Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Hallo, ich bin Spencer Curley von der University of California Irvine und dem Labor von Ed Maki, und ich werde demonstrieren, wie man Kryosektionen durchführt. Um das zu tun, verwende ich zuerst diese häufig verwendeten Reagenzien. Die Einbettmasse oder das Einbettmedium, das ich verwende, wird OCT genannt, um eine optimale Schnitttemperatur zu erreichen.

Es ist eine klare Lösung, sie ist sehr dick und viskos, und sie hält das Gewebe gut, während man es ausrichten kann, und dann gefriert es, und letztendlich ist es wasserlöslich, so dass man es bei jeder Art von Färbeverfahren loswerden kann. Also bette ich das Gewebe in eine Form ein. Diese Biopsiebehälter für Kryoformen sind in verschiedenen Größen erhältlich.

Ich werde diese kleinere Form hier verwenden, weil ich embryonales Gewebe von Mäusen mache. Wir frieren unser Gewebe und flüssigen Stickstoff schockfrosten. Zuerst werde ich also diese schützende Isolierflasche mit flüssigem Stickstoff aus unserem Tank hier füllen.

Vor dem Schockfrosten des Gewebes muss man das Gewebe kryoschützen, sonst zerstört das Einfrieren selbst das Gewebe. Was Sie also tun, ist, das Gewebe über Nacht in eine 30%ige Saccharoselösung zu tauchen. Und wenn es länger dauert, ist das in Ordnung, genauso lange wie das Gewebe absinkt.

Und wie Sie sehen können, sind die Mäuseköpfe des embryonalen Tages 12,5 in der, in der Saccharoselösung versunken, so dass sie bereit sind, eingefroren zu werden. Jetzt gieße ich einfach das Gewebe, das sich in einer Saccharoselösung befindet, in eine größere Schale, damit ich das Gewebe manipulieren kann. Ich nehme etwas von diesem OCT und gieße es in diese 35-Millimeter-Schale, die tatsächlich auf dem Deckel ruht, damit ich sie schräg aufstellen kann.

Das OCT sammelt sich also entlang der Kante, um Tiefe zu erzeugen. Also benutze ich ein Paar älterer, abgestumpfter Pinzetten, einfach weil man sie nicht scharf haben muss und man nicht ein anderes Paar Pinzetten ruinieren will. Also nehme ich sie und hebe einen dieser Köpfe ganz sanft heraus und lege ihn in dieses erste OCT-Bad.

Ich möchte den Embryo nur in OCT beschichten. Dies ermöglicht ein besseres, gleichmäßigeres Einfrieren des Gewebes. Sie möchten keine Saccharosereste um das Gewebe herum oder Luftblasen.

Vermeiden Sie auf jeden Fall Luftblasen. Also rühre ich das OCT einfach sanft um und unter dem Kopf herum, bewege den Kopf, bewege den Kopf durch das OCT und lasse es nur ein paar Sekunden dort ruhen, während ich meine Kryoform fülle. Jetzt werde ich also die Kryoform wieder mit dem OCT füllen, um Blasen zu vermeiden.

Und ich werde es einfach bis zum oberen Rand der Form füllen. Und wie Sie bemerken werden, habe ich die, die Form, beschriftet. Also werde ich in der Lage sein, meine Orientierung zu sehen, nachdem es eingefroren ist.

Wenn das OCT gefriert, färbt es sich weiß und Sie können Ihr Gewebe nicht mehr sehen. Sie möchten also auf jeden Fall mit einem Permanentmarker beschriften. Das, die Kryoform.

Ich habe tatsächlich eine Blase in das OCT bekommen, also werde ich meine Pinzette benutzen, um sie einfach über den Rand zu drücken. Du willst nicht, dass das dein Einfrieren deines Gewebes beeinträchtigt. Jetzt übertrage ich den Kopf aus dieser Schale in das OCT, das sich in meiner Form befindet.

Ich hebe es einfach aus der Form und lege es sehr vorsichtig in die Form. Dann gehe ich zum Mikroskop, wo ich das Gewebe ausrichten werde. Ich habe das Gewebe hier in meiner Kryoform und werde durch das Zielfernrohr schauen, damit ich es ausrichten kann.

Ich werde koronale Schnitte durch diesen Mauskopf machen. Also muss ich es so ausrichten, dass ich es im Kryostaten für koronale Schnitte positionieren kann. Also benutze ich wieder diese alte, stumpfe Pinzette und wie Sie sehen können, gibt es hier einige Blasen und ich werde mein Bestes geben, um sie herauszubekommen.

Aber diese kleineren Blasen sind es nicht, sie sind nicht schlecht. Bei diesen kleineren Blasen ist mir nichts aufgefallen. Sie wollen einfach keine großen Blasen.

Also werde ich sie einfach so gut es geht rausschieben und die Pinzette auf jeden Fall oft abwischen, weil man so Blasen besser vermeiden kann. Und jetzt, wenn Sie meine Beschriftung sehen können, habe ich hier oben ein t und hier links von mir. Das bedeutet mir nur, dass der Kopf, der Scheitel des Kopfes nach oben und die Vorderseite oder das Gesicht zu meiner Linken sein wird.

Auf diese Weise weiß ich, durch welche Oberfläche ich für koronale Schnitte schneiden muss, und ich stupse das Gewebe nur an. Und auch hier führt das manchmal zu Blasen, die man einfach nur herausdrücken möchte, damit sie nicht neben dem Gewebe gefrieren. Es ist also schlecht, Blasen zu haben, vor allem, weil die Gewebeblasen beim Einfrieren dazu führen können, dass Sie inkonsistent einfrieren.

Der Zweck des Schockfrostens besteht darin, alles auf einmal einfrieren zu lassen. Wenn Sie das Gewebe und den Kryostaten durchschneiden, kann die Klinge, wenn sie durch eine Blase und nicht durch das OCT oder das Gewebe geht, einen Haken oder einen Riss verursachen und Ihr Gewebe zerstören oder, wissen Sie, brechen. Du solltest also auf jeden Fall vermeiden, wie diese Blasen um jeden Preis entstehen.

Vor allem die größeren. Also orientiere ich es hier immer noch. Dieses Gewebe wurde 24 Stunden lang fixiert, so dass es ziemlich robust für meine Manipulationen ist.

Anderes Gewebe kann etwas weicher sein, also solltest du einfach sehr sanft sein. Sobald ich es also mit dem Gesicht nach links und dem oberen Rand des Kopfes nach oben unter dem Zielfernrohr positioniert habe, muss ich sicherstellen, dass es auch in anderen Ausrichtungsebenen korrekt ist. Also werde ich alle Flächen des Würfels anheben und durchschauen, um sicherzustellen, dass er richtig ist.

Und ich sehe, dass es leicht nach unten geneigt ist, so dass ich es nur mit meiner Pinzette anheben muss. Okay? Und das braucht definitiv viel Übung. Okay, es sieht gut aus.

Jetzt gehe ich hierher und friere es in flüssigem Stickstoff ein. Okay, jetzt, da das Gewebe in der Kryoform richtig ausgerichtet ist, werde ich meinen flüssigen Stickstoff in diese Schale hier gießen. Dies ist nur eine normale Petrischale aus Kunststoff für die Gewebekultur bis zum Rand.

Es verdunstet ziemlich schnell. Ich werde meine Pinzette nehmen und die Kryoform absenken. Und wie ihr seht, habe ich tatsächlich die Unterlippe verbogen.

Das ermöglicht definitiv ein besseres, besseres Handling. Ich werde es einfrieren. Und wenn das Taschentuch und das OCT gefrieren, färbt es sich durchgehend weiß.

Und wenn es fertig ist, wird alles weiß sein. Und dann muss ich schnell, das, das gefrorene Taschentuch zur Lagerung in den minus 80° Gefrierschrank legen. Sie möchten es so halten, dass das Gewebe nicht untergetaucht wird.

Man muss also sehr vorsichtig sein, nur um es in der oberen Oberfläche von flüssigem Stickstoff zu halten. Okay, jetzt ist es eingefroren. Halten Sie es dort für ein paar zusätzliche Sekunden, bevor ich auf minus 80 gehe.

Okay, jetzt bringe ich es auf minus 80. Also habe ich mein Gewebe von den minus 80 entnommen und in diesen Kryostaten hier gelegt. Die Kammer ist tatsächlich auf minus 24 Grad Celsius heruntergefallen.

