Name: Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Selektion von RNA-Aptameren für Amyloid β-Protein mittels in-vitro-Evolution und Filterbindung. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung spezifischer molekularer Erkennungswerkzeuge für die Alzheimer-Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG030709 von NIH / NIA und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt. Wir erkennen an, Margaret M. Condron für die Peptid-Synthese und Aminosäure-Analyse, Dr. Elizabeth F. Neufeld für die Hilfe und Unterstützung der ersten Schritte des Projekts, Dr. Chi-Hong Chen B. für die Bereitstellung von Unterstützung und Reagenzien und Dr. Andrew D . Ellington für hilfreiche Diskussionen.

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<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
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</ol>

Der Ausgangspunkt des SELEX-Verfahrens ist die Synthese eines zufälligen Oligonukleotid-Bibliothek, die typischerweise 10 12 -10 15 Sequenzen. In DNA SELEX, diese Bibliothek direkt verwendet wird nach einer ssDNA-Pool generiert wird, während in RNA SELEX, hier demonstriert, ist die ssDNA-Bibliothek erst konvertiert, um ein RNA-Pool enzymatisch durch in-vitro-Transkription. Dann wird SELEX iterativ, wobei jeder Zyklus umfasst Belichtung und Bindung von Oligonukleotiden an das beabsichtigte ...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA Biopolymers Laboratory</td><td></td><td>Lyophilisiertes Pulver</td></tr><tr><td>MX5 Automatisierte Mikrowaage</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonbeschichtete 1,6-ml-Röhrchen</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 oder C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Im Abzug verwenden.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Mit dem Vortex mischen, bis die Lösung klar ist. APS wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden.</td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipyridyl)dichlorruthenium(II)-hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Mit dem Vortex mischen, bis die Lösung klar ist. Den RuBpy-Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken, um das Reagenz vor Umgebungslicht zu schützen. RuBpy wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; Desalting-Säulen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Silikonbeschichtete 0,6-ml-Röhrchen</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricin-Gele (10&amp;#8211;20 %)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10-Loch; Mini-Format (8 cm × 8 cm); 25 &amp;#x03BC;l Beladevolumen pro Loch; Trennbereich 5 kDa bis 40 kDa</td></tr><tr><td>Quarzküvette</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 Spektrophotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNA-Bibliothek</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Individuell bestellt</td><td>Die Bibliothek wurde so entworfen, dass sie 49 zufällige Nukleotide enthält, flankiert von zwei konstanten Regionen mit Primer-Bindungs- und Klonierungsstellen: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25 %) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; G TCC GTT CGG GAT CCT C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Rekombinante &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt;-DNA-Polymerase, geliefert mit 10&amp;#215; PCR-Puffer und einem separaten Röhrchen mit 25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; für die Routine-PCR.</td></tr><tr><td>PCR-Nukleotid-Mix, 10 mM Lösung</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Vorwärtsprimer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Individuell bestellt</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Rückwärtsprimer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Individuell bestellt</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Reinigungskit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Kegelförmige, sterile 1,6-ml-Röhrchen mit Deckeln und O-Ringen</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; Large Scale RNA Production System&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>Das Kit enthält: 120 &amp;#x03BC;l Enzym-Mix (RNA-Polymerase, rekombinanter RNasin&amp;#174;-Ribonuklease-Inhibitor und rekombinante anorganische Pyrophosphatase); 240 &amp;#x03BC;l Transkriptions-5×-Puffer; jeweils 100 &amp;#x03BC;l der vier rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-freie DNase, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;l linearisierte Kontroll-DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3 M Natriumacetat (pH 5,2); 1,25 ml nukleasefreies Wasser</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-Cytidin-5&amp;rsquo;-triphosphat, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Spezifische Aktivität: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricin (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Zitronensäuresättigtes Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamylalkohol (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol für die Molekularbiologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK gekühlter Mikrozentrifugen</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 Micro-Säulen</td><td>GE Healthcare</td><td>Erhältlich bei Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Vorgepackt mit Sephadex&amp;#8482; G-50 DNA-Grad und vorgequollen in STE-Puffer mit 0,15 % Kathon als Biozid</td></tr><tr><td>Triathler Tisch-Scintillationszähler</td><td>Hidex Oy, Turku, Finnland</td><td>Triathler LSC Modell: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-Harnstoff-Probenpuffer (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6 % TBE-Harnstoff-Gele, 1,0 mm, 10 Löcher</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-Laufpuffer (5&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Radioaktivitäts-Dekontaminationsmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladepipettenspitzen</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-Cell</td></tr><tr><td>Autoradiographiefilm</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Im vollständigen Dunkeln verwenden</td></tr><tr><td>Autoradiographiefilm, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Kann unter rotem Sicherheitslicht verwendet werden.</td></tr><tr><td>Membranscheiben</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Gemischte Celluloseester, hydrophil, 0,22-&amp;#x03BC;m-Scheibenmembranen</td></tr><tr><td>Glasfritte als Trägerbasis für 125-ml-Flasche</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Petri-Schalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol für die Molekularbiologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter RNase-Inhibitor</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482; Reverse Transkriptionssystem</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter RNase-Inhibitor</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Lade-Farbstoff</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

selektion von aptameren für amyloid β-protein, dem erreger der alzheimer-krankheit

