Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neuronale Zellen im Zebrafischembryo mit hoher Auflösung abzubilden. Zunächst wird DNA, die für ein membranzielgerichtetes grün fluoreszierendes Protein kodiert, in einen Ein-Zell-Stadium-Zebrafischembryo injiziert, was zu einer mosaikartigen Vererbung führt und dadurch eine verbesserte Abbildung einzelner, verstreuter Zellen ermöglicht. Anschließend werden die Embryos immunmarkiert mit Anti-GFP und in Schnitte geteilt, wodurch die Morphologie einzelner Zellen in einer fixierten Probe mit hoher Auflösung sichtbar gemacht werden kann. Alternativ können lebende Embryos mittels Zeitraffer-Videomikroskopie untersucht werden, um zelluläre Dynamiken abzubilden.

Es werden Ergebnisse erhalten, die die Zellmorphologie oder -dynamik zeigen. Hier wird das Hinterhirn des Zebrabärblings mit der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Hallo zusammen.

Ich bin PR Chandran aus dem Labor von Dr. Rachel Brewster der Abteilung für Biowissenschaften an der University of Maryland Baltimore County. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, um neuronale Zellen in Zebrafischembryonen mit höherer Auflösung zu markieren und abzubilden. Dieses Verfahren verwenden wir typischerweise im Labor, um die Mechanismen der Neurogenese in Zebrafischembryonen auf zellulärer Ebene zu untersuchen.

Beginnen wir also. Legen Sie feuchte Kim-Tücher um den Rand einer 100 Millimeter großen Petrischale.

Befestigen Sie vorsichtig eine Glas-Mikroinjektionsnadel an einem Wachsstreifen innerhalb der befeuchteten Schale. Richten Sie unter einem Stereomikroskop die Nadel an einem skalierten Objektträger aus. Um eine Spitze von geeigneter Größe zu erhalten, tippen Sie mit einer sauberen Rasierklinge vorsichtig an der Stelle auf die Nadel, an der sie einen Durchmesser von einem Mikrometer aufweist.

Schließen Sie die Nadel an die Mikroinjektionsapparatur an und pipettieren Sie 0,5 Mikroliter einer Lösung aus Phenolrot und Wasser auf Parafilm. Füllen Sie die Nadel von vorn mit den Tröpfchen auf. Stellen Sie den Mikroinjektionsdruck auf sieben Kilopascal ein und beginnen Sie mit einem 20-Millisekunden-Impuls. Zählen Sie die Anzahl der Impulse, die benötigt werden, um die gesamte Flüssigkeit abzugeben. Variieren Sie die Zeit zwischen 10 und 30 Millisekunden, sodass etwa 250 Impulse zum Austragen benötigt werden.

0,5 Mikroliter der Lösung. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Nadel mit 0,5 bis einem Mikroliter MG FPD NA in Wasser, gemischt mit Phenolrot zur Visualisierung, rückwärts aufzufüllen. Decken Sie die befeuchtete Schale ab, um die Verdunstung der Lösung aus der Nadel unter dem Stereomikroskop zu verhindern.

Platzieren Sie Einzelzellstadium-Fischembryonen in einer 60 mm Petrischale, die mit Embryo.Medium gefüllt ist. Verwenden Sie feine Pinzette, um die Chorionhülle vorsichtig zu fassen und den Embryo zu stabilisieren. Führen Sie die mit MGFP und Phenolrot gefüllte Nadel in den Zielbereich für die Injektion ein.

Für eine weiträumige MGFP-Expression in den Dotter oder das Zytoplasma injizieren. Mit der Mikroinjektionsapparatur etwa zwei Nanoliter der MGFP-Lösung applizieren. Die Position des Phenolrot-Indikators beobachten, um eine korrekte Injektion zu bestätigen.

Entfernen Sie die Nadel vorsichtig vom Embryo. Injizieren Sie alle Embryonen in der Petrischale, jeweils bis zu 30 Embryonen gleichzeitig. Vermeiden Sie eine Belichtung der Embryonen und inkubieren Sie sie bei 28,5 Grad Celsius, um die Entwicklung der Embryonen bis zum gewünschten Stadium unter dem Stereomikroskop zu ermöglichen.

Verwenden Sie feine Pinzette, um die Chorionhülle vorsichtig von den Embryonen zu lösen. Benutzen Sie eine Pasteurpipette, um die leeren Chorionhüllen aus der Schale zu entfernen, sodass nur die dechorionierten Embryonen zurückbleiben. Überführen Sie die injizierten dechorionierten Embryonen mit einer flammenglasierten Pasteurpipette in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Entfernen Sie so viel überschüssiges Medium wie möglich und geben Sie dann ein Milliliter ative hinzu. Waschen Sie die Embryonen bei Raumtemperatur dreimal für jeweils fünf Minuten in einem XPBS. Überführen Sie die Embryonen unter dem Stereomikroskop in eine Petrischale, die mit einem XPBS gefüllt ist.