Im Moment müssen Sie das Gewebe etwa eine halbe bis eine Stunde lang ausgleichen lassen, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen können. Sonst ist es zu spröde. Obwohl also alle Kryo-Werte unterschiedlich sind, werde ich hier nur auf einige der grundlegenden Dinge über diese Maschine hinweisen.

So verwenden wir die Leica CM 30 50 s. Es ist eine gute Maschine, weil sie über eine separate Kühleinheit für die Probe selbst verfügt, was ein schöner zusätzlicher Vorteil ist. Sie können die Probentemperatur einstellen lassen und, und verschiedene Gewebe erfordern unterschiedliche Temperaturen zum Schneiden.

Wenn Sie also zum ersten Mal Ihr Taschentuch belasten, müssen Sie einige Anpassungen vornehmen. Und diese sind bei allen Kryo-Stats ähnlich. Dabei handelt es sich um Elektronik, einige davon sind handbetrieben.

Zum Beispiel müssen Sie den Arm des Kryostaten ein- oder zurückziehen, um ihn weiter oder näher an der Klinge zu positionieren. Sie können das schnell oder langsam tun. Sie können die Dicke Ihres Schnitts mit einstellen, mit diesem Plus oder Minus hier.

Und Sie wählen zwischen Beschnitt oder Schnittstärke, die hier in der mittleren Schaltfläche angezeigt wird. Sie stellen die Temperatur der Kammer oder der Probe selbst neben dieser Digitalanzeige ein, indem Sie einfach darauf drücken und mit diesen Pfeilen nach oben oder unten die Temperatur einstellen. Für uns verwenden wir also beim Kryoschneiden diese Super Frosts der Fischfischermarke plus Objektträger.

Sie sind mit etwas Klebstoff beschichtet, damit sich das Gewebe während der Verarbeitung nicht ablöst. Manchmal werden Sie während des Schneidens feststellen, dass das Gewebe etwas weich erscheint, und einige Anzeichen dafür sind, wenn es auf die Klinge trifft und sich zusammenballt. Und was Sie verwenden können, um das zu beheben, ist dieses superfreundliche Einfrieren der Marke Fisher.

Es ist, es friert das Gewebe ein und man zielt einfach auf sein Taschentuch und drückt den Auslöser, und es wird das Gewebe schnell wieder einfrieren, wenn es zu weich ist. Bevor ich das Gewebe zum Schneiden auf ein Spannfutter montiere, möchte ich Ihnen hier einen kurzen Rundgang durch einige der Dinge in der Maschine geben. Hier laden Sie also tatsächlich die Klinge, die mit dieser Metallplatte gesichert ist.

Wenn Sie diesen Arm nach oben ziehen, können Sie die Klinge bei Bedarf entfernen und austauschen. Stellen Sie sicher, dass es schön und sicher ist. Sie sollten die Klinge nicht zu stark sichern, da sie sich sonst tatsächlich verzieht.

Und Sie werden bei Ihrer Schnitteinteilung feststellen, dass die Gewebedicke nicht konsistent ist. Du willst also, du willst nicht, dass du den, diesen Arm ganz nach unten schiebst. Man will es einfach dorthin bringen, wo es darum geht, auch mit der Klinge selbst.

Dies hier ist eine weitere Sache, die Sie möglicherweise während des Schneidens anpassen müssen. Es wird als Anti-Roll-Platte bezeichnet. Es ist ein Stück Glas, das hier in diese Halterung passt und das Sie mit dieser federbelasteten Schraube hier einstellen können.

Und man bewegt es im Grunde vorwärts oder rückwärts. Und das hält Ihr Taschentuch oder Ihre Abschnitte flach, so dass Sie sie auf einer Folie befestigen können. Eine andere Sache, die Sie während des Schneidens anpassen möchten, ist die Stelle auf der Klinge, die den eigentlichen Schnitt durchführt.

Wie stellen Sie das also ein, indem Sie einfach diesen Hebel anheben und die ganze Vorrichtung nach links oder rechts schieben können. Und das verwenden Sie wirklich nur, wenn Sie bemerken, dass Ihr Taschentuch an einem bestimmten Teil der Klinge hängen bleibt, oder wenn Sie Klingen sparen möchten, weil sie ziemlich teuer sind. So können Sie einen schönen, sauberen Bereich finden, indem Sie diesen einfach hin und her bewegen.

