Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Hallo, ich bin Spencer Curley vom Ed Maki's Labor an der University of California Irvine, und ich werde Ihnen zeigen, wie man Kryoschnitte anfertigt. Dazu verwende ich zunächst diese üblicherweise verwendeten Reagenzien. Die Einbettungsverbindung bzw. das Einbettmedium, das ich verwende, heißt OCT (für optimale Schneidetemperatur).

Es handelt sich um eine klare Lösung, die sehr dick und viskos ist und das Gewebe gut hält, während man es ausrichten kann; anschließend gefriert es. Letztendlich ist sie wasserlöslich, sodass man sie während jeglicher Färbeprozedur entfernen kann. Ich bette daher das Gewebe in eine Form ein. Diese Kryo-Form-Biopsiebehälter sind in verschiedenen Größen erhältlich.

Ich werde hier diese kleinere Form verwenden, da ich embryonales Gewebe von der Maus bearbeite. Unser Gewebe gefrieren wir schockartig in flüssigem Stickstoff. Zuerst fülle ich daher diesen schützenden Vakuumbehälter mit flüssigem Stickstoff aus unserem Tank hier.

Bevor Sie das Gewebe schockgefrieren, müssen Sie es sogenannt kryoprotegieren, da das Gefrieren andernfalls das Gewebe zerstören würde. Dazu geben Sie das Gewebe über Nacht in eine 30%ige Saccharoslösung. Und wenn es länger dauert, ist das ebenfalls in Ordnung, solange das Gewebe absinkt.

Und wie Sie sehen können, sind die Embryonal-Köpfe von Mäusen vom Tag 12,5 in der Saccharose-Lösung gesunken, sie sind also bereit zum Einfrieren. Nun werde ich das Gewebe, das sich in der Saccharose-Lösung befindet, einfach in eine größere Schale gießen, damit ich das Gewebe leichter bearbeiten kann. Ich werde etwas von diesem OCT entnehmen und es in diese 35-Millimeter-Schale gießen, die tatsächlich auf ihrem Deckel liegt, sodass ich sie in einem Winkel bearbeiten kann.

Das OCT sammelt sich also am Rand für die Tiefe. Ich verwende dazu ein Paar ältere, stumpfe Pinzetten, da sie nicht scharf sein müssen und man kein weiteres Paar Pinzetten beschädigen möchte. Ich nehme sie und hebe vorsichtig einen dieser Köpfe heraus, den ich dann in das erste OCT-Bad lege.

Ich möchte das Embryo lediglich mit OCT überziehen. Dies ermöglicht eine bessere und gleichmäßigere Gefrierung des Gewebes. Es sollten keine Reste von Saccharose um das Gewebe herum oder Luftblasen vorhanden sein.

Vermeiden Sie auf jeden Fall Luftblasen. Daher rühre ich vorsichtig das OCT um und unter dem Kopf herum, bewege den Kopf durch das OCT und lasse es einige Sekunden lang ruhen, während ich meine Kryoschimmel fülle. Jetzt werde ich den Kryoschimmel erneut mit OCT füllen und dabei erneut Luftblasen vermeiden.

Und ich werde es einfach bis zum oberen Rand der Form auffüllen. Wie Sie bemerken werden, habe ich die Form beschriftet, sodass ich nach dem Einfrieren die Orientierung erkennen kann.

Wenn das OCT gefriert, wird es weiß, und Sie können Ihr Gewebe nicht mehr sehen. Daher sollten Sie unbedingt mit einem Permanentstift beschriften. Die, die Kryoschale.

Ich habe tatsächlich eine Blase im OCT, daher werde ich sie mit der Pinzette einfach über den Rand hinausschieben. Das darf nicht stören, wenn Ihr Gewebe gefriert. Nun werde ich den Kopf von dieser Schale in das OCT in meiner Form überführen.

Ich werde es einfach aus der Schale heben und es sehr vorsichtig in die Form legen. Dann gehe ich zum Mikroskop, wo ich das Gewebe ausrichten werde. Ich habe das Gewebe hier in meiner Kryoschale, und ich werde durch das Mikroskop schauen, um es auszurichten.

Ich werde koronale Schnitte durch diesen Mäusekopf anfertigen. Daher muss ich ihn entsprechend ausrichten, um ihn im Kryostat für koronale Schnitte zu positionieren. Wieder verwende ich diese alten stumpfen Pinzetten, und wie Sie sehen, befinden sich hier einige Blasen, die ich nach Möglichkeit entfernen werde.

Aber diese kleineren Blasen sind nicht, sind nicht schlecht. Ich habe bei diesen kleineren Blasen nichts bemerkt. Sie möchten nur keine großen Blasen.

Ich schiebe sie also so gut wie möglich beiseite und wische die Pinzette auf jeden Fall häufig ab, da man so Blasen besser vermeiden kann. Und jetzt, wenn Sie meine Beschriftung sehen können, habe ich hier oben ein „T“ für die Oberseite und hier links ein „F“. Das zeigt mir an, dass der Kopf, also die Kopfoberseite, nach oben zeigt und die Vorderseite beziehungsweise das Gesicht nach links zeigt.

