Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Dieses Verfahren testet die in-vivo-Protein-Protein-Interaktion zwischen zwei Transkriptionsregulatoren aus Arabidopsis, SEUSS (abgekürzt SEU) und LU HOMOLOG (LUH). Unter Verwendung der biomolekularen Fluoreszenzkomplementierung wird SEUSS mit dem N-terminale Fragment eines gelben fluoreszierenden Proteins (YFP) fusioniert, während LUH mit dem C-terminalen Fragment von Y-F-P-D-N-A der beiden Plasmidkonstrukte fusioniert wird. SEUSS-NYFP und LUH-CYFP werden in Zwiebel-Epidermiszellen eingeschossen, um ihre Interaktion zu überprüfen.

Eine Interaktion zwischen Seuss und LUH führt zur Assoziation der endterminalen und C-terminalen Fragmente von YFP in den Kernen, was zu YFP-Fluoreszenz in den Kernen führt. Nach einer Inkubation von 16 bis 20 Stunden im Dunkeln werden die Zwiebel-epidermalen Abschälungen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen. Hallo, ich bin Courtney Hollander aus dem Labor von Dr. Zhi Lu an der Abteilung für Zellbiologie und molekulare Genetik an der University of Maryland.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Testen von Protein-Protein-Interaktionen in Zwiebelzellen mithilfe der BioRad Helios-Genkanone. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Protein-Protein-Interaktionen und die Proteinsublokalisierung in Pflanzenzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Kartuschen für die Helios-Genkanone gemäß dem Joe-Video-Protokoll von Woods und Zeto 2008 vor, das detailliert das Verfahren zur Kartuschenherstellung für jede Kartuschenpräparation beschreibt. 50 Mikrogramm gesamte Plasmid-DNA werden mit 12,5 Milligramm Goldpartikeln und 0,5 Milligramm pro Milliliter PVP-Lösung für BIFC gemischt. Unter Verwendung derselben Kartuschenpräparation werden die beiden Plasmid-DNAs der mutmaßlich wechselwirkenden Proteine Seuss, fusioniert mit der N-terminalen Hälfte von YFP, abgekürzt seus, NYFP, und LU-Homolog, fusioniert mit der C-terminalen Hälfte von YFP, abgekürzt L-U-H-C-Y-F-P, kombiniert.

Die Gesamtmenge beträgt 50 Mikrogramm pro Aufbereitung und ergibt bis zu 50 Kapseln mit je einem Mikrogramm DNA pro 0,25 Milligramm Gold pro Kapsel. Jede Kapsel ist für einen einzigen Schuss vorgesehen. Nach der Kapselherstellung sollten die Kapseln daraufhin überprüft werden, ob die Goldpartikel effizient beschleunigt werden.

Wickeln Sie ein quadratisches Stück Paraform um eine Petrischale. Stellen Sie anschließend den Heliumdruck auf einen Wert zwischen 150 und 200 PSI ein und feuern Sie die neu hergestellten Kartuschen in das Paraform-Quadrat. Beobachten Sie schwache goldfarbene Partikel auf dem Paraform.

Unterschiedliche Mengen an Goldpartikeln können bei verschiedenen Heliumdrücken auf das Parfum geschossen werden. Wenn jedoch kein signifikanter Unterschied besteht, wählen Sie den niedrigeren Druck für die Beschussung. Dieser Test zeigt auch den Bereich an, der von jedem Schuss abgedeckt wird.

Um die Zwiebelgewebe vorzubereiten, entfernen Sie mit einem sauberen und scharfen Rasiermesser die äußere Haut einer großen gelben Zwiebel. Schneiden Sie einen zwei mal acht Zentimeter großen rechteckigen Bereich, vier bis fünf Schichten tief, heraus. Entnehmen Sie das rechteckige Zwiebelgewebe und entsorgen Sie die äußeren zwei Schichten.

Schneiden Sie die verbleibenden Zwiebelschichten in etwa 1,5 cm große quadratische Stücke. Geben Sie die Zwiebelstücke in eine Petrischale, die Kreise aus 3-mm-Filterpapier enthält. Befeuchten Sie die Petrischale mit steriler Wasser und decken Sie sie ab.

Die Zwiebelstücke sind bereit für die Beschleunigung. Laden Sie zuerst die Kartuschen in die weißen runden Kartuschenhalter; laden Sie Kartuschen mit unterschiedlichen Plasmid-Konstrukten in verschiedene Kartuschenhalter. Jeder Kartuschenhalter kann bis zu 12 Kartuschen für 12 Schüsse aufnehmen.

Drei verschiedene Halter werden hier geladen. Der erste Halter enthält Kassetten mit 35 S-G-F-P-A, einem starken und konstitutiven Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus. Dieses Plasmid dient als positiver Kontrollstamm.

Der zweite Halter wird mit den Versuchskartuschen beladen, die eine gleiche Menge an S-E-U-N-Y-F-P und L-U-H-C-Y-F-P enthalten. Der dritte Kartuschenhalter wird mit Kartuschen beladen, die eine äquimolare Mischung aus dem Puck-Spine-Vektor und LUH Puck Spice enthalten. Dies dient ebenfalls als negativer Kontrollversuch.

Setzen Sie die Batterie und den neuen Barrel-Einsatz in die Helios-Genkanone ein. Achten Sie darauf, dass sowohl der Barrel-Einsatz als auch die Kanone ihre jeweiligen O-Ringe angebracht haben. Danach setzen Sie einen leeren Patronenhalter in die Genkanone ein, wobei die Markierung mit der Nummer 12 am Patronenhalter nach oben, zur Spitze der Waffe, zeigen muss.

Bewegen Sie den Patronenhalter ein- oder zweimal vorwärts, um sicherzustellen, dass er korrekt eingesetzt ist. Befestigen Sie dann die Waffe am Heliumtank und stellen Sie den Druck auf einen Wert zwischen 150 und 200 PS ein. Tragen Sie Gehörschutz und feuern Sie die Waffe mehrmals ab, indem Sie die Seitentaste gedrückt halten und gleichzeitig den Abzug ziehen. Wenn die Waffe mit leerem Patronenhalter abgefeuert wird, wird die Kammer gereinigt und sichergestellt, dass der Druck stabil ist.

Bevor die DNA beschossen wird, kann hier ein Stück Zwiebel als negativer Kontrollwert für Hintergrundfluoreszenz dienen. Um die mit DNA beschichteten Goldpartikel abzuschießen, entfernen Sie den leeren Patronenhalter und setzen den ersten beladenen Patronenhalter mit der positiven Kontrolle ein. Bewegen Sie den Patronenhalter weiter, sodass die für den Beschuss vorgesehene Patrone am unteren Ende des Patronenhalters positioniert ist.

Platzieren Sie nun Zwiebelstücke in die Mitte einer leeren Petrischale, wobei die innerste Zwiebelschicht nach oben zeigen soll. Stellen Sie den Barrelliner der Genkanone auf die Petrischale und feuern Sie die Waffe ab. Wechseln Sie zum nächsten Patronenmagazin und beschießen Sie ein anderes Zwiebelstück.

Wiederholen Sie diesen Schritt, bis vier bis fünf Zwiebelstücke beschossen wurden. Jedes Zwiebelstück wird nach dem Beschuss nur einmal beschossen. Überführen Sie das beschossene Zwiebelstück in eine Petrischale mit feuchtem 3-mm-Filterpapier, um die experimentellen Kartuschen zu beschiessen.

Wechseln Sie zur Kartusche Holden. Nummer zwei, denken Sie daran, das Lauffutter zu wechseln, um Kontaminationen zu vermeiden. Schießen Sie vier bis fünf Zwiebelstücke ab, wie gerade für die positive Kontrolle gezeigt.

Danach wechseln Sie zur Kartusche Holden Nummer drei, die die negative Kontroll-DNA enthält. Und schießen Sie erneut vier bis fünf Zwiebelstücke.

Wechseln Sie den Innenrohr des Geräts, um Kontaminationen zu vermeiden. Nach der Beschleunigung die Petrischalen mit den Zwiebelstücken mit Deckeln abdecken.

Wickeln Sie sie mit Parafilm ein, um Austrocknung zu verhindern. Inkubieren Sie die Zwiebelstücke bei Raumtemperatur im Dunkeln für 16 bis 48 Stunden. Sobald die Beschussbehandlung abgeschlossen ist, schalten Sie das Gas ab und entlassen den Druck, bevor Sie das Genkanone vom Heliumtank trennen, den Innenzylinder lösen und den Patronenhalter sowie die verwendeten Patronen entfernen.

Reinigen Sie abschließend die Patronenhalter und Lauffutter, indem Sie diese in einem Becher mit Seifenwasser versenken und 20 Minuten lang beschallen. Spülen Sie danach mit Wasser, um alle Seifenrückstände zu entfernen.