Eine andere Sache, die Sie einstellen können, ist der Schnittwinkel. An der Seite hier, die Sie nicht sehen können, gibt es drei verschiedene Positionen. Wir verwenden einfach die mittlere Position und Sie stellen diese ein, indem Sie diesen anderen Hebel anheben.

Und, und das kann, Sie können diese Vorrichtung auf und ab fahren lassen. Wir halten es immer in der Mitte. Also belasse ich es jetzt einfach dabei.

Das hier hinten ist also der, der Kopf des Kryostaten. Er hält die gefrorene Gewebeprobe, während sie geschnitten wird. Er schwingt auf und ab und bewegt sich in Richtung Klinge.

Und im Grunde montiert man das Gewebe auf dieses Spannfutter hier und wir platzieren das Spannfutter im Kopf, ziehen es fest und verwenden dann diese Knöpfe auf der Rückseite, um den Winkel so einzustellen, dass es ein geraderer Schnitt wird. Jetzt werde ich das Gewebe auf das Spannfutter montieren. Sie möchten die Spannfutter bei Raumtemperatur halten, da Sie zuerst eine Schicht OCT hinzufügen und nicht möchten, dass diese sofort einfriert, da Sie möchten, dass es eine schöne flache Schicht ist.

Und wir werden diese Vorrichtung hier zu einem verwenden, es wird ein Wärmeabzug genannt. Tatsächlich wird es verwendet, um das OCT zu glätten, wenn es einfriert. Was ich also zuerst mache, ist, dass ich die Raumtemperaturprüfung mache und sie hier in diesen Halter lege.

Nimm ein paar meiner OCT-Blasen. Spielt hier keine Rolle, denn sie werden verdrängt. Fügen Sie einfach ein, ein wenig, nicht viel brauchen Sie.

Nehmen Sie den Wärmeabzug und setzen Sie ihn einfach genau hin. Warten Sie einige Sekunden. Und dann sieht man, dass das OCT schön flach ist.

Jetzt habe ich also mein Taschentuch und muss das tatsächliche OCT markieren. Okay, ich markiere einen Punkt auf dem, dem OCT, um seine Position anzuzeigen. Da habe ich also gerade den oberen Punkt mit einem blauen Punkt markiert.

Jetzt nehme ich also den Gewebeblock aus der Form und das mache ich einfach, indem ich gegen die Rückseite drücke. Also drücke ich sanft auf den Rücken und schiebe ihn einfach in meine Hand, aber auch hier möchte ich nicht, dass er auftaut. Also habe ich es sofort wieder eingefügt.

Jetzt können Sie also den, den Gewebeblock mit dem, der blauen Markierung, die ich darauf gemacht habe, sehen. Ich weiß also, dass das die Spitze des Kopfes des Embryos ist. Und ich möchte das Gesicht durchschneiden, weil es sich um koronale Schnitte handelt.

Was ich jetzt also tun werde, ist, dass ich ein weiteres Tröpfchen OCTA großes Tröpfchen hinzufüge, und ich muss jetzt schnell handeln, weil alles kalt ist. Und ich nehme mein Taschentuch und lege es genau in die Mitte, achte darauf, dass es flach auf dem bereits gemachten OCT-Bett anliegt. Jetzt lasse ich das einfach einfrieren und das dauert etwa ein oder zwei Minuten.

Jetzt ist es also fertig gefroren. Und ich werde das Gewebe nehmen, das auf dem Futter befestigt ist, es in den Kopf stecken, es so gerade wie möglich machen und dann festziehen. Das kann es, es ist schön fest.

Ich werde es direkt vor der Klinge platzieren und dann vorschieben, was einige Sekunden dauern kann. Okay, jetzt werde ich die flache Kante der Klinge verwenden, um das Gewebe wirklich fein zu positionieren. Also schaue ich mir einfach die Kante an und schwinge das Gewebe auf und ab, um sicherzustellen, dass die Ränder ausgerichtet sind.

Wenn sie es nicht täten, könnte es in etwa so aussehen. Ich übertreibe es natürlich, aber Sie können hier sehen, dass es nicht gerade gegen die Klinge geht. Also mache ich einfach immer wieder Anpassungen, bis ich das Gefühl habe, dass es so gerade ist, wie ich es bekommen kann.

