Name: Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie die Ableitung von Trophoblast-Stammzellen aus Maus-Blastozysten für die Plazentaforschung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stammzelleigenschaften und Differenzierung in vitro.

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Die Autoren danken Janet Rossant für das ursprüngliche Protokoll. Diese Studie wurde vom National Institute of Health gewähren CA106308 zu WH unterstützt.

In diesem Protokoll, beschreiben wir die Herstellung von Maus-Blastozysten und die Einrichtung von TS-Zelllinien. Allgemeine Maus Manipulationen vor der Sammlung von Blastozysten, einschließlich der Einrichtung für die natürliche Paarung und die Induktion von Super Eisprung folgen grundsätzlich dem Standard-Protokoll von Nagy et al dargestellt. 2003 (pp146-150). Ableitung und Wartung von TS-Zellen <ol><li> Setup-Zucht Kreuzung zwischen Mäusen von Interesse. </li><li> Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) als Feeder-Zellen. Zwei Tage vor der Sammlung von Blastozysten, MEFs (2 x 10 6 Zellen) werden in 100 mm-Schalen plattiert. Am nächsten Tag sind diese Zellen mit 10 ml TS-Medium mit Mitomycin C (20 mg / ml) für ein 2-Stunden-Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 behandelt. Dies wird durch Waschen der Zellen zweimal mit PBS folgten. Die Mitomycin C behandelten Zellen werden dann in 12-Well-Platten (1 x 10 5 Zellen / well) ausgesät. </li><li> Am Tag der Blastozyste Sammlung (3,5 dpc, die so genannte Tag), ist MEF Kulturmedium durch TS-Medium plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / well) ersetzt. </li><li> Vorbereitung für die Sammlung der Gebärmutter: euthanize der Maus, und suchen die Gebärmutter (Abbildung 1A). </li><li> Entfernen der Gebärmutter, indem Sie es mit einer Pinzette an der Zervix (befindet sich hinter der Blase) und quer durch die Kreuzung der Gebärmutter und des Gebärmutterhalses (Abbildung 1B). Ziehen Sie die Gebärmutter, schneiden Sie die Membran-und Fettgewebe weggeschnitten und der Gebärmutter unter der Kreuzung mit der Eileiter (Abbildung 1C). Legen Sie die uteri (Abb. 1D) in einem kleinen Volumen (0,2 ml) von TS-Medium in einem 60 mm Platte. </li><li> Flush jedes Uterushorn mit 1 ml TS-Medium unter Verwendung einer 1-ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel in die Basis des Uterus und Flush langsam in eine neue 60 mm-Platte mit 1 ml TS Medium. Die Gebärmutter ist aufgeblasen und voll beim Spülen verlängert. </li><li> Sammeln und Transfer der Blastozysten vorsichtig in einem sauberen 12-Well-Platte mit TS-Medium mit einer Mund-kontrollierten Pipette. Wash Blastozysten dreimal durch serielle Übertragung durch TS Medium in 12-Well-Platten. Legen Sie eine Blastozyste pro Well (Abbildung 2A) in einer 12-Well-Platte mit der Mitomycin C-behandelten MEF Feeder und Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Die Blastozysten werden von zona pellucida schlüpfen und heften sich an den Brunnen in 24 bis 36 Stunden. Ein kleiner Auswuchs ohne weiteres an Tag 3 beobachtet werden. Feed the Kulturen mit 500 ul frisch TS-Medium plus 1x FGF4/Heparin. </li><li> Am Tag 4 oder 5 sollte die Blastozyste Auswuchs bereit sein, für die Aufschlüsselung in Abhängigkeit von ihrer Größe. Die ideale Größe für TS Zelle Disaggregation ist in Abbildung 3B dargestellt. Waschen Sie die Kulturen einmal mit 0,5 ml PBS. Add 100 ml 0,25% Trypsin / EDTA und Inkubation für 5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2. Break the Auswuchs in kleine Klumpen von Auf-und Abpipettieren kräftig mit einem P100 pipetteman. Stoppen Sie die Trypsinierung indem TS-70cm-1.5F4H (30% TS-Medium, 70% MEF-CM plus 1.5x FGF4/Heparin) in den Brunnen. Ändern Medium 8 Stunden nach