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive, altersabhängig, neurodegenerative Erkrankung mit einer schleichenden Verlauf, dass seine präsymptomatische Diagnose schwierig 1 macht. Definite AD Diagnose ist nur post mortem erreicht und schafft so präsymptomatischen, Früherkennung von AD ist entscheidend für die Entwicklung und Verwaltung von wirksamen Therapien 2,3. Amyloid β-Protein (Aß) ist von zentraler Bedeutung AD Pathogenese. Lösliche, oligomere Aß Baugruppen sind vermutlich Neurotoxizität zugrunde liegende synaptische Dysfunktion und den Untergang der Neuronen in AD 4,5 beeinflussen. Verschiedene Formen von löslichem Aß Baugruppen beschrieben worden, jedoch sind ihre Zusammenhänge und die Relevanz für AD Ätiologie und Pathogenese komplexer und nicht gut verstanden 6. Spezifische molekulare Erkennung Tools können enträtseln die Beziehungen zwischen den Aß Baugruppen und erleichtern Nachweis und die Charakterisierung dieser Baugruppen frühzeitig im Krankheitsverlauf bevor Symptome auftauchen. Die molekulare Erkennung häufigsten beruht auf Antikörpern. Allerdings bietet eine alternative Klasse von molekularen Erkennung Werkzeuge, Aptamere, wichtige Vorteile gegenüber Antikörpern 7,8. Aptamere sind Oligonukleotide durch in-vitro-Selektion: systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX) 9,10. SELEX ist ein iterativer Prozess, der, ähnlich wie die Darwinsche Evolution, ermöglicht die Auswahl, Verstärkung, Bereicherung und Perpetuierung einer Immobilie, zB Avid, spezifische Ligandenbindung (Aptamere) oder katalytische Aktivität (Ribozyme und DNAzyme). Trotz Entstehung von Aptameren als Werkzeuge in der modernen Biotechnologie und Medizin 11, haben sie in den Amyloid-Bereich noch unzureichend genutzt. Wenige RNA oder ssDNA Aptamere gegen verschiedene Formen von Prion-Proteinen (PrP) 12-16 ausgewählt. Ein RNA-Aptamer gegen rekombinantes Rinder-PrP generiert wurde gezeigt, dass Rinder PrP-β 17 zu erkennen, einem löslichen, oligomeren β-Faltblatt-reiche Konformation Variante des full-length PrP, dass Amyloid-Fibrillen 18 bildet. Aptamere generiert mit monomeren und verschiedene Formen der fibrillären β 2-Mikroglobulin (β 2 m) gefunden zu Fibrillen von bestimmten anderen amyloidogene Proteine ​​neben β 2 m Fibrillen 19 zu binden. Ylera et al. beschriebenen RNA-Aptamere gegen immobilisierte monomere Aβ40 20 ausgewählt. Unerwartet dieser Aptamere fibrillären Aβ40 gebunden. Insgesamt lassen diese Daten einige wichtige Fragen. Warum haben Aptamere gegen monomere Proteine ​​ausgewählt erkennen ihre polymeren Formen? Könnte Aptamere gegen monomere und / oder oligomere Formen amyloidogenen Proteinen erreicht werden? Zur Beantwortung dieser Fragen haben wir versucht, Aptamere für kovalent stabilisiert oligomeren Aβ40 21 erzeugt mit photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine ​​(picup) 22,23 auszuwählen. Ähnlich wie in früheren Erkenntnisse 17,19,20, reagierte dieser Aptamere mit Fibrillen von Aß und mehrere andere amyloidogene Proteine ​​wahrscheinlich Erkennen einer potentiell gemeinsamen Amyloid strukturelle aptatope 21. Hier präsentieren wir die SELEX-Methode bei der Herstellung dieser Aptamere 21 verwendet.

Aptamere sind kurze ribo-/deoxyribo-oligonucleotides ausgewählt von<em&gt; In-vitro</em&gt; Evolution Methoden Affinität für ein bestimmtes Ziel basiert. Aptamere sind molekulare Erkennung Werkzeug mit vielfältigen therapeutische, diagnostische und Forschungszwecke entwickelt. Wir zeigen Methoden für die Selektion von Aptameren für Amyloid-β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit.

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine progressive, altersabhängige, neurodegenerative Erkrankung mit einem schleichenden Verlauf, der ihre präsymptomatische Diagnose ...

Das übergeordnete Ziel von Selects-Experimenten besteht darin, RNA-Moleküle auszuwählen, die in RNA Selects spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielprotein binden. Dies wird erreicht, indem RNA in vitro aus einer Bibliothek zufälliger DNA-Oligonukleotide transkribiert und anschließend der transkribierte RNA-Pool mit dem Zielprotein inkubiert wird. Als zweiter Schritt kommt eine Filterbindung zum Einsatz.Dadurch werden die Ziel-bindenden RNA-Moleküle von der ungebundenen RNA-Pool getrennt. Anschließend werden die zielbindenden RNA-Moleküle eluiert, revers transkribiert, mittels DNA-PCR amplifiziert und erneut in RNA transkribiert.Dieser RNA-Pool, der nun angereichert ist für einige bindende Abers, wird für die Bindung an das Ziel im nächsten Selektionszyklus verwendet. Im Allgemeinen werden nach acht bis 20 Zyklen hochaffine, zielgerichtete Aptamere ausgewählt und charakterisiert. Hallo, ich bin Gal Bean aus der Abteilung für Neurologie an der UCLA, heute Far Rahimi.Ein erfahrener Postdoktorand in meinem Labor wird ein Verfahren namens cellex demonstrieren. Wir haben dieses Verfahren im Labor verwendet, um Abers für Amyloid-Beta-Oligomere auszuwählen. Beginnen wir also.Für das

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Wir beschreiben eine Technik für die Herstellung von geklärt menschlichen kortikalen Homogenate, Protein Trennung durch SDS-PAGE, Antigen-Retrieval und Immunoblot mit einem Antikörper gegen das Aß-Peptid. Mit diesem Protokoll, setzen wir konsequent erkennen monomeren und multimeren Aß in kortikalen Gewebe von Menschen mit Alzheimer-Pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detektion von Aß Multimere in Human Kortikale Gewebehomogenaten mit Antigen-Epitope Retrieval

Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie in Kombination mit der Biopanning-Technologie haben wir ein negatives und positives Biopanning-System entwickelt, um Antikörper gegen krankheitsspezifische Proteinvarianten zu gewinnen, die in jedem biologischen Material vorhanden sind, selbst bei niedrigen Konzentrationen.  Es ist uns gelungen, Antikörper gegen TDP-43-Proteinvarianten zu erhalten, die an der Amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind.

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Während der Transport von Zelloberflächenproteinen relativ leicht studiert, Visualisieren des Handels mit intrazellulären Proteinen ist viel schwieriger. Hier verwenden wir Konstrukte Einbeziehung photoaktivierbaren GFP und zeigen eine Methode, um genau zu folgen das Amyloid-Vorläuferprotein aus dem Golgi-Apparat, um Downstream-Fächer und folgen Sie den Freiraum.

Abbilden des intrazellulären Transport von APP mit Photoaktivierbare GFP

Um die Wirkungen von Aβo in vivo zu untersuchen, haben wir ein Modell entwickelt, das auf wiederholten hippokampalen Infusionen von löslichem Aβo in Verbindung mit einer kontinuierlichen Infusion von Aβo-Antikörpern (6E10) im Hippocampus unter Verwendung osmotischer Pumpen basiert, um der neurotoxischen Wirkung von Aβo entgegenzuwirken.

Neurodegenerative Erkrankungen im Tiermodell der chronischen Amyloid-beta-Oligomers Infusion wird durch Antikörper-Behandlung Angereichert mit osmotische Pumpen entgegen gewirkt

Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

Anreicherung von Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Molekularer Bildgebung mit der Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-basierte bildgebende Massenspektrometrie (MALDI-IMS) erlaubt die gleichzeitige Zuordnung von mehreren Analyten in biologischen Proben. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Erfassung und Visualisierung von Amyloid β Protein Hirngewebe von Alzheimer-Krankheit und zerebralen Amyloid-Angiopathie Proben mit MALDI-IMS.

Visualisierung von Amyloid-β-Einlagen in das menschliche Gehirn mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung bildgebende Massenspektrometrie

Das vorliegende Protokoll beschreibt und vergleicht das Verfahren zur Durchführung einer Analyse der gesamten Region oder Subregion von Interesse an sagittalen Hirnschnitten der Maus zur Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung im transgenen APP/PS1-Mausmodell der Alzheimer-Krankheit.

Voll- versus subregionale Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung von Hirnschnitten der Maus

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Hier beschreiben wir ein Hefesystem, das die humane γ-Sekretase rekonstituiert. Dieses System ermöglicht die Identifizierung und Untersuchung von Mutationen, die die Aktivität beeinflussen, sowie das Screening von γ-Sekretase-Inhibitoren (GSIs). Unter Ausnutzung des Verlusts der Funktionseigenschaften familiärer Alzheimer-Mutanten ist es möglich, nach γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) zu suchen.

Saccharomyces cerevisiae Modelle der Alzheimer-Krankheit zum Screening von Genen, Mutationen und Chemikalien, die die Amyloid-Beta-Produktion durch γ-Sekretase beeinflussen

Erfahren Sie die Selektion von RNA-Aptameren für Amyloid β-Protein mittels in-vitro-Evolution und Filterbindung. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung spezifischer molekularer Erkennungswerkzeuge für die Alzheimer-Forschung.

Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

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