Ich denke, das ist ziemlich gut. Ich schaue also aus jedem Winkel, um sicherzustellen, dass das Gewebe gerade gegen die Klinge schneidet, und ich benutze die Schneide der Klinge, um das anzuzeigen. Ich schaue also nach oben und von der Seite und das Gewebe sieht eigentlich ziemlich gut aus.

Ich muss nicht viele Anpassungen vornehmen, aber wenn ich es täte, würde ich einfach die Knöpfe verwenden, die sich am Hinterkopf befinden. Und wenn Sie diese nach links oder rechts drehen, können Sie sehen, dass Sie auf diese Weise Feineinstellungen vornehmen können. Aber es sieht ziemlich gut aus.

Jetzt bringe ich, ich bringe das Gewebe voran. Es ist, es schneidet noch nicht, weil es nicht gegen die Klinge ist. Das Gewebe ist tief in das OCT hinein eingebettet.

Es kann also mehrere Minuten dauern, bis man an das Gewebe gelangt. Sie sollten nicht zu schnell fahren, weil es das OCT und Ihr Gewebe auffangen und knacken könnte, aber Sie sollten auch nicht zu langsam fahren, weil es ewig dauern könnte. Es gibt eine nette Funktion an dieser Maschine, mit der Sie an einem dickeren Abschnitt trimmen können, wodurch Sie schneller fahren können.

Jetzt bin ich also tatsächlich, ich schneide jetzt durch das, das OCT, also werde ich ein bisschen langsamer. Ich bin also noch nicht zum Gewebe gekommen, aber jetzt ist der Zeitpunkt, an dem ich einschätzen kann, wie der Schnitt ablaufen wird. Viele Variablen können, können dazu führen, dass Ihre, Ihre Gewebeschnitte, sehr gut oder sehr schlecht verlaufen.

Was ich bei diesem Kryostaten am häufigsten finde, ist, dass das Gewebe eigentlich ein bisschen zu kalt ist. Ich habe, ich habe die Temperatur gesenkt, aber es scheint immer noch ein bisschen zu kalt zu sein. Und was passiert, ist, dass die Klinge durch das, durch das Gewebe oder durch das OCT klappert.

Sie erhalten also diese kleinen Linien, diese horizontalen Linien durch das, durch das ÜLG. Was ich mache, ist, dass ich meinen Daumen nehme und einfach den Rand erwärme, den OCT einfach aufwärme, indem ich ihn sanft berühre und mit dem Daumen schiebe, nicht sehr lange. Und als ich es dann durchtrennte, bemerkte ich, dass sie viel besser herauskommen und das Geplapper aufgehört hat.

Das sind also die Art von Dingen, die ich beurteilen werde, bevor ich zum Gewebe komme. Ich habe also bemerkt, dass, wenn die Klinge durch das Gewebe geht, es einen Haken oder Riss im OCT gibt. Eines der Dinge, die ich zuerst mache, ist das Wechseln der Klinge.

Ich bin mir nicht sicher, wie lange diese Klinge schon hier ist und wer sie vor mir benutzt hat, also werde ich einfach weitermachen und eine neue Klinge herausholen. Diese sind natürlich sehr scharf, also muss man vorsichtig sein. Also werde ich die Anti-Roll-Platte einstellen und hier an der Unterseite befindet sich eine federbelastete Schraube, unter die man nur greifen muss und die man hinein- oder herausschieben kann.

Also bin ich so weit fortgeschritten und geschnitten, dass ich jetzt im Gewebe bin. Und leider gibt es einen Riss durch den OCT-Block, der oft vorkommt und den man leider nicht wirklich kontrollieren kann, aber es gibt Dinge, die man tun kann, um ihn zu beheben. Wenn der Riss durch das Gewebe gegangen ist, müssen Sie die Probe verwerfen oder versuchen, das zu retten, was Sie können.

In diesem Fall scheint sich der Riss über dem Gewebe zu befinden. Was ich also tun werde, ist, eine Rasierklinge zu nehmen, die sich im Kryostaten befunden hat. Es ist, es ist gekühlt.

Und ich werde versuchen, den rissigen Teil, der sich am oberen Rand des OCT-Blocks befindet, abzuschneiden. Also werde ich wieder mit meinem Daumen die Oberfläche des OCT-Blocks erhitzen. Und dann werde ich es durchschneiden, und wenn Sie es hier sehen können, ist es gerissen.

Da habe ich also das Stück mit dem Taschentuch abgenommen und dann den Rest des Okt OCT, den ich gerade weggeschleudert habe, es war der gerissene Teil. Was ich also tun werde, ist, dass ich versuchen werde, diesen rissigen Teil mit einer gekühlten Rasierklinge abzuschneiden. Ich muss sehr gerade hineingehen und ich muss beide Hände benutzen und gleichmäßigen Druck auf die Klinge ausüben.

Und ich werde die Klinge in das OCT hin und her schaukeln. Also schaukele ich hin und her, schneide langsam in das OCT hinein. Hoffentlich entferne ich den gerissenen Teil.

Okay, ich werde mich durch das Entfernen dieses überschüssigen OCT reduzieren. Okay, sieht gut aus. Ich werde dann den Kopf leicht zurückziehen, weil ich Kanten geschaffen habe, die sich an der Klinge verfangen können, und wenn das passiert, könnte es tatsächlich das OCT und das Gewebe abbrechen und meine Probe ruinieren.

Also habe ich mich zurückgezogen, also muss ich noch ein bisschen vorrücken, um wieder in das Gewebe zu kommen, und hoffentlich habe ich den Riss korrigiert. Okay, jetzt steige ich wieder in das Gewebe ein. Okay, es sieht so aus, als hätte ich es korrigiert.

Es gibt also keine Risse mehr im OCT, die das Erfassen der Schnitte viel einfacher machen. Jetzt gehe ich zu dem Teil des Gewebes über, der mich interessiert. Im Moment bin ich, ich berühre gerade die Oberfläche und ich möchte in das Gehirn dieses Embryos eindringen.

Diese sind groß genug, dass ich die Strukturen, die mich interessieren, tatsächlich sehen kann. Ich habe nicht erwähnt, dass ich diese Bürsten verwende, um die Klinge zwischen den einzelnen Abschnitten, die ich aufnehmen werde, zu reinigen. Dieser große ist nur zum Reinigen des Bereichs und zum Entfernen des überschüssigen OOC-OCT gedacht.

Ich verwende diese feineren Pinsel auch, um den Schnitt gegen diese kalte Platte hier zu manipulieren, um ihn zu positionieren, wenn ich ihn auf dem Schnitt aufnehme. Auch diese werden kalt gehalten, damit das OCT nicht schmilzt und an den Bürsten kleben bleibt. Um das Gewebe zu erfassen, erwärme ich zuerst das OCT und das Gewebe mit meinem Daumen.

Und ich werde eine dieser Folien nehmen, die ich bereits beschriftet habe. Ich halte es auf den Kopf und jeder macht das anders. Aber so wie ich es mache, halte ich diese obere rechte Ecke gerne fest, wenn die Rutsche mit der rechten Hand nach unten zeigt.

Und dann verwende ich meinen linken Daumen als Drehpunkt, damit ich direkt gegen die Platte gehen und den Abschnitt erfassen kann. Das OCT und das Gewebe schmelzen tatsächlich gegen den Objektträger und montieren sich selbst. Also zuerst erwärme ich das Taschentuch mit dem Daumen, schneide es langsam durch, greife meine Folie, halte mit der rechten Hand die rechte Ecke, bewege die Platte, senke sie gerade nach unten, lasse sie schmelzen.

Ich schaue mir das Taschentuch an, um sicherzustellen, dass es keine Falten oder Blasen gibt und es gut aussieht. Und ich werde so lange weitermachen, bis ich das gesamte Gehirn durchtrennt habe. Ich schaue mir jetzt die Schnitte durch das Präparierfernrohr an, um sicherzustellen, dass sie, dass sie gut aussehen und das tun, Sie können das Vorderhirn am oberen Rand des Abschnitts sehen und sie sehen alle sehr schön aus.

Sie können diese Kryoschnitte für Dinge wie die In-situ-Hybridisierung verwenden. Wir führen manchmal grundlegende Histologie-, H- und E-Färbungen durch. Sie können auch Immunfluoreszenz durchführen und Sie wissen schon, eine Reihe solcher Assays.

Für mich wurden diese Abschnitte fixiert und für die in situ Hybridisierung aufbereitet. Das ist es, was ich als nächstes tun werde.