Selektion von Aptameren für Amyloid β-Protein, dem Erreger der Alzheimer-Krankheit

Das übergeordnete Ziel von Selects-Experimenten besteht darin, RNA-Moleküle auszuwählen, die in RNA Selects spezifisch und mit hoher Affinität an ein Zielprotein binden. Dies wird erreicht, indem RNA in vitro aus einer Bibliothek zufälliger DNA-Oligonukleotide transkribiert und anschließend der transkribierte RNA-Pool mit dem Zielprotein inkubiert wird. Als zweiter Schritt kommt eine Filterbindung zum Einsatz.

Dadurch werden die Ziel-bindenden RNA-Moleküle von der ungebundenen RNA-Pool getrennt. Anschließend werden die zielbindenden RNA-Moleküle eluiert, revers transkribiert, mittels DNA-PCR amplifiziert und erneut in RNA transkribiert.

Dieser RNA-Pool, der nun angereichert ist für einige bindende Abers, wird für die Bindung an das Ziel im nächsten Selektionszyklus verwendet. Im Allgemeinen werden nach acht bis 20 Zyklen hochaffine, zielgerichtete Aptamere ausgewählt und charakterisiert. Hallo, ich bin Gal Bean aus der Abteilung für Neurologie an der UCLA, heute Far Rahimi.

Ein erfahrener Postdoktorand in meinem Labor wird ein Verfahren namens cellex demonstrieren. Wir haben dieses Verfahren im Labor verwendet, um Abers für Amyloid-Beta-Oligomere auszuwählen. Beginnen wir also.

Für das Lesen gehört es ganz Ihnen. In diesem ausgewählten Experiment werden homogene, aggregatfreie, stabile Proteinligamente, die aus dem Amyloid-Beta-Protein Aβ40 bestehen, unter Verwendung des Pickup-Verfahrens wie in einem früheren JoVE-Videoprotokoll beschrieben – mit in dem begleitenden schriftlichen Protokoll detaillierten Modifikationen – hergestellt. Nach der Vernetzung reinigen Sie die vernetzte Ligamentenmischung mithilfe von 5-mL-Desaltingsäulen.

Platzieren Sie zunächst die Säule auf einem Ständer mit einem Becher unterhalb des Säulenauslasses. Entfernen Sie die obere Kappe der Säule und ziehen Sie den Auslassstopfen ab. Lassen Sie den Lagerpuffer durchlaufen und im Becher auffangen.

Als Nächstes wird die Säule mit fünf Resin-Bed-Volumina in drei Milliliter-Aliquoten von 10 Millimolar Ammoniumacetat pH 8,3 equilibriert. Nach der Equilibrierung wird ein 0,5-Milliliter-Aliquot der Pickup-Reaktionsmischung auf die Säule aufgetragen. Man lässt die Proteinmischung in das Resin eindringen und verwirft den Durchlauf.

Platzieren Sie im Becher das erste Sammelgefäß unterhalb des Säulenauslasses. Geben Sie 0,5 Milliliter des Acetatpuffers auf die Säule und sammeln Sie die ersten 0,5 Milliliter der Durchflussfraktion. Wiederholen Sie die Elution, um 8,5-Milliliter-Fraktionen in den entsprechenden Röhrchen zu sammeln.

Die Proben werden mittels SDS-Gelelektrophorese und Absorptionsmessung charakterisiert. Kombinieren Sie die Fraktionen mit dem höchsten Proteingehalt und mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette, wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben. Heben Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot für die Aminosäureanalyse auf und lagern Sie den Rest.

Bereiten Sie als Nächstes den RNA-Pool vor. Amplifizieren Sie zunächst die synthetische einzelsträngige DNA-Bibliothek mittels PCR, wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben. Reinigen Sie das amplifizierte DNA-Produkt und überprüfen Sie die DNA-Menge durch 2%ige Agarose-Gelelektrophorese.

Im Allgemeinen liegen Konzentration und Ausbeute der DNA bei 160 ± 10 Nanogramm pro Mikroliter in 50 Mikrolitern pro Röhrchen. Transkribieren Sie anschließend die DNA in Gegenwart von radioaktiv markiertem CTP über Nacht in vitro, gefolgt von einer vierstündigen Verdauung der amplifizierten DNA-Vorlage durch DNA, um einen mit P 32 markierten RNA-Pool zu erzeugen, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Obwohl der Hersteller Promega eine 15-minütige Inkubation mit DNase empfiehlt, haben wir in unseren Experimenten festgestellt, dass eine vierstündige Inkubation zu einer vollständigen Entfernung der gesamten DNA-Vorlage führt, nachdem die Inkubation mit DNase erfolgt ist.

Extrahieren Sie die RNA, indem Sie eine Volumenmenge zitronensaurer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol hinzufügen, etwa eine Minute lang verwirbeln und zwei Minuten bei Raumtemperatur mit 16.000 G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie mithilfe einer Mikropipette eine Volumenmenge Chloroform-Isoamylalkohol hinzu, verwirbeln Sie eine Minute lang und zentrifugieren Sie erneut. Wie zuvor entfernen Sie die untere Phase durch Absaugen mit einer Mikropipette.

Beachten Sie, dass es in diesem Schritt einfacher ist, die untere Phase zu entfernen, anstatt die obere. Die untere Phase wird als Abfall entsorgt. Fällen Sie anschließend die RNA, indem Sie ein 0,1-Volumenäquivalent von drei molarer Natriumacetatlösung und ein Volumenäquivalent Isopropanol hinzufügen.

Mischen Sie die Probe und stellen Sie sie 15 Minuten lang in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Nach 15 Minuten zentrifugieren, das Überstand entfernen und den RNA-Pellet mit 0,5 Milliliter 70 %igem Ethanol waschen. Nach der Ethanolwäsche erneut zentrifugieren und das Ethanol verwerfen. Trocknen Sie den RNA-Pellet fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Heizblock und lösen Sie die RNA-Probe in 150 Millimolar STE-Puffer, pH 8,0, in einem Volumen auf, das dem Volumen der In-vitro-Transkriptionsreaktion entspricht.

Erhitzen Sie das Röhrchen mit dem RNA-Produkt 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius in einem Heizblock und wirbeln Sie es anschließend. Um die RNA-Auflösung zu erleichtern, zentrifugieren Sie eine Minute bei Raumtemperatur mit maximaler Drehzahl, entnehmen Sie ein Mikroliter Eloqua der RNA für die Szintillationszählung und die Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Nach der Auflösung der RNA entfernen Sie nicht eingebaute Nukleotide mithilfe von G-50-Säulen gemäß den Herstelleranweisungen.

Denken Sie daran, einen Mikroliter der G-50-gereinigten RNA für die Szintillationszählung und die denaturierende Gelelektrophorese aufzubewahren. Verwenden Sie die beiden Ein-Mikroliter-Aliquots der RNA aus der RNA-Fällung und dem G-50-Desalzierungsschritt für die Szintillationszählung. Berechnen Sie die Markierungsin-korporationsrate nach der Szintillationszählung und der Berechnung der prozentualen Inkorporation sowie die Ausbeute an RNA und die spezifische Aktivität der RNA.

Überprüfen Sie abschließend die RNA vor und nach der G-50-Reinigung, indem Sie die Proben auf einem 6 %igen TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gel laufen lassen und die RNA mittels Autoradiographie wie in dem begleitenden schriftlichen Protokoll beschrieben sichtbar machen. Falls die Qualität des markierten Produkts zufriedenstellend ist, fahren Sie fort, indem Sie die RNA-Bibliothek mit der Proteinprobe für die Selektionen mischen. Inkubieren Sie die RNA-Lagerlösung 10 Minuten bei 90 Grad Celsius zur Denaturierung und anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur zur langsamen Renaturierung.

Während die RNA inkubiert, lösen Sie ein Proteingefäß in acht Mikrolitern 60 Millimolar Natriumhydroxid unter Zusatz von 36 Mikrolitern nukleasefreiem deionisiertem Wasser auf. Sonizieren Sie die Mischung eine Minute lang und geben Sie 36 Mikroliter zweifachen RNA-Bindungspuffers hinzu. Für die negative Kontrolle.

Kombinieren Sie die RNA mit 20 Mikroliter 10×RNA-Bindungspuffer und stellen Sie das Volumen durch Zugabe nukleasefreien Wassers auf 200 Mikroliter ein. Für die Bindungsreaktion mischen Sie 20 Mikroliter Protein- und RNA-Lösung mit 20 Mikroliter 10×RNA-Bindungspuffer und stellen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 200 Mikroliter ein.

Inkubieren Sie die Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während die Proben inkubieren, bereiten Sie die Filter und die Filter-Bindungsanordnung vor. Befestigen Sie zunächst einen 125-Milliliter-Kolben mit Seitenhals am Vakuumanschluss. Setzen Sie eine vorgereinigte poröse Glasunterlage für den Filter auf den Kolben mit Seitenhals.

Als Nächstes drei Filtermembranen in zwei bis drei Milliliter eines 1 X RNA-Bindungspuffers in einer 35 mal 10 Millimeter großen Petrischale für 10 bis 15 Minuten äquilibrieren. Sobald die Inkubation der Negativkontroll- und Bindungsreaktionsproben abgeschlossen ist, diese fünf Minuten lang bei maximaler Drehzahl zentrifugieren. Bei Raumtemperatur anschließend das Vakuum einschalten und die erste Membran auf dem porösen Glas platzieren; mit einer Mikropipette 0,5 Milliliter RNA-Bindungspuffer auf die Membran auftragen.

Stellen Sie das Vakuum so ein, dass jeder Puffertröpfchen langsam durch die Membran fließt. Dieser erste Filter dient ausschließlich zur Einstellung des Vakuumansaugs. Danach platzieren Sie die zweite Membran auf dem porösen Glas und geben mithilfe derselben Fließgeschwindigkeit die negative Kontrolle auf die Membran.

Nach der Applikation der Probe waschen Sie diese viermal mit je 0,5 Milliliter Aliquots eines XRNA-Bindungspuffers. Entfernen Sie die Membran der Negativkontrolle und geben Sie sie in ein Röhrchen für die Szintillationszählung. Ersetzen Sie das poröse Glas durch eine vorgereinigte zweite poröse Glasunterlage.

Platzieren Sie die dritte Scheibe auf das poröse Glas und geben Sie die Bindungsreaktionsmischung hinzu. Waschen Sie den Filter wie gerade gezeigt; die Anzahl der Waschungen kann in späteren Selektionszyklen erhöht werden. Um die Stringenz der Selektionsbedingungen zu erhöhen, nehmen Sie die Filterscheibe heraus und legen Sie sie in ein 1,6-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung Bindungsreaktion.

Führen Sie die Szintillationszählung für beide Filter durch. Berechnen Sie den Anteil der auf dem Filter gebundenen Radioaktivität im Vergleich zur Gesamtmenge der auf die Membranen aufgebrachten Radioaktivität. Dies liefert einen Hinweis auf die Anreicherung der Bindung, während die Selektion fortschreitet.

Nach der Szintillationszählung die Filtermembran der Bindungsreaktion aus dem Röhrchen nehmen und in eine saubere, trockene Petrischale mit den Maßen 35 mal 10 Millimeter legen. Mit einem sauberen Skalpell und einer Pinzette die Membran in kleine Stücke schneiden. Die geschnittenen Stücke mithilfe der Pinzette zurück in das Szintillationsfläschchen überführen.

