Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Erzeugung eines zerebralen Infarkts durch endovaskuläre Okklusion der Arteria cerebri media beim Rattenmodell. Dieses weit verbreitete Tiermodell in der Schlaganforschung führt zu Ischämie in der zerebralen Rinde sowie in subkortikalen Strukturen, einschließlich der Basalganglien und des Hypothalamus. Das Modell kann entweder permanente oder transiente zerebrale Ischämie erzeugen.

Abhängig davon, ob die intraluminale Naht an Ort und Stelle belassen wird oder nach einer definierten Zeit entfernt wird. Die zerebrale Ischämie verursacht einen Infarktkern, in dem Zelltod auftritt, sowie eine periischämische Region, die als Penumbra bezeichnet wird, in der eine teilweise zelluläre Erholung möglich sein könnte. Bevor wir beginnen, nehmen wir uns einen Moment Zeit, um die Schritte zu beschreiben, denen wir folgen werden.

Hier sehen wir ein vereinfachtes Schema des kranialen Kreislaufsystems der Ratte. Bei diesem chirurgischen Eingriff wird die linke A. carotis nahe der Bifurkation der Arteria carotis communis (CCA) in die A. carotis externa (ECA) und die A. carotis interna (ICA) freigelegt. Zwei kleine Äste der ECA, die A. occipitalis und die A. thyreoidea superior, werden mittels bipolarer Koagulation ligiert, und die ECA wird distal zu diesen beiden Ästen mit einer Seidennaht abgebunden. Anschließend werden mikrovaskuläre Klammern mit Hilfe einer Seidennaht an der Arteria carotis communis und der Arteria carotis interna angebracht.

Ein Nyloneinzelstrang-Faden mit einer silikonbeschichteten Spitze wird dann durch einen Schnitt in die A. carotis externa eingeführt und in Richtung A. carotis interna weitergeführt. Dieser intraluminale Faden wird leicht mit einem Seidenfaden an der A. carotis externa fixiert, bevor der Mikroclip an der A. carotis interna gelöst wird. Der intraluminale Nylonfaden wird anschließend etwa zwei Zentimeter vorgeschoben, bis die Silikonspitze den Ursprung der Arteria cerebri media oder A. cerebri media verschließt.

Der zweite Mikroclip wird von der A. carotis communis entfernt und die Okklusionsdauer gestoppt. Nachdem wir nun einen Überblick über das Verfahren haben, kommen wir zum chirurgischen Teil. Bereiten Sie die Versuchstierpräparation wie bei jedem chirurgischen Eingriff gemäß den Tierschutzrichtlinien Ihrer Institution vor. Wir stellen das Tier mittels 5 % Isofluran zur Induktion bei einem Sauerstofffluss von einem Liter pro Minute und einem Lachgasfluss von einem Liter pro Minute in Narkose und reduzieren die Isoflurankonzentration zur Aufrechterhaltung auf 1–2 %.

Nach Erreichen einer analgetischen Ebene tragen wir künstliche Tränen-Salbe auf beide Augen auf und rasieren den Hals mit einem Schermesser. Anschließend wird die Region mit Betadine-Lösung und danach mit 70 % Ethanol desinfiziert. Dieser Vorgang sollte insgesamt dreimal mit Betadine- und 70 % Ethanol-Spülungen wiederholt werden.

Das Rote wird in eine sterile Socke gelegt und auf eine thermoregulatorische Decke gelegt. Um eine Hypothermie zu verhindern. Es ist hilfreich, den Hals leicht anzuheben, indem man ein 15 ml kegelförmiges Reagenzglas unter den Kopf des Roten schiebt.

Dies erleichtert später die Freilegung der Arteria carotis. Schließlich werden 0,2 ml einer 0,5%igen Betäubungslösung subkutan entlang der geplanten Inzisionsstelle unter dem Operationsmikroskop injiziert, um eine postoperative Schmerzlinderung zu gewährleisten. Führen Sie einen medianen Schnitt mit einer Klingennummer 10 durch.

Die verbleibende Sektion erfolgt auf der linken Seite des Tieres bezüglich der Mittellinie. Beginnen Sie mit dem Durchtrennen der oberflächlichen Faszie. Dies geschieht durch eine Kombination aus stumpfer und scharfer Sektion.

Umfangreiches Drüsengewebe ist seitlich sichtbar, während der große Musculus sternalis od. mittig über der Mittellinie liegt. Die Trachea – verwenden Sie Wattestäbchen, um die Drüse seitlich und den Musculus sternohyoideus medial zu dissezieren. Unterhalb des Drüsengewebes sehen Sie die Musculi digastrici und sternocleidomastoidei, die zusammen mit dem mittig gelegenen Musculus sternohyoideus ein subtiles Dreieck bilden, dessen Spitze umkreist ist.