Einmal in 70 %igem Ethanol für eine Stunde einweichen lassen und anschließend auf Papiertüchern trocknen. Die Zwiebelstücke 16 bis 20 Stunden nach der Beschleunigungsbehandlung untersuchen. Nach einer Inkubation der beschleunigten Zwiebelstücke 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur mit flachenden Pinzetten vorsichtig eine einzelne Zellschicht von der inneren Epidermis der Zwiebel ablösen.

Dies ist die Schicht, die während der Bestrahlung direkt der Waffe zugewandt ist. Legen Sie die abgeschälte Schicht mit einem Deckglas auf einen Wassertropfen auf einem Objektträger. Achten Sie jedoch darauf, Blasen so gering wie möglich zu halten.

Beobachten Sie die GFP- oder YFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop wie dem hier gezeigten Zeiss Axio Observer, Point Z eins, im Hellfeld des Mikroskops. Überprüfen Sie zuerst das Vorhandensein von Zytoplasmastrom, um sicherzustellen, dass die Zellen lebendig sind. Gehen Sie dazu wie folgt vor.

Belichten Sie den Objektträger einige Minuten lang mit Hellfeldbeleuchtung, um das Zwiebelgewebe aufzuwärmen, und suchen Sie anschließend nach bewegtem Plastiden-Zytoplasma. Das zytoplasmatische Streaming ist nicht immer leicht zu erkennen; geben Sie daher nicht auf, falls es nicht deutlich sichtbar ist. Für die Fluoreszenzdetektion verwenden Sie geeignete Anregungs- und Detektionsfilter für GFP oder YFP. Überprüfen Sie außerdem die negativen Kontrollen, also die Zwiebelstücke, die mit einem nicht fluoreszierenden Plasmid transfiziert wurden.

Blassgelbe Signale können von verletzten Zellen, Trümmern und Zwiebeln ausgehen. Überprüfen Sie außerdem die positiven Kontrollen. Das Plasmid enthält einen konstitutiv exprimierten fluoreszierenden Reporter.

Die GFP-Fluoreszenz ist in einigen, aber nicht in allen Zellen sichtbar. Luftblasen können ebenfalls Hintergrundfluoreszenz verursachen. Sichtbare GFP-Signale aus Zwiebel-epidermalen Zellen weisen darauf hin, dass die Kartuschen, das Zwiebelgewebe und das Abfeuern der Genkanone ordnungsgemäß vorbereitet und durchgeführt wurden.

Hier ist die starke Fluoreszenz zu sehen, die von dem 35 SGFP-positiven Plasmid ausgeht. Die starke Fluoreszenz ist in der gesamten Zelle sichtbar, einschließlich Kern und Zytoplasma. Das Hellfeldbild ermöglicht es, den entsprechenden Umriss der Zellen und Kerne zu erkennen.

Nicht jede Zelle wird transformiert. Das fluoreszierende Signal von YFP wird im Zellkern der Zwiebelzelle detektiert, wenn die experimentelle Kombination Seuss, NYFP und L-U-H-C-Y-F-P in Zwiebelzellen bombardiert wird, was darauf hinweist, dass Seuss, NYFP und L-U-H-C-Y-F-P in vivo interagieren. Diese Interaktion vermittelte Fluoreszenz ist jedoch deutlich schwächer als die durch 35 SGFP vermittelte Fluoreszenz in der positiven Kontrolle.

Außerdem sind die Transkriptionsfaktoren SEUS und LUH in den Kernen lokalisiert. Daher wird die YFP-Fluoreszenz nur im Zellkern beobachtet. Außerdem ist die Anzahl der fluoreszierenden Zellen deutlich geringer als die der 35 SGFP-positiven Kontrolle.

Das liegt daran, dass B FFC nur funktioniert, wenn beide Partner-Plasmide in denselben Zwiebelzellen exprimiert werden. Kein fluoreszierendes Signal wird in Zwiebeln detektiert, die mit der Kartuschenhalter-Nummer drei bombardiert wurden, die eine Mischung aus puck spine, Vektor und L-U-H-C-Y-F-P enthält, wie es für die negative Kontrolle erwartet wird. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man Zwiebelzellen bombardiert, um Protein-Protein-Interaktionen mithilfe des BioRad Helios Genkanonen-Systems zu testen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete positive und negative Kontrollen zu verwenden, und zu beachten, dass die BIFC-Fluoreszenz ein schwächeres Signal und weniger fluoreszierende Zellen aufweisen kann. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.