Auf diese Weise weiß ich, welche Oberfläche ich für koronale Schnitte schneiden muss, und schiebe das Gewebe einfach leicht an. Manchmal entstehen dabei jedoch Blasen, die man herausdrücken sollte, damit sie nicht zusammen mit dem Gewebe einfrieren. Blasen sind vor allem deshalb problematisch, weil sie beim Einfrieren zu einer ungleichmäßigen Gefrierung des Gewebes führen können.

Der Zweck des Schnellschließens ist es, alles auf einmal gefroren zu haben. Außerdem kann es, wenn man durch das Gewebe und den Kryostaten schneidet, zu einem Haken oder Riss kommen, wenn die Klinge durch eine Blase anstelle des OCT oder des Gewebes fährt, was dazu führen kann, dass das Gewebe zerstört oder beschädigt wird. Daher sollten solche Blasen unbedingt um jeden Preis vermieden werden.

Insbesondere die größeren. Ich orientiere es hier also noch. Dieses Gewebe wurde 24 Stunden lang fixiert, sodass es ziemlich stabil gegenüber meinen Manipulationen ist.

Ein anderes Gewebe könnte etwas weicher sein, daher sollte man besonders vorsichtig sein. Sobald ich es unter dem Mikroskop so positioniert habe, dass das Gesicht nach links und die Kopfoberseite nach oben zeigt, muss ich sicherstellen, dass die Ausrichtung auch in den anderen Ebenen korrekt ist. Dazu werde ich anheben und alle Seitenflächen des Würfels durchleuchten, um mich zu vergewissern, dass alles richtig liegt.

Und ich sehe, dass es leicht nach unten geneigt ist, daher muss ich es einfach mit der Pinzette anheben. Okay? Dies erfordert auf jeden Fall viel Übung. Okay, es sieht gut aus.

Jetzt werde ich hierher gehen und es in flüssigem Stickstoff einfrieren. Gut, jetzt, da das Gewebe korrekt in der Kryoschale ausgerichtet ist, werde ich den flüssigen Stickstoff in diese Schale hier gießen. Dies ist einfach eine normale Kunststoff-Petri-Schale für die Zellkultur, bis zum Rand gefüllt.

Es verdunstet ziemlich schnell. Ich nehme meine Pinzette und senke die Kryoschablone ab. Wie Sie sehen, habe ich tatsächlich die Unterlippe gebogen.

Das ermöglicht auf jeden Fall eine bessere Handhabung. Ich werde es einfrieren. Und während das Gewebe und das OCT gefrieren, verfärben sie sich milchig weiß.

Und sobald es abgeschlossen ist, wird alles weiß sein. Dann muss ich das gefrorene Gewebe schnell in den Minus-80-Grad-Gefrierschrank zur Lagerung bringen. Sie sollten es so halten, dass das Gewebe nicht untertaucht.

Sie müssen also sehr vorsichtig sein und es nur an der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs halten. Gut, jetzt ist es eingefroren. Halten Sie es noch einige Sekunden länger dort, bevor ich es in den Minus-80-°C-Gefrierschrank bringe.

Okay, jetzt bringe ich es in den Minus-80-Apparat. Ich habe mein Gewebe aus dem Minus-80-Apparat genommen und es hier in diesen Kryostaten eingebracht. Die Kammer hat tatsächlich eine Temperatur von minus 24 Grad Celsius.

Im Moment müssen Sie das Gewebe etwa eine halbe Stunde bis eine Stunde lang äquilibrieren, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen können. Andernfalls ist es zu spröde. Obwohl alle Kryostate unterschiedlich sind, werde ich hier einfach einige grundlegende Aspekte an dieser Maschine erläutern.

Daher verwenden wir das Leica CM 30 50 s. Es ist eine gute Maschine, da sie eine separate Kühleinheit für die Probe selbst besitzt, was ein nützlicher zusätzlicher Vorteil ist. Man kann die Probentemperatur einstellen, und verschiedene Gewebe erfordern unterschiedliche Temperaturen zum Schneiden.

Wenn Sie Ihr Gewebe zum ersten Mal beladen, müssen Sie mehrere Einstellungen vornehmen. Diese sind bei allen Kryostaten ähnlich. Dabei handelt es sich um elektronische Einstellungen, von denen einige manuell bedient werden.

Zum Beispiel müssen Sie den Arm des Kryostaten einziehen oder vorrücken, um ihn näher oder weiter von der Klinge zu positionieren. Sie können dies schnell oder langsam tun. Die Schnittdicke können Sie mit diesem Plus- oder Minuszeichen hier einstellen.