der Disaggregation und weiterhin Zellen ernähren alle 2 Tage. </li><li> Zwischen Tag 6 und 10 (sehr variabel) TS Zellkolonien beobachtet werden können. Sie haben flache, epithelialen Blatt Morphologie mit einer klaren Kolonie Grenze (Abbildung 2C). Weiter zu den Kulturen Feed alle 2 Tage </li><li> Wenn TS-Zellen 50% Konfluenz (in der Regel zwischen den Tagen 15 und 20) zu erreichen, einmal waschen mit PBS und 100 ml 0,25% Trypsin / EDTA. Pipette auf und ab während Trypsinierung zu einem in der Nähe Einzel-Zell-Suspension zu gewährleisten. Stoppen Sie die Trypsinierung indem TS-70cm-1.5F4H und Übertragung auf neue 6-well-oder 60mm-Platten mit der Mitomycin C-behandelten MEF Feeder (2,5 x 10 5 cells/6-well oder 5 x10 5 cells/60mm Platte). </li><li> Ändern Medium 8 Stunden nach der Passage und auch weiterhin die Kulturen Feed alle 2 Tage. </li><li> Nach ein oder zwei weitere Passagen (3-5 Tage zwischen den Kanälen) auf der MEF Speiser, kann TS-Zellen ohne sie kultiviert werden. Da MEFs die Kultur Platte viel schneller als TS-Zellen nach Trypsinierung legen, können solche Unterschiede in der Rate Anhänger genutzt werden, um TS-Zellen aus dem MEF Anleger trennen. Nach dem Passieren der kultivierten Zellen, brüten sie bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min. Die meisten MEFs wird auf die Platte legen und die TS Bevölkerung bleibt in der Schwebe. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere Gänge zu einem reinen TS Bevölkerung zu erhalten. </li><li> Pflegen Sie TS-Zellen in TS-70cm-1.5F4H und geben sie alle 4 Tage (von 1.10 bis 01.20 split) oder wenn die Kultur erreicht 70% Konfluenz. Vorbei an den Zellen mit hoher Dichte (höher als 1:5) oder kultiviert werden, wenn übermäßig konfluenten ihre Differenzierung führen kann. </li><li> Die Identität des TS-Zellen können durch Immunfärbung eines Zell-Marker, Cdx2 (Abbildung 3) bestätigt werden. </li></ol> Freezing TS-Zellen <ol><li> Bereiten Sie 2x Einfriermedium (50% FBS, 30% TS mittleren und 20% DMSO). </li><li> Collect TS-Zellen durch Trypsinierung, durch Zentrifugation bei 450g für 6 min folgte. Resuspendieren sie in TS-Medium mit gleichen Volumen 2x Einfriermedium. </li><li> Einfrieren der Zellen langsam mit einem Isopropylalkohol Kammer bei -70 ° C und Transfer zum flüssigen Stickstoff nach 24-48 Stunden. </li><li> A 60 mm-Platte (70% konfluent) ist in der Regel in 2 Fläschchen aufbewahrt. </li></ol> Auftauen TS-Zellen <ol><li> Schnell Tauwetter das Fläschchen in 37 ° C, sammeln sie in 10 ml TS Medien durch Zentrifugation (450g, 6 min) und Resuspension in 30% TS Medien, 70cm-1.5F4H. </li><li> Ein Fläschchen von Zellen in einer 60 mm-Platte ausgesät. </li></ol> TS-Zell-Differenzierung in TGC Die Differenzierung der TS-Zellen in Trophoblast Riesenzellen (TGCs) kann durch den Abzug der MEF-CM, FGF4 und Heparin induziert werden. Das TGC-Phänotyp (große Kerne) kann vier Tage nach der Induktion nachgewiesen werden (Tanaka et al., 1998 und Chiu et al. 2008). Immunfärbung von p450scc erkennen die Expression dieses TGC Marker in der differenzierten Kultur (Abbildung 4A). Durchflusszytometrische Analyse der PI (Propidiumiodid) gefärbten Zellen zeigt weiter das Vorhandensein von differenzierten Zellen mit höheren DNA-Gehalt (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TS-Zellen Endoreduplikation unterziehen, um polyploiden TGCs geworden. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Dissection der Maus uteri. (A) Lage der Gebärmutter ist durch Pfeile angedeutet. (B) über die Kreuzung der Gebärmutter und des Gebärmutterhalses Cut, wie dargestellt. (C) Cut der Gebärmutter direkt unterhalb der Eileiter (OD) unter dem Fruchtknoten (OV). (D) Bild des Uterus. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Representative Bilder illustrieren Maus Blastozyste, Blastozyste Auswuchs und Trophoblast Kolonie. (A) Eine Maus Blastozyste an E3.5 gesammelt wird angezeigt. ICM, innere Zellmasse, MT, Wandmalerei Trophektoderm; PT, polar Trophektoderm. (B) A Trophoblasten Auswuchs am MEF Feeder wird angezeigt. TS, Trophoblast Stammzelle. (C) A Trophoblasten Stammzellen Kolonie zeigt einen klaren Vorsprung am MEF Feeder. Die Pfeile zeigen die Zellgrenze. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Identifizierung von TS-Zellen durch Immunfärbung Analyse. TS (AD) und ES (Steuerung, EH)-Zellen unterliegen Marker-Identifizierung. Die Zellen werden mit Antikörpern gegen Oct4 (A, E) oder Cdx2 (B, F) zu erkennen immungefärbt und gegengefärbt von DAPI (C, G) in fusionierten Bildern dargestellt (D, H). Scale-bar, 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Differenzierung der TS-Zellen in vitro. (A) Undifferenzierte (Undiff) oder differenziert (Diff)-Zellen in Kultur für den Ausdruck einer TGC-Marker untersucht, gegengefärbt p450scc (grün), mit DAPI (rot). (B) Durchflusszytometrische Analyse der differenzierten Zellen mit PI gefärbt, misst den DNA-Gehalt (M1, zwei Minuten vor vier Exemplare; M2, mehr als vier Exemplare). Die M2 Bevölkerung stellt die polyploiden Trophoblastzellen.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

In diesem Video zeigen wir, den Prozess zu E3.5 Blastozysten aus uteri und experimentellen Verfahren zu sammeln, um TS-Zelllinien zu etablieren. Wir beschreiben auch die Voraussetzung für die Stammzell-Seins der TS-Zellen zu erhalten und deren Differenzierung in differenzierten Zellen zu induzieren. Zwei entscheidende Schritte zur reinen TS-Zelllinien zu erhalten sind das Timing für Auswuchs Disaggregation (Schritt 9) und die Verarbeitung der ersten Passage (Schritt 11). Es wurde berichtet, dass primitive Endoderm-abgel...

Reagenzien TS-Medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 100 mM beta-Mercaptoethanol und 100 mg / ml Penicillin-Streptomycin. Mitomycin C: Lösen Sie 2 mg Mitomycin C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS und stell &#39;das 2 ml Mischung in 200 ml TS-Medium (10 ng / ml). Machen Sie 20 Portionen (10 ml) und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Fügen Sie ein Aliquot pro 100 mm-Platte. Maus embryonale Fibroblasten-Zustand Medium (MEF-CM): Platte MEFs in 100 mm-Platten (1 x 10 6 / Platte). Am nächsten Tag, 10 ml TS Medium pro Schale und weiterhin Kultur für 48 Stunden. Sammeln Sie das Kulturmedium, filtern (0,45 mm) und bei -20 ° C in 35 ml Aliquots. Thaw jedes Aliquot, wenn nötig, die bei 4 gespeichert werden können ° C. Die MEFs kann für zwei weitere Chargen von CM vorbereiten, bevor sie konfluent geworden sein. PBS / BSA: Lösen BSA, Fraktion V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filtriert durch ein 0,45 mm Spritzenfilter und machen 1 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen. Lagerung bei -70 ° C und Auftauen einer Röhre, wenn benötigt, um FGF4 vorzubereiten. FGF4 (1000x): Resuspendieren lyophilisiert FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) mit 1 ml der PBS / BSA-Lösung. Gut mischen und machen 10 Aliquots (100 ml) in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw jedes Röhrchen bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x FGF4 (25 ng / ml) zu erhalten. Heparin (1000x): Resuspendieren Heparin (Sigma H3149, 10.000 Einheiten) in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml (1000x). Machen Sie 100 ml Aliquots in 1,5 ml Röhrchen und lagern bei -70 ° C. Thaw Aliquots bei Bedarf und speichern Sie die restlichen bei 4 ° C, nicht wieder einfrieren. Verdünnen 1000 mal in TS-Medium auf 1x Heparin (1 ng / ml) zu erhalten.

ableitung der maus trophoblast stammzellen aus blastozysten

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Spezifikation der Trophektoderm ist eine der frühesten Differenzierung Veranstaltungen von Säugetier-Entwicklung. Der Trophoblast Linie aus dem Trophektoderm vermittelt Implantation abgeleitet und generiert die fetalen Teil der Plazenta. Als Ergebnis ist die Entwicklung dieser Linie wichtig für den Embryo Überleben. Herleitung der Trophoblasten Stammzellen (TS)-Zellen von Maus Blastozysten wurde zuerst von Tanaka beschrieben<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. Die Fähigkeit der TS-Zellen, die Trophoblasten spezifische Eigenschaft und ihre Expression von Bühnen-und Zelltyp-spezifische Marker nach entsprechender Stimulation erhalten eine wertvolle Modellsystem, um die Trophoblasten Abstammung Entwicklung zu untersuchen, wobei Rekapitulation frühen Plazentation Veranstaltungen. Darüber hinaus sind Trophoblastzellen einer der wenigen somatische Zelltypen unterziehen natürliche Genome Amplification. Obwohl die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Trophoblasten Polyploidisierung begonnen haben, zu entwirren, bleibt die physiologische Rolle und der Vorteil der Trophoblast Genomamplifikationstechnik weitgehend ungeklärt. Die Entwicklung der diploiden Stammzellen in polyploiden Trophoblast-Zellen in Kultur macht diese<em&gt; Ex vivo</em&gt; System das perfekte Werkzeug für die Aufklärung der regulatorischen Mechanismus der Genom-Replikation und Instabilität in Gesundheit und Krankheit. Hier beschreiben wir ein Protokoll über die früheren Berichte mit Modifikationen in Chiu veröffentlichten<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Die Spezifikation des Trophoblastoderms ist eines der frühesten Differenzierungsereignisse der mammalianen Entwicklung. Die aus dem ... stammende Trophoblastenlinie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, TS-Zellen aus murinen Blastozysten zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Uterushörner isoliert und Blastozysten von trächtigen Mäusen gewonnen werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Blastozysten unter Bedingungen, die das Wachstum von TS-Zellen begünstigen, auf Meth-Feeder-Zellen zu kultivieren.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, TS-Kolonien zu expandieren und schließlich TS-Zellen in Abwesenheit von Meth-Fütterungszellen zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Kultivierung von TS-Zellen unter Erhaltung der Stammzelleigenschaften, um eine Kryokonservierung durchzuführen und die Trophoblastendifferenzierung zu induzieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Expression eines Trophoblasten-Stammzellmarkers, nämlich CDX2, in undifferenzierten TS-Zellen oder eines differenzierten Markers, IEP450 SCC, nach deren Reifung zu Trophoblasten-Riesenzellen mittels immunfluoreszenzbasierter Mikroskopie zeigen.Hallo, ich bin Shani Chu aus dem Labor der Abteilung für Biomedizinische Genetik am University of Rochester Medical Center. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Trophoblasten-Stammzellkultur. Wir verwenden dieses Verfahren, um das Wachstum und die Differenzierung von Trophoblasten sowie deren Rolle im extraembryonalen Gewebe für die Bildung einer gesunden Plazenta zu untersuchen.Beginnen wir also. Richten Sie zunächst eine Kreuzung zwischen Ihren interessierenden Mäusen ein. Bereiten Sie danach mausische embryonale Fibroblasten ORMs als Fütterungszellen vor.Zwei Tage vor der Sammlung von Blastocysten assistieren die Platten mit Mes auf 100-Millimeter-Dishs am folgenden Tag. Behandeln Sie diese Meth-Zellen mit 10 Millilitern TS-Medium, das 20 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C enthält, für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nach zwei Stunden waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, resuspendieren die mit Mitomycin C behandelten Meth-Zellen in 10 Millilitern TS-Medium und säen die Zellen in eine 12-Loch-Platte aus. Am Tag der Blastocysten-Sammlung ersetzen Sie das Kulturmedium der Meth-Zellen durch TS-Medium plus ein X FGF vier Heparin.Jetzt sind wir bereit, Blastozysten aus dem Muttertier-Uterus zu gewinnen. Legen Sie das euthanasierte Tier zunächst auf den Rücken und reinigen Sie die Haut und das Fell mit 70 %igem Ethanol. Anschließend führen Sie einen kleinen seitlichen Schnitt durch, ziehen die Haut in Richtung Kopf, um den Bauch freizulegen, und schneiden lateral durch das Peritoneum.Um die Bauchhöhle freizulegen, lokalisieren Sie die Gebärmutter. Entfernen Sie die Gebärmutter, indem Sie sie mit einer Pinzette am hinter der Harnblase gelegenen Gebärmutterhals ergreifen und quer durch die Verbindung von Gebärmutter und Gebärmutterhals schneiden. Ziehen Sie die Gebärmutter heraus und entfernen Sie die umgebende Membran sowie Fettgewebe.Schneiden Sie dann den Uterus unterhalb der Verbindung mit dem Eileiter durch. Geben Sie den Uterus in 0,2 Milliliter TS-Medium in eine 60-Millimeter-Platte. Befüllen Sie nun eine Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter TS-Medium.Befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel in die Basis einer Gebärmutter ein. Spülen Sie langsam in eine neue 60-Millimeter-Platte hinein. Während des Spülens sollte die Gebärmutter aufgebläht und vollständig ausgedehnt sein.Auf die gleiche Weise spülen Sie den anderen Uterushorn mit einer mundgesteuerten Pipette aus. Sammeln und überführen Sie den Blastozystenkomplex und übertragen Sie ihn vorsichtig in eine saubere 12-Loch-Platte mit TS-Medium. Waschen Sie den Blastozystenkomplex dreimal durch serielle Transfers durch TS-Medium in 12-Loch-Platten. Legen Sie einen Blast-Assist pro Vertiefung. In einer 12-Loch-Platte mit Mitomycin-C-behandelten Meth-Feeder-Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren. Die Blast-Assists schlüpfen innerhalb von 24 bis 36 Stunden aus der Zona pellucida und heften sich an die Vertiefungen an.Eine kleine Auswucherung ist am dritten Tag leicht zu beobachten. Füttern Sie die Kulturen am vierten oder fünften Tag mit 500 µL frischem TS-Medium plus einem X FGF vier Heparin. Die Blast-Assist-Auswucherung sollte je nach Größe zur Disaggregation bereit sein.Die ideale Größe für die TSL-Dissociation ist hier dargestellt. Waschen Sie die Kulturen einmal mit 0,5 Milliliter PBS. Geben Sie dann 100 Mikroliter 0,25 % Trips in EDTA hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid.Nun sind wir bereit, die Blastozysten zu lösen, was vermutlich der kritischste Teil dieses Verfahrens ist. Zerlegen Sie anschließend den auswachsenden Blastozysten-Assistenten durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einer P100-Pipette in kleine Zellhaufen. Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie 0,5 Milliliter 70 cm 1,5 F4H-Medium in die Vertiefung geben, und bringen Sie die Zellen unverzüglich in den Inkubator zurück. Acht Stunden nach der Disaggregation wechseln Sie das Medium.Füttern Sie die Zellen alle zwei Tage zwischen den Tagen sechs und 10 weiterhin. Dies ist jedoch stark variabel. TSL-Kolonien können beobachtet werden.Sie weisen eine flache, epitheliale, schichtartige Morphologie mit einer deutlichen Koloniegrenze auf. Füttern Sie die Kulturen weiterhin alle zwei Tage. Wenn die TS-Zellen eine Konfluenz von 50 % erreichen, was gewöhnlich zwischen den Tagen 15 und 20 der Fall ist, waschen Sie sie einmal mit PBS und geben 100 Mikroliter 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Pipettieren Sie während der Trypsinisierung mehrmals auf und ab, um eine nahezu einzellige Suspension zu gewährleisten.Nach fünf Minuten die Trypsin-Behandlung stoppen, indem sieben DCM 1,5 F vier H Medium hinzugefügt werden. Anschließend die Zellen in neue Sechs-Well-Platten überführen, die die zuvor vorbereiteten mit Mitomycin C behandelten Meth-Feeder enthalten, und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Das Medium acht Stunden nach der Passage wechseln und die Kulturen danach alle zwei Tage weiter versorgen. Nach einer oder zwei weiteren Passagen auf den Meth-Feeder können die TSL ohne diese kultiviert werden, um die TSL von den Meth-Feeder zu trennen.Nach dem Passieren inkubieren Sie die kultivierten Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Da sich MES nach der Trypsin-Behandlung viel schneller an die Kulturschale anheften als TS-Zellen, werden die meisten MES an der Schale haften, während die TS-Zellen in Suspension verbleiben. Überführen Sie das Überstandmedium in eine neue Schale.Wiederholen Sie diesen Prozess der Trennung der TS-Zellen von den Meth-Feedern über mehrere Passagen hinweg, um eine reine TS-Population zu erhalten. Kultivieren Sie die TS-Zellen in 70 cm, 1,5 F vier H Medium und passagieren Sie sie alle vier Tage oder wenn die Kultur eine Konfluenz von 70 % erreicht. Abschließend kann die Identität der TS-Zellen durch Immunfärbung eines Zellmarkierungsmoleküls bestätigt werden.CDX zwei, um TS-Zellen einzufrieren, sammeln Sie diese durch Zentrierung, gefolgt von einer Zentrifugation bei 450 ×g für sechs Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in TS-Medium mit einem gleichen Volumen an zweifachem Gefriermittel und überführen Sie sie in Kryoröhrchen. Eine 60 mm-Platte, die zu 70 % konfluent ist, wird gewöhnlich in zwei Röhrchen aufbewahrt.Gefrieren Sie die Zellen langsam mithilfe einer Isopropanol-Kammer bei minus 70 Grad Celsius. Überführen Sie sie nach 24 bis 48 Stunden in flüssigen Stickstoff. Das Auftauen von TSL sollte schnell erfolgen, indem das Gefäß bei 37 Grad Celsius aufgetaut wird.Überführen Sie die haw-Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das 10 Milliliter TS-Medium enthält, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie die Zellen in 70 cm, 1,5 F vier H-Medium und säen Sie jede Zellprobe in eine 60-Millimeter-Platte aus. Die Differenzierung von TS-Zellen in Trophoblast-Riesenzellen oder TGC kann durch das Entfernen von MEC vier und Heparin induziert werden. Die TGCs sind in der Kultur leicht an vergrößerten Kernen und Zellkörpern zu erkennen.Das TGC-Phänotyp kann ebenfalls durch Immunfärbung eines TGC-Markers, P vier 50 SCC, dargestellt in Grün, und einer Gegenfärbung mit DAPI, dargestellt in Rot, wie hier gezeigt, nachgewiesen werden. Differenzierte Zellen exprimieren P vier 50 SCC, während undifferenzierte Zellen dies nicht tun. Die zytometrische Analyse der differenzierten Zellen, angefärbt mit Propidiumjodid, zeigt darüber hinaus einen höheren DNA-Gehalt, wobei M1 zwei bis vier Kopien und M2 mehr als vier Kopien der DNA repräsentiert.Diese Ergebnisse legen nahe, dass TSLs eine endoreduplikative Teilung durchlaufen, um polyploide TCS zu bilden, die durch die M-Zwei-Population repräsentiert werden. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie man Blastozysten, Ptosen und daraus abgeleitete murine TS-Zellen aus Blastozysten und Ptosen gewinnt. Es ist wichtig, beim Aufbau der TSL-Linien das Auswachsen zu überwachen und sicherzustellen, dass ihre Pluripotenz unter den Kulturbedingungen erhalten bleibt.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

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