In diesem Dreieck wird die Dissektion bis zur Arteria carotis fortgesetzt. Verwenden Sie eine Mikroschere, um durch die Faszie zu schneiden, die die Muskulatur bedeckt. Dies ermöglicht es, die Muskeln zurückzuklappen und die darunterliegenden Gefäße freizulegen.

Zahnstocher mit Watteauflage können verwendet werden, um die Muskeln zurückzuziehen und die Arteria carotis communis, die äußere, die tiefe äußere sowie die innere Halsarterie sichtbar zu machen. Setzen Sie die Präparation fort, um die A. carotis externa entlang ihrer Äste freizulegen. Dies erfordert eine sorgfältige scharfe Dissektion der Gefäße.

Das Ziel dieser Schritte besteht darin, die A. carotis externa und die A. carotis interna vom darunterliegenden Bindegewebe zu lösen. Setzen Sie die Präparation der A. carotis externa fort. Beachten Sie, dass der HI-Knochen auftreten kann, was den kaudalen Fortgang der Präparation begrenzt.

Der Vagusnerv, der weißlich erscheint, verläuft entlang der lateralen Seite der Arteria carotis communis und der Arteria carotis interna; wir haben ihn scharf von der A. carotis communis und der A. carotis interna disseziert. Zwei Abzweigungen der A. carotis externa werden ebenfalls scharf disseziert. Der erste laterale Zweig ist die Arteria occipitalis, der zweite mediale Zweig ist die Arteria thyroidea superior.

Sowohl der erste als auch der zweite Seitenast der A. carotis externa werden kauterisiert und anschließend durchtrennt. Das Durchtrennen dieser Äste erleichtert die Mobilisation der Gefäße. Später im Verlauf des Verfahrens wird die A. carotis externa mithilfe einer Seidennaht so distal wie möglich sicher abgebunden.

Legen Sie eine weitere Seidennaht locker um die A. carotis externa proximal zur Bifurkation der Arteria carotis communis. Achten Sie darauf, dass diese Naht das Gefäß nicht verschließt, da der endovaskuläre Faden zur Okklusion der Arteria cerebri media verwendet wird. Wir werden durch diesen Abschnitt der A. carotis externa vordringen und mikrovaskuläre Klammern sowohl an der Arteria carotis communis als auch an der Arteria carotis interna anbringen.

Diese Position liegt etwas entfernt vom Ursprung der A. carotis externa. Erstellen Sie anschließend eine partielle Arteriotomie zwischen den beiden Seidenligaturen an der A. carotis externa. Eine geringe Menge an verbleibendem Blut kann austreten, jedoch deutet starkes Bluten wahrscheinlich auf eine unsachgemäße Anwendung der mikrovaskulären Klammern hin.

Stellen Sie in diesem Fall sicher, dass kein darunterliegendes Gewebe in den Klammerblättern eingeklemmt ist, was einen vollständigen Verschluss verhindern könnte. Der nächste Schritt besteht darin, ein drei Zentimeter langes Stück Monofile-Nylonnaht in die A. carotis externa einzuführen. Es ist hilfreich, die Naht zwei Zentimeter von ihrer silikonbeschichteten Spitze entfernt zu markieren.

Diese Nähte sind im Handel erhältlich, und Durchmesser sowie Länge der Silikonbeschichtungsspitze können je nach Alter und Gewicht der verwendeten Ratten individuell angepasst werden. Für 300-Gramm-Ratten verwenden wir einen Nadelspitzen-Durchmesser von 0,39 Millimetern und eine Silikonbeschichtungslänge von zwei bis drei Millimetern an einer 4-0-Nylonnaht. Führen Sie die okkludierende Nylonnaht in das Lumen der A. carotis externa in Richtung Arteria carotis communis ein.

Ziehen Sie die Seidenlitze um den ECA-Stumpf fest, um die intraluminale Nylonlitze zu sichern und Blutungen zu verhindern. Schneiden Sie den verbleibenden Teil des ECA ab, um den Stumpf freizulegen, und positionieren Sie den ECA-Stumpf unterhalb des Bifurkationspunkts, sodass er ungefähr in einer Linie mit der A. carotis interna liegt. Dadurch kann die intraluminale Litze leichter in die Arteria carotis interna gleiten.

Entfernen Sie die mikrovaskuläre Klemme von der A. carotis interna. Denken Sie daran, die Klemme langsam zu öffnen, um vor der vollständigen Entfernung auf Blutungen zu prüfen. Führen Sie die Nylonschnur weiter in das Lumen der A. carotis interna ein, bis sie die Arteria cerebri media erreicht.

Diese Länge beträgt typischerweise etwa zwei Zentimeter und ist der Grund dafür, eine Markierung an der Naht vor dem Einsetzen anzubringen. Nachdem eine variable Länge einer Nylonnaht eingeführt wurde, kann ein Widerstand spürbar sein; tritt Widerstand auf, während noch ein erheblicher Teil der Nylonnaht außerhalb des Gefäßes vorhanden ist, deutet dies wahrscheinlich darauf hin, dass die Naht in die Arteria palatina descendens eindringt. In diesem Fall die Naht zurückziehen und leicht krümmen, um entlang der A. carotis interna fortzufahren, die sich unmittelbarer fortsetzt.

Beachten Sie die Positionsänderung der Naht innerhalb des ICA-Lumens in diesen beiden Vergleichsaufnahmen. Fahren Sie mit dem Vorschieben der Naht durch die ICA fort, bis der größte Teil der Naht eingeführt ist und an dieser Stelle erneut ein Widerstand spürbar wird. Die intraluminale Naht hat den Ursprung der A. cerebri media blockiert.

Starten Sie die Stoppuhr und dokumentieren Sie die Okklusion. Startzeitpunkt. Entfernen Sie die andere mikrovaskuläre Klemme von der A. carotis communis, schließen Sie die Inzision schnell und sorgfältig.

Stellen Sie die Ratte in einen Erholungskäfig. Überprüfen Sie kurz vor dem Ende der Okklusionszeit, dass der Käfigboden um Nase und Mund frei von Einstreu ist, betäuben Sie die Ratte und öffnen Sie den Einschnitt erneut, indem Sie die Verschlussnähte entfernen. Bringen Sie wie zuvor einen Mikroclip an der A. carotis communis (CCA) an.

Ziehen Sie die okkludierende Naht teilweise aus der A. carotis interna heraus, bis das Ende der Naht durch die A. carotis interna sichtbar ist. Entfernen Sie die Naht noch nicht vollständig. Setzen Sie jedoch eine weitere Mikroklemme an die A. carotis interna oberhalb der Position der intraluminalen Naht, entfernen Sie vollständig die okkludierende Naht und ligieren Sie den Stumpf der A. carotis externa.

Notieren Sie den Zeitpunkt des Reperfusionsbeginns. Entfernen Sie die Mikroklemmen von der A. carotis interna und von der A. carotis communis, befeuchten Sie den Bereich mit mehreren Tropfen steriler Kochsalzlösung und verschließen Sie die Inzision mit einer Naht. Zur zusätzlichen postoperativen Analgesie injizieren wir Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.

Wir verabreichen außerdem fünf Mikel physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal, um während der Erholungsphase eine ausreichende Flüssigkeitszufuhr sicherzustellen. Nachdem die Ratte die Narkose überwunden hat, testen Sie das Verhalten als Hinweis auf eine Infarktbildung, indem Sie die Ratte am Schwanz halten und beobachten, ob sie während dieses erhöhten Körperschwingtests in beide Richtungen drehen kann; einseitiges Zusammenkrümmen ist wie erwartet. Ratten mit Schlaganfallsymptomen können sich auch während Bewegungen im Freifeld einseitig im Kreis bewegen.

Hier zeigen wir die Ergebnisse einer 60-minütigen MCA-Okklusion bei spontan hypertensiven Ratten. Die Magnetresonanztomographie wurde 24 Stunden nach MCAO durchgeführt, und T2-gewichtete Bilder sind dargestellt. Diese Ratte entwickelte einen großen Infarkt, der kortikale und striatale Regionen betraf.

Der hyperintense Bereich in der MRT ist gelb hervorgehoben, obwohl wir die Ergebnisse hier nicht zeigen. Durch die MRT sichtbar gemachte infarzierte Bereiche können weitergehend mittels diffusionsgewichteter Bildgebung und Apparent-Diffusionskoeffizienten-Karten analysiert werden. Die infarzierten Regionen werden zudem durch histologische Färbung frisch isolierter Gehirnschnitte mit Triphenyltetrazoliumchlorid bestätigt, da die Dehydrogenase in lebendem Gewebe das Substrat in einen unlöslichen roten Farbstoff umwandelt.

Daher bleiben die infarzierten Bereiche ungefärbt und erscheinen weiß. Beachten Sie, dass die Infarctgröße von mehreren Faktoren abhängen kann, einschließlich der Rattenstamm-Linie und der Körpergröße des Tieres. Wir verwenden spontan hypertensive Ratten, da sie konsistentere Infarctgrößen erzeugen als andere häufig verwendete Stämme wie frogg, dolly oder wistar Ratten.

Es ist außerdem wichtig, ein Zielgewicht für die Ratte zu standardisieren, um Variationen im Gefäßdurchmesser und damit in der resultierenden Wirksamkeit der MCAA-Okklusion zu reduzieren. Wir hoffen, dass Ihnen dieses Video bei der Durchführung der MCA-Okklusionstechnik in Ihrem eigenen Labor hilfreich war. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.