Fügen Sie 400 µL Evolutionspuffer hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen bei 95 °C für 10 Minuten. Am Ende der 10 Minuten mischen Sie durch Vortexen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur mit maximaler Drehzahl, pipettieren Sie den Überstand ab und sammeln Sie den Extraktionspuffer in einem neuen beschrifteten Röhrchen. Messen Sie die verbleibenden Radioaktivitätszähler im Röhrchen mit den Membranstücken mittels Szintillationszählung. Um die Extraktionseffizienz zu beurteilen, wiederholen Sie die Extraktion dreimal; die Effizienz nach drei Extraktionen liegt gewöhnlich bei etwa 95 bis 96 %. Fügen Sie anschließend drei bis vier µL Glykogen als RNA-Mitfällmittel hinzu und extrahieren und präzipitieren Sie die von dem Filter freigesetzte RNA wie zuvor beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Probe über Nacht in einen minus 20 °C kalten Gefrierschrank gestellt wird.

Nach der Übernacht-Inkubation wird die Probe zentrifugiert, wobei die RNA in eine kaum sichtbare flüssige Phase ausfällt. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände, ohne die kaum sichtbare Niederschlagsphase am Boden des Röhrchens zu lösen. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 0,5 Milliliter 70 %igem Ethanol, zentrifugieren Sie fünf Minuten bei maximaler Drehzahl bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie das Ethanol durch Absaugen, ohne die kaum sichtbare Niederschlagsphase zu lösen.

Lösen Sie das RNA-Pellet in 50 Mikrolitern STE-Puffer auf und führen Sie die G-50-Reinigung wie für die neu transkribierte RNA im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben durch. Um mit dem nächsten Selektionszyklus fortzufahren, transkribieren Sie die RNA mittels Reverse Transkriptase in DNA um und amplifizieren Sie diese anschließend per PCR, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll beschrieben. Denken Sie daran, eine negative Kontrollprobe ohne Reverse Transkriptase einzuschließen.

Überprüfen Sie die PCR-Produkte auf einem Gel, wenn die Spur der Negativkontrolle leer ist und die anderen Spuren wie erwartet aussehen. Fahren Sie fort, indem Sie die RNA transkribieren und markieren, wie zuvor gezeigt, und verwenden Sie sie. Im nächsten Selektionszyklus wählen Sie das entstandene oligomere Produkt auf.

Ein hier für die Selektion verwendetes Beta-40-Protein wurde gemäß dem in diesem Video-Protokoll gezeigten Verfahren gereinigt und anschließend mittels Absorptionsmessungen, dargestellt durch die rote Kurve, und SDS-Gelelektrophorese untersucht. Das Protein eluiert regelmäßig in den Fraktionen drei bis fünf von der Säule, und das Vernetzungsreagenz Salut zeigt nach Fraktion sechs eine erhöhte Absorption in Fraktion sieben an. Die SDS-Gelelektrophorese zeigt die typische A-Beta-40-Oligomer-Verteilung.

Die Integrität der RNA für jeden Selektionszyklus ist wichtig für den iterativen Fortschritt der Selektionen. Nach der RNA-Transkription und Markierung wird die Qualität der markierten RNA mittels denaturierender Gelelektrophorese beurteilt. Hier ist ein typisches Profil eines intakten markierten RNA-Produkts vor und nach G-50-Reinigung. Verunreinigende DNA-Vorlage aus vorherigen Selektionszyklen, die noch nach der In-vitro-Transkriptionsreaktion vorhanden ist, könnte die Selektionswirksamkeit verringern und mehr Zyklen erforderlich machen.

Die Agarosegelelektrophorese der reversen Transkriptionsreaktion, gefolgt von einer PCR-Amplifikation, zeigt das erwartete DNA-Produkt. Das Fehlen eines DNA-Produkts in den negativen Kontrollreaktionsgefäßen weist auf eine erfolgreiche Entfernung der DNA-Vorlage durch die DNA-Behandlung nach der In-vitro-Transkription hin. Gut, wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Antikörper für photochemisch vernetzte, kovalent stabilisierte Amyloid-beta-40-Oligomere auswählt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass beide Moleküle eine stabile Struktur aufweisen müssen, damit sie eine hohe Affinität besitzen, und dass beide eine dreidimensionale Struktur haben, über die sie miteinander interagieren.

Okay, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.