Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Mittels quantitativer Real Time-PCR

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Genexpression in Geweben und Entwicklungsstadien des Eschenprachtkäfers mittels quantitativer PCR zu analysieren. Dies wird erreicht durch die Dissektion larvaler Gewebe und die Kategorisierung der Entwicklungsstadien. Als zweiter Schritt erfolgt die RNA-Extraktion aus den Geweben und Entwicklungsstadien unter Verwendung von Triol-Reagenz, die anschließend als Vorlage zur Erzeugung des ersten Strangs, cDNA, dient. Nach der Synthese der ersten Strang-cDNA wird die quantitative RT-PCR durchgeführt.

Es werden Ergebnisse erhalten, die die differenzielle Expression des Zielgens in verschiedenen larvalen Geweben und Entwicklungsstadien anhand der vollständigen Änderungsdaten zeigen, die aus den Schwellenzykluswerten nach der quantitativen R-T-P-C-R-Amplifikation gewonnen wurden. Hallo, ich bin Prakash Mi, der verantwortliche Wissenschaftler dieses Labors am Institut für Entomologie der Ohio State University.

Unser Labor konzentriert sich hauptsächlich auf die genomischen oder molekularen Aspekte der Wechselwirkungen zwischen emal, lash, burer und ash. Das emal, lash Burer oder EAB ist ein exotischer, invasiver Schädling aus China und bedroht das Überleben von Eschenpopulationen in ganz Nordamerika. Heute zeigen wir Ihnen eine Anleitung zur Durchführung einer Genexpressionsanalyse im EAP mithilfe von QPCR oder quantitativer Echtzeit-PCR.

Und die Labormitglieder, die an diesem Protokoll beteiligt sein werden, sind Swapna Priou, die die Val-Dissektionen durchführen wird, und Bin Bandari, der die RNA-Isolierung demonstrieren wird. Schließlich wird Lauren Rivera Vega die qPCR-Analyse durchführen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor auch zur Untersuchung der Genexpression von Ash.

Beginnen wir also. Vor Beginn dieses Verfahrens platzieren Sie Emerald Ash B- oder EAD-Larven auf feuchtem Papiertuch. Bis die Präparationen durchgeführt werden, bewahren Sie frisch hergestellte 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis auf, um die Lösung während der gesamten Präparation kalt zu halten.

Fixieren Sie zunächst die EAB-Larven mit feinen Präparationsnadeln auf der Präparationsplatte. Geben Sie dann kaltes 1× PBS auf die Präparationsplatte. Köpfen Sie die Larven zuerst mit einer feinen Präparationsschere ab.

Entfernen Sie anschließend das letzte abdominale Segment der Larven mit einer feinen Pinzette. Heben Sie die Cuticula vom Larvenkörper ab und führen Sie dann mit einer Schere einen Längsschnitt entlang des Körpers durch. Achten Sie darauf, den Darm nicht zu verletzen.

Während des Schnitts wird das Mitteldarmgewebe vorsichtig von anderen Geweben wie Fettkörpern und Bindegewebe isoliert. Anschließend wird das Gewebe in frischem 1× PBS-Puffer gespült, um sicherzustellen, dass keine Kontamination durch Fettkörper vorliegt. Überführen Sie den Mitteldarm in 500 Mikroliter vorab gekühltes Triol-Reagenz in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen.

Anschließend isolieren Sie mit einer Pinzette das Fettkörpergewebe und überführen es in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen, das 500 Mikroliter kaltes Triol-Reagenz enthält. Abschließend isolieren Sie das Cuticula-Gewebe aus dem Larvenkörper, indem Sie anhaftendes Gewebe vorsichtig abkratzen, wobei Sie darauf achten, die Gewebestruktur nicht zu beschädigen.

Spülen Sie das isolierte Cuticula-Gewebe in frischem PBS-Puffer und überführen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen mit 500 Mikrolitern gekühltem Triazol-Reagenz. Das isolierte Fettkörper-Cuticula- und Mitteldarmgewebe kann bis zur RNA-Extraktion bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Sortieren Sie die verschiedenen EAB-Proben zur Vorbereitung der RNA-Extraktion entsprechend ihren Entwicklungsstadien.

Diese Stadien umfassen das erste, zweite, dritte und vierte Stadium bei Sternen, PrepU und Erwachsenen. Um die RNA-Extraktion zu beginnen, homogenisieren Sie das Gewebe zunächst mit Plastikspateln in 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen, die Triol enthalten. Nach der Homogenisierung bringen Sie das Gesamtvolumen jeder Probe mit dem Triol-Reagenz auf ein Milliliter.

Bei den Entwicklungsstadien das gesamte Tier in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und einem Pistill homogenisieren. Anschließend ein Aliquot des Homogenats zu einem Milliliter Triol hinzufügen. Die Probenröhrchen mit einem Milliliter Triol 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Inkubation 200 Mikroliter Chloroform zu jedem Röhrchen hinzufügen, unmittelbar nachdem der Chloroform zugegeben wurde. Die Röhrchen etwa 15 Sekunden lang kräftig schütteln. Anschließend die Röhrchen bei Raumtemperatur weitere zwei bis drei Minuten inkubieren.

Zentrifugieren Sie die Proben anschließend bei 12.000 ×g für 15 Minuten bei zwei Grad Celsius. Nach der Zentrifugation befindet sich die RNA in der wässrigen Phase. Das Volumen der wässrigen Phase sollte 600 Mikroliter oder 60 % des gesamten Triol-Volumens betragen.

Entfernen Sie vorsichtig ausschließlich die wässrige Phase. Das Vorhandensein von Substanzen unterhalb der wässrigen Phase führt zu einer Kontamination der extrahierten RNA. Überführen Sie anschließend die wässrige Phase in ein angemessen beschriftetes 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen.

Um die RNA aus der wässrigen Phase auszufällen, 0,5 Milliliter Isopropanol zu jedem Röhrchen geben. Die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation die Röhrchen 10 Minuten bei zwei Grad Celsius mit 12.000 G zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand von den Röhrchen verwerfen.

RNA befindet sich im gelartigen Pellet, das sich am Boden des Röhrchens gebildet hat. Waschen Sie das Pellet mit 75 % Ethanol, wobei mindestens ein Milliliter 75 % Ethanol pro einem Milliliter durch Vortexen gemischt wird. Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 7.500 × g für fünf Minuten bei zwei Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand von den Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen erneut für eine Minute in der kleinen Tischzentrifuge. Entfernen Sie überschüssigen Überstand aus dem Röhrchen durch vorsichtiges Pipettieren.

Lassen Sie das Röhrchen offen und trocknen Sie das Pellet fünf bis zehn Minuten lang an der Luft. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stark auszutrocknen, da dies die Löslichkeit nach dem Trocknen erheblich verringern würde. Resuspendieren Sie das Pellet in Dathylpercarbonat oder dep-seh-behandeltem Wasser.

Die Menge an Wasser, die zum Wiederaufnehmen des Pellets verwendet wird, hängt von der Größe des Pellets ab. Verwenden Sie 50 Mikroliter dep-seawater-behandeltes Wasser für ein kleines Pellet oder 100 Mikroliter für ein großes Pellet. Lassen Sie das Pellet vollständig in dep-seawater-behandeltem Wasser auflösen, indem Sie die Pipettenspitze mehrmals auf und ab bewegen.

Nachdem sich das Pellet aufgelöst hat, die Probe 10 Minuten lang bei 55 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Konzentration jeder RNA-Probe mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers bestimmen. Abschließend die Synthese des ersten cDNA-Strangs für die jeweiligen RNA-Proben mit dem Invitrogen Superscript First Strand Synthesis System für RT-PCR durchführen.

Dieses Verfahren ist im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben. Zur Durchführung der quantitativen Echtzeit-PCR oder Q-R-T-P-C-R entwerfen Sie jeden Primer so, dass er eine Schmelztemperatur von 60 Grad Celsius und eine Produktgröße von etwa 100 Basenpaaren aufweist. AP par eins wird in diesem Experiment als Zielgen verwendet.