Verwenden Sie feine Pinzetten, um das Embryo in der Schwanzregion zu halten. Nutzen Sie eine zweite Pinzette oder einen Stab, um so viel Dotter wie möglich zu entfernen, ohne die Region des Hinterkörpers zu berühren. Unter dem Stereomikroskop heben Sie das Embryo mit der feinen Pinzette aus der Schale und in eine Einbettform, die mit 4 % Low-Melting-Point-Agarose gefüllt ist.

Positionieren Sie das Embryo an einem Ende der Form. Lassen Sie das Aros bei Raumtemperatur erstarren. Verwenden Sie einen Spatel, um den erhärteten Aros-Block aus der Form zu entfernen, und schneiden Sie mit einer angehobenen Klinge gleichmäßig das untere Ende des Blocks ab.

Falls gewünscht, verwenden Sie einen Tropfen Sekundenkleber, um den Block mit der Schnittfläche nach unten auf der Vibratostufe zu befestigen. Richten Sie mehrere Blöcke auf der Stufe aus. Befestigen Sie die Stufe am Vibratomikrotom.

Stellen Sie sicher, dass die Klinge jeden Embryo vollständig durchschneidet, jedoch nicht vollständig durch den Block hindurchgeht. Füllen Sie die Stufe mit einem XPBS-Abschnitt. Die Embryos vorsichtig bis zum Hintergrund eines Arou-Blocks durchschneiden und in eine Petrischale überführen, die mit einem XPBS gefüllt ist.

Trennen Sie die Abschnitte unter dem Stereomikroskop. Verwenden Sie feine Pinzette, um die gewünschten Abschnitte in eine Mehrfachbrunnenplatte mit einem XPBS zu überführen. Verwenden Sie für jeden Embryo eine separate Brunnen.

Färben Sie die Schnitte mit DPI und immunmarkieren Sie sie mit Anti-GFP. Andernfalls innerhalb von 48 Stunden abbilden. Bis zu sechs Schnitte pro Objektträger montieren und für die konfokale Bildgebung einen Deckglaser auf die Schnitte auflegen.

Bewahren Sie die Objektträger im Dunkeln auf, um eine Photobleiche zu vermeiden. Bei der Live-Bildgebung müssen die mit MGFP injizierten Embryonen vor Licht geschützt werden. Verwenden Sie Pinzetten, um die Embryonen 30 Minuten vor Erreichen des gewünschten Entwicklungsstadiums zu beschichten.

Überführen Sie die beschichteten Embryonen in eine Sedativlösung aus Embryomedien mit 0,01 % Trica und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie einen Tropfen 1 % iger Agarose in Wasser auf eine 35 mm Glasboden-Kulturschale, sodass diese die Form ausfüllt. Lassen Sie die Agarose erstarren.

Verwenden Sie die 90 Millimeter lange Glaskapillare, um drei Löcher in den Tropfen mit Aros unter dem Stereomikroskop zu bohren. Untersuchen Sie die Unterseite der Vertiefung und entfernen Sie mit der Pinzette eventuell verbliebene Aros-Reste. Füllen Sie die Schale unter dem Stereomikroskop mit Embryomedium auf.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um ein Embryo nach dem anderen in jede Vertiefung der aros zu überführen. Richten Sie den Embryo mit feinen Pinzetten so aus, dass der interessierende Bereich, in diesem Fall der dorsale Kopfbereich, an dem Glas anliegt. Decken Sie die Petrischale ab.

Transportieren Sie die Petrischale vorsichtig auf den Objekttisch eines konfokalen Mikroskops. Verwenden Sie Heizstrahler, um die Embryonen während der gesamten Bildaufnahme bei 28,5 Grad Celsius zu halten. Hier ist ein Schnitt durch das Rückenmark eines Wildtyp-Embryos im Stadium von vier bis fünf Somiten, der doppelt gefärbt ist: membrangebundenes GFP in Grün und D in Blau. Nur eine Zelle ist mit membrangebundenem GFP markiert, was eine hochauflösende Abbildung der zellulären Morphologie und Organisation ermöglicht.

Dies ist ein vergleichbares Bild des Hinterhirns eines nardi din-Mutanten im Stadium von vier bis fünf Somiten. Dieses Bild zeigt, dass die Zellen in nardi-Mutanten während der Neurodifferenzierung nicht korrekt zur Mittellinie ausgerichtet sind. Im Gegensatz zur Methode, Zellen mit MGFP zu markieren, ermöglicht die Markierung des Hinterhirns mit einem allgemeinen Marker der Zelloberfläche, wie Beta-Catenin, nicht die Visualisierung der Morphologie einzelner Zellen.

Die zeitraffende Bildgebung des Hinterhirns eines mit MG FP markierten Embryos zeigt, dass die zellulären Vorgänge, die die Neurogenese im Zebrafisch antreiben, sehr dynamisch sind und die Ausbildung von Membranfortsätzen umfassen, während die Zellen wandern und miteinander in Kontakt treten. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man sowohl fixierte als auch lebende Zebrafisch-Embryonen für die hochauflösende Einzelzell-Bildgebung vorbereitet. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.