stunden vor der Gavage mit Salmonellen entziehen Sie den Mäusen, die oral Salmonellen erhalten sollen, Wasser und Futter. Führen Sie bei jeder Maus erneut eine Gavage in der gleichen Weise wie zuvor durch, wobei Sie 100 µL Salmonellenlösung in HBSS verwenden.Nach der Schlundsonde überführen Sie jede Maus in einen neuen Käfig, um die Sammlung der Fäkalien zu beginnen. Beginnend etwa acht Stunden nach der Schlundsonde, entfernen Sie die Fäkalien unmittelbar nach dem Ausscheiden aus dem Käfig. Sammeln Sie 100 Milligramm Mäusefäkalien als Versuchsprobe.Sammlen Sie die Proben je nach Studiendauer täglich oder w&ouml;chentlich f&uuml;r die Analyse von Salmonellen im F&auml;zes. &Uuml;berf&uuml;hren Sie die F&auml;kalprobe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenr&ouml;hrchen mit einem Milliliter PBS und mischen Sie gr&uuml;ndlich durch Vortexen. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 800&nbsp;U/min. &Uuml;berf&uuml;hren Sie den &Uuml;berstand in ein sauberes 1,5-Milliliter-R&ouml;hrchen und zentrifugieren Sie f&uuml;nf Minuten bei 6.000&nbsp;U/min.Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 200 Mikroliter PBS zu den Pellets, um sie durch Vortexen erneut in Suspension zu bringen. Danach weisen Sie Salmonellen mit einer BB-l-Roag-Platte nach. Verwenden Sie 10 bis 100 Mikroliter der Fäkalienlösung pro Platte, die wie in Abschnitt zwei gezeigt auf der Platte verteilt werden.Die Salmonellen-Arten erscheinen aufgrund metabolischer Unterschiede in Gegenwart ausgewählter Chromogene mar gefärbt. Zählen Sie die Kolonien von Salmonellen auf der Platte, um das Infektionsniveau zwischen einzelnen Mäusen zu vergleichen. In diesem experimentellen Verfahren verwendeten wir weibliche, spezifisch pathogenfreie C57BL/6-Mäuse im Alter von sechs bis sieben Wochen.Mäuse wurden mit Salmonella sowie Streptomycin und HBSS infiziert. Die Mäuse erhielten kontrolliert über eine Magensonde Streptomycin allein. Verwendete Salmonella-Stämme umfassten den Salmonella typhimurium Wildtyp-Stamm, ATCC 1 4 0 2 8 S FP C, einen nicht-pathogenen Salmonella-Mutantenstamm sowie drei FPC-Stämme aus dem Labor von Dr. James Madera, die das mit Virulenz assoziierte AAV R age-Gen auf dem Plasmid PSKW 29, einem Plasmid mit geringer Kopienzahl, tragen. Mit diesem Protokoll kann die Kolonisation durch Salmonella tyrian im Darm der Maus nachgewiesen werden.Chronische Salmonelleninfektion wurde durch Analyse von Fäkalien sowie Gewichtsmessung und Sammlung von Darmgewebeproben zur immunfluoreszenten Färbung erfasst. Typischerweise treten Gewichtsverlust und Tod innerhalb von vier Wochen nach der Infektion auf. Die Überlebensanteile vier Wochen nach der Infektion sind hier dargestellt.Sobald die Mäuse vier Wochen nach der Infektion überlebt haben, nehmen sie an Körpergewicht zu und die Todesfälle nehmen in den verbleibenden 23 Wochen ab. Insgesamt überleben mehr als 65 % der mit den Salmonella-Stämmen FSY, fsy, A VRA null oder fsy, A VRA heterozygot infizierten Mäuse länger als sechs Monate bei persistierender Salmonella-Infektion im Darm.Nach der akuten Infektion trugen die Überlebenden weiterhin Salmonellen, die sechs Monate nach der Infektion mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode nachgewiesen werden konnten. Die Immunfluoreszenzanalyse von Gewebeproben aus dem Darm von Mäusen zeigt das Eindringen von Salmonellen in die Darmschleimhaut 27 Wochen nach der Infektion. In diesem Bild sind die Kerne blau angefärbt und die mit Salmonellen infizierten Zellen grün dargestellt.Wie in der Kontrollgruppe gezeigt, gibt es keine leuchtend grüne Färbung, was auf keine Kolonisation mit Salmonellen hinweist. Hingegen ist bei den mit Salmonellen infizierten Mäusen 27 Wochen nach der Infektion eine leuchtend grüne Färbung in der Darmschleimhaut zu beobachten. Dies zeigt die anhaltende Salmonelleninfektion in der mit Streptomycin vorbehandelten Maus.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine chronische Infektion in einem Mausmodell auslöst. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine frische Kultur für die Garage vorzubereiten, die korrekten Garage-Techniken anzuwenden und das Vorhandensein von ANA nachzuweisen, um sicherzustellen, dass Ihr Versuchsmodell funktioniert. Das war's also.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biologie

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