Für die spätere Analyse und Normalisierung der Daten wird ein Referenzgen oder interne Kontrolle benötigt. Hier wird das ribosomale Protein a P RRP eins als Referenzgen verwendet. Anschließend entwerfen Sie eine Vorlage, die den Probennamen für jede Vertiefung und die QR-tPCR-Platte angibt.

Denken Sie daran, Standards für jedes Gen sowie mindestens zwei technische Wiederholungen pro Probe einzuschließen. Schalten Sie dann die QRT-PCR-Maschine ein und geben Sie die Zyklenparameter ein, um die Platte für die CFX-96-Maschine einzurichten. Bereiten Sie zunächst für jedes Gen einen Master-Mix in einem separaten Reaktionsgefäß pro Vertiefung vor.

Die Master-Mix-Lösung besteht aus zwei Mikrolitern nukleasefreiem Wasser, vier Mikrolitern 2,5× Cyber Green, einem Mikroliter Vorwärtsprimer und einem Mikroliter Rückwärtsprimer, was ein Gesamtvolumen von acht Mikrolitern ergibt. Gemäß der zuvor entworfenen Vorlage geben Sie zwei Mikroliter cDNA zu jedem Ansatz hinzu. Geben Sie anschließend acht Mikroliter der Master-Mix-Lösung in jedes Reaktionsgefäß, sodass sich ein Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern pro Reaktion ergibt. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass die Probe gut vermischt ist.

Überprüfen Sie, dass keine Flüssigkeit an der Spitze verbleibt. Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. Sobald die gesamte Platte vorbereitet ist, verschließen Sie die Platte mit optischem Klebeband.

Vermeiden Sie das Berühren des Klebebands, da das Vorhandensein von Fett die Messung beeinträchtigen kann. Anschließend die Platte 1 Minute bei 500 U/min zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich nach der Zentrifugation alle Inhalte in den Vertiefungen am Boden der Platte befinden. Überprüfen Sie, ob sich kein Eis oder Wasser an der Unterseite der Platte befindet.

Schließlich die Platte in die QR-TPCR-Maschine geben und das PCR-Programm für repräsentative Ergebnisse von EAB-Larven durchführen. Die Dissektion und die QR-TPCR werden hier gezeigt. Bei der Dissektion der EAB-Larve sollte der Mitteldarm in der Mitte der Larve sichtbar werden.

Der Mitteldarm der Larve des EAB wird hier dargestellt isoliert, wobei die mittleren relativen Expressionswerte oder RAVs gezeigt werden. Für das Paratrophin-Gen AP par eins sind die Werte für verschiedene Larvengewebe, einschließlich Cuticula, Mitteldarm und Fettkörper, hier dargestellt. Das EAB-spezifische ribosomale Protein ARP eins wurde als interne Kontrolle zur Normalisierung der für das Gen von Interesse erhaltenen Daten verwendet.

Die relative Faltung von AP AP par eins wurde für die verschiedenen Larven-Gewebe extrahiert. Das Cuticula-Gewebe wies die geringste Expression auf und wurde daher als Kalibratorprobe verwendet, um die mittleren RVs für AP Perry in verschiedenen Entwicklungsstadien des EAB zu bestimmen, einschließlich der ersten, zweiten, dritten und vierten Larvenstadien.

Die PrepU- und Erwachsenenproben wurden unter Verwendung von aprp1 als interner Kontrolle zur Normalisierung der Daten bestimmt. Die relative Mengenänderung von AP-Perry1 wurde für verschiedene Entwicklungsstadien ermittelt. Dabei wies die PrepU-Probe den geringsten mRNA-Spiegel auf und wurde deshalb als Kalibrator verwendet.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man laterale Dissektionen durchführt und anschließend eine Genexpressionsanalyse unter Verwendung des lateralen Gewebes sowie verschiedener Entwicklungsstadien von Emeral ra mittels quantitativer R-T-P-C-R während dieses Verfahrens durchführt. Sie sollten beim Dissektieren vorsichtig sein, um eine Kreuzkontamination der Gewebeproben zu vermeiden. Außerdem ist beim Durchführen der Q-R-T-P-C-R Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die jeweiligen Proben in die entsprechende PCR-Platte pipettiert werden.

Das war's. Vielen Dank für das Anschauen unseres Videos und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.