Und Sie wählen zwischen Schnitt- oder Schnittstärke, was auf der mittleren Taste hier angezeigt wird. Als Nächstes stellen Sie die Temperatur der Kammer oder der Probe selbst an dieser digitalen Anzeige ein, indem Sie diese Taste drücken und die Pfeiltasten nach oben oder unten verwenden, um die Temperatur anzupassen. Bei uns wird für das Kryoschnitten diese Fisherbrand-Superfrost-Plus-Mikroskopobjektträger verwendet.

Sie sind mit einem Klebstoff beschichtet, damit das Gewebe während der Verarbeitung nicht abfällt. Manchmal werden Sie beim Schneiden bemerken, dass das Gewebe etwas weich erscheint, und Anzeichen dafür sind, wenn es auf die Klinge trifft und sich zusammenballt. Zum Beheben können Sie dieses „Fisher“-Markenprodukt, Super Friendly Freeze, verwenden.

Es tiefgefriert das Gewebe blitzschnell ein, und man richtet es einfach auf das Gewebe, drückt den Auslöser und friert das Gewebe schnell erneut ein, falls es zu weich ist. Bevor ich das Gewebe auf einen Blockhalter zum Schneiden aufbringe, möchte ich Ihnen kurz einige Komponenten der Maschine hier zeigen. Hier wird nämlich die Klinge eingelegt, die mit dieser Metallplatte befestigt wird.

Indem Sie diesen Arm anheben, können Sie die Klinge nach Bedarf entfernen und ersetzen. Stellen Sie sicher, dass sie gut und sicher befestigt ist. Sie sollten die Klinge jedoch nicht übermäßig festziehen, da sie sonst verformt werden kann.

Sie werden bemerken, dass die Gewebestärke bei Ihrem Schnitt nicht einheitlich ist. Daher sollten Sie den Arm nicht vollständig nach unten drücken. Bringen Sie ihn lediglich so weit nach unten, dass er etwa auf gleicher Höhe mit der Klinge selbst ist.

Dies ist eine weitere Sache, die Sie während des Schneidens möglicherweise anpassen müssen. Sie wird Anti-Roll-Platte genannt. Es handelt sich um eine Glasplatte, die in diesen Halter hier eingefügt wird, und Sie können sie mithilfe dieser federbelasteten Schraube hier justieren.

Sie bewegen es im Wesentlichen vorwärts oder rückwärts. Dadurch bleibt Ihr Gewebe oder Ihre Schnitte flach, sodass Sie sie auf einen Objektträger aufbringen können. Eine weitere Einstellung, die Sie während des Schneidens vornehmen können, betrifft die Stelle an der Klinge, die den eigentlichen Schnitt ausführt.

Wie stellen Sie das nun ein? Sie heben einfach diesen Hebel an und können die gesamte Vorrichtung nach links oder rechts verschieben. Dies verwenden Sie eigentlich nur, wenn Sie bemerken, dass Ihr Gewebe an einem bestimmten Teil der Klinge hängen bleibt, oder wenn Sie Klingen sparen möchten, da diese ziemlich teuer sind. So können Sie einfach durch Hin- und Herbewegen eine saubere Stelle finden.

Eine weitere Einstellungsmöglichkeit ist der Schnittwinkel. An der Seite hier befinden sich drei verschiedene Positionen, die Sie jedoch nicht sehen können. Wir verwenden lediglich die mittlere Position und stellen diese ein, indem wir diesen anderen Hebel anheben.

Und, und damit kann man diese Vorrichtung nach oben und unten bewegen. Wir halten sie immer in der Mitte. Daher lasse ich sie jetzt einfach dort.

Hier hinten befindet sich der Kopf des Kryostaten. Er hält die gefrorene Gewebeprobe während des Schneidens. Er kann auf- und abgeschwenkt werden und zur Klinge hin vorgerückt werden.

Grundsätzlich befestigen Sie das Gewebe auf diesem Block und setzen den Block in den Kopf ein, ziehen ihn fest und verwenden dann die Knöpfe an der Rückseite, um den Winkel einzustellen, um einen geraderen Schnitt zu erzielen. Nun werde ich das Gewebe auf den Block aufbringen. Sie sollten die Blöcke bei Raumtemperatur halten, da Sie zunächst eine Schicht OCT hinzufügen, die nicht sofort gefrieren sollte, da sie eine gleichmäßige, flache Schicht bilden soll.

Und wir verwenden diese Vorrichtung hier, um – sie wird als Wärmeentzieher bezeichnet. Eigentlich wird sie dazu verwendet, das OCT beim Gefrieren zu glätten. Zunächst nehme ich die Probe bei Raumtemperatur und lege sie in diesen Halter hier.

Nehmen Sie etwas von meinen OCT-Blasen. Spielt hier keine Rolle, da sie herausgedrückt werden. Geben Sie einfach ein wenig hinzu, nicht viel ist nötig.

Nehmen Sie den Wärmeextraktor und stellen Sie ihn einfach dort unten ab. Warten Sie einige Sekