Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Dieses Verfahren testet in vivo die Protein-Protein-Interaktion zwischen zwei Arabidopsis-Transkriptionsregulatoren, seus buchstabiert SEU, kurz und lu holog oder LUH. Unter Verwendung der biomolekularen Fluoreszenzkomplemmentierung wird seus mit dem endterminalen Fragment eines gelb fluoreszierenden Proteins oder YFP fusioniert, und LUH wird mit dem C-terminalen Fragment von Y-F-P-D-N-A der beiden Plasmidkonstrukte fusioniert. Seuss, NYFP und L-U-H-C-Y-F-P werden in epidermale Zellen der Zwiebel bombardiert, um ihre Wechselwirkung zu testen.

Eine Wechselwirkung zwischen Seuss und LUH bewirkt die Assoziation der endterminalen und C-terminalen Fragmente von YFP in Zellkernen, was zu einer YFP-Fluoreszenz in den Zellkernen führt. Nach einer 16- bis 20-stündigen Inkubation im Dunkeln werden die epidermalen Schalen der Zwiebel unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen. Hallo, ich bin Courtney Hollander aus dem Labor von Dr. Zhi Lu am Department of Cell Biology and Molecular Genetics an der University of Maryland.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem Sie die Protein-Protein-Interaktion in Zwiebelzellen mit der BioRad Helios Genkanone testen können. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Proteinlokalisierung in Pflanzenzellen zu testen. Also lasst uns loslegen.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Kartuschen für die Helios-Genkanone gemäß dem Joe Video Protocol von Woods und Zeto 2008 vor, das das Verfahren zur Herstellung der Kartuschen für jede Herstellung von Kartuschen detailliert demonstriert. 50 Mikrogramm der gesamten Plasma-DNA werden mit 12,5 Milligramm Goldpartikeln und 0,5 Milligramm pro Milliliter PVP-Lösung für BIFC gemischt. Durch die Kombination desselben Kartuschenpräparats fusionierten die beiden Plasma-DNAs der mutmaßlich interagierenden Proteine Seuss mit der N-terminalen Hälfte von YFP, abgekürzt seus, NYFP und LU Homolog, mit der C-terminalen Hälfte von YFP, abgekürzt L-U-H-C-Y-F-P.

Die kombinierte Menge beträgt 50 Mikrogramm pro Präparat, was bis zu 50 Patronen mit einem Mikrogramm DNA pro 0,25 Milligramm Gold pro Patrone ergibt. Jede Patrone ist für einen Schuss bestimmt. Testen Sie die Patronen nach der Vorbereitung der Patronen, um herauszufinden, ob die Goldpartikel effizient angetrieben werden.

Wickeln Sie ein quadratisches Stück Paraform um eine Petrischale. Stellen Sie dann den Heliumdruck auf 150 bis 200 PSI ein und schießen Sie die neu hergestellten Patronen in das Param-Quadrat. Beobachten Sie schwache Goldpartikel auf dem Parfüm.

Unterschiedliche Mengen an Goldpartikeln können bei unterschiedlichem Heliumdruck auf das Parfum geschleudert werden. Wenn es jedoch keinen signifikanten Unterschied gibt, wählen Sie den niedrigeren Druck für das Bombardement. Dieser Test zeigt auch den Bereich an, der von jedem Schuss abgedeckt wird.

Um die Zwiebeltücher vorzubereiten, schälen Sie die äußere Schale einer großen gelben Zwiebel mit einer sauberen und scharfen Rasierklinge ab. Schneiden Sie eine zwei mal acht Zentimeter große rechteckige Fläche mit einer Tiefe von vier bis fünf Schichten. Nehmen Sie das rechteckige Zwiebeltuch heraus und entsorgen Sie die beiden äußeren Schichten.

Schneide die restlichen Schichten der Zwiebel in etwa 1,5 Zentimeter große Stücke. Legen Sie die Zwiebelstücke in eine Petrischale mit Kreisen aus drei mm dickem Filterpapier. Mit sterilem Wasser angefeuchtet die Petrischale abdecken.

Die Zwiebelstücke sind bereit für den Beschuss. Zuerst Legen Sie die Patronen in die weißen runden Patronenhalter ein. Legen Sie Patronen mit unterschiedlichen Plasmidkonstrukten in verschiedene Patronenhalter ein. Jeder Patronenhalter kann bis zu 12 Patronen für 12 Schüsse aufnehmen.

Hier werden drei verschiedene Halterungen geladen. Der erste Halter enthält Patronen, die 35 S-G-F-P-A starken und konstitutiven Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus enthalten. Dieses Plasmid dient als Positivkontrolle.

Der zweite Halter ist mit den experimentellen Patronen bestückt, die die gleiche Menge S-E-U-N-Y-F-P und L-U-H-C-Y-F-P enthalten. Der dritte Patronenhalter ist mit Patronen bestückt, die eine gleiche molare Mischung aus dem Puckwirbelvektor und dem LUH-Puckgewürz enthalten. Dies dient auch als Negativkontrolle.

Setzen Sie die Batterie und die frische Laufauskleidung in die Helios-Genpistole ein. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Laufauskleidung als auch die Waffe ihre jeweiligen O-Ringe angebracht haben. Setzen Sie anschließend einen leeren Patronenhalter in die Genpistole ein, wobei die Markierung Nummer 12 auf dem Patronenhalter zur Oberseite der Waffe zeigt.

Schieben Sie den Patronenhalter ein- oder zweimal vor, um sicherzustellen, dass er richtig eingesetzt ist. Befestigen Sie dann die Pistole am Heliumtank und stellen Sie den Druck auf 150 bis 200 PS ein. Ich trage einen Gehörschutz und feuere die Waffe ein paar Mal ab, indem ich den Seitenknopf gedrückt halte, während ich den Abzug betätige. Wenn Sie die Waffe mit dem leeren Patronenhalter abfeuern, reinigt sie die Waffenkammer und sorgt für einen stabilen Druck.

Vor dem Schießen der DNA kann das Schießen eines Stücks Zwiebel hier eine negative Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz sein. Um die DNA-beschichteten Goldpartikel zu schießen, entfernen Sie den leeren Patronenhalter und setzen Sie den ersten geladenen Patronenhalter mit der Positivkontrolle ein. Schieben Sie den Patronenhalter so vor, dass sich die zum Abfeuern vorgesehene Patrone an der Unterseite des Patronenhalters befindet.

Lege nun Zwiebelstücke mit der innersten Schicht der Zwiebel nach oben in die Mitte einer leeren Petrischale. Legen Sie die Laufauskleidung der Genpistole auf die Petrischale und feuern Sie die Waffe ab. Gehe zur nächsten Patrone und schieße ein anderes Zwiebelstück.

Wiederhole diesen Schritt, bis vier bis fünf Zwiebelstücke abgeschossen sind. Jedes Zwiebelstück wird nach dem Schießen nur einmal geschossen. Übertragen Sie das beschossene Zwiebelstück in eine Petrischale mit feuchtem drei mm Filterpapier, um die experimentellen Patronen zu schießen.

Wechseln Sie zur Patrone Holden. Nummer zwei: Denken Sie daran, die Laufauskleidung zu wechseln, um eine Kontamination zu vermeiden. Schießen Sie vier bis fünf Zwiebelstücke ab, wie gerade für die Positivkontrolle gezeigt.

Wechseln Sie dann zur Patrone Holden. Nummer drei, die die negative Kontroll-DNA enthält. Und auch hier schießen Sie vier bis fünf Zwiebelstücke ab.

Wechseln Sie die Laufauskleidung, um eine Kontamination zu vermeiden. Nach dem Bombardement. Decken Sie die Petrischalen mit den Zwiebelstücken mit Deckeln ab.

Wickeln Sie sie mit Paraform ein, um ein Austrocknen zu verhindern. Inkubieren Sie die Zwiebelstücke bei Raumtemperatur im Dunkeln für 16 bis 48 Stunden. Sobald das Bombardement abgeschlossen ist, schalten Sie das Gas aus und lassen Sie den Druck ab, bevor Sie die Genkanone vom Heliumtank lösen, schrauben Sie die Laufauskleidung ab und entfernen Sie den Patronenhalter und die gebrauchten Patronen.

Reinigen Sie abschließend die Kartuschenhalter und Laufauskleidungen, indem Sie sie in ein Becherglas mit Seifenwasser und Ultraschall tauchen. Für 20 Minuten. Anschließend mit Wasser abspülen, um alle Seifenreste zu entfernen.

Eine Stunde lang in 70%igem Ethanol einweichen und dann auf Küchenpapier trocknen. Fahren Sie fort, die Zwiebelstücke 16 bis 20 Stunden nach dem Beschuss zu beobachten. Nachdem Sie die bombardierten Zwiebelstücke 16 bis 20 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, verwenden Sie eine Pinzette mit flachen Enden, um langsam eine einzelne Zellschicht von der inneren Epidermis der Zwiebel zu schälen.

Dies ist die Schicht, die während des Bombardements direkt auf das Geschütz zeigt. Legen Sie die geschälte Schicht auf einen Tropfen Wasser auf einer Diaabdeckung mit Deckfolie. Achten Sie jedoch darauf, Blasen zu minimieren.

Beobachten Sie die GFP- oder YFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop wie dem zes axio Observer, Punkt Z eins, hier unter dem Hellfeld des Mikroskops. Überprüfen Sie zunächst die zytoplasmatische Strömung, um sicherzustellen, dass die Zellen lebendig sind. Um dies zu tun.

Setzen Sie den Objektträger einige Minuten lang dem hellen Feldlicht aus, um das Zwiebelgewebe aufzuwärmen, und suchen Sie dann nach sich bewegenden Kunststoffen. Zytoplasmatisches Strömen ist nicht immer leicht zu erkennen, also lassen Sie sich nicht entmutigen, wenn es nicht deutlich sichtbar ist. Verwenden Sie für die Fluoreszenzdetektion geeignete Anregungs- und Detektionsfilter für GFP oder YFP. Überprüfen Sie auch die Negativkontrollen, d. h. die Zwiebelstücke, die mit einem nicht fluoreszierenden Plasmid geschossen wurden.

Schwache gelbe Signale können von verwundeten Zellen, Ablagerungen und Zwiebeln auftreten. Überprüfen Sie auch die Positivkontrollen. Plasmid enthaltend konstitutiv exprimierten fluoreszierenden Reporter.

GFP-Fluoreszenz ist in einigen, aber nicht in allen Zellen zu beobachten. Luftblasen können auch Hintergrundfluoreszenz erzeugen. Sichtbare GFP-Signale von epidermalen Zellen der Zwiebel deuten darauf hin, dass die Patronen, das Zwiebelgewebe und das Abfeuern der Genkanone ordnungsgemäß vorbereitet und ausgeführt wurden.

Hier ist die starke Fluoreszenz zu sehen, die aus dem 35 SGFP-positiven Plasmid beobachtet wurde. Die starke Fluoreszenz ist in der gesamten Zelle zu sehen, sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Das Hellfeldbild erlaubt es, die entsprechenden Umrisse der Zellen und Zellkerne zu erkennen.

Nicht jede Zelle wird transformiert. Das YFP-Fluoreszenzsignal wird im Zellkern der Zwiebelzelle nachgewiesen, wenn die experimentelle Kombination Seuss, NYFP und L-U-H-C-Y-F-P in Zwiebelzellen bombardiert wird, was darauf hindeutet, dass Seuss NYFP und L-U-H-C-Y-F-P in vivo interagieren. Diese Wechselwirkungs-vermittelte Fluoreszenz ist jedoch signifikant schwächer als die 35 SGFP-vermittelte Fluoreszenz in der Positivkontrolle.

Zusätzlich sind die Transkriptionsfaktoren SEUS und LUH in den Zellkernen lokalisiert. Die YFP-Fluoreszenz wird also nur im Zellkern beobachtet. Darüber hinaus ist die Anzahl der Fluoreszenzzellen signifikant geringer als die der 35-SGFP-Positivkontrolle.

Dies liegt daran, dass B FFC nur funktioniert, wenn beide Partnerplasmide in denselben Zwiebelzellen exprimiert werden. In Zwiebeln, die mit dem Patronenhalter Nummer drei beschossen wurden, der eine Mischung aus Puckrücken, Vektor und L-U-H-C-Y-F-P enthält, wird kein Fluoreszenzsignal nachgewiesen, wie es von der Negativkontrolle erwartet wird. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Zwiebelzellen bombardieren können, um mit dem BioRad Helios Genkanonensystem auf Protein-Protein-Wechselwirkungen zu testen.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, geeignete Positiv- und Negativkontrollen zu verwenden und zu wissen, dass die BIFC-Fluoreszenz im Signal schwächer und in der Anzahl der Fluoreszenzzellen geringer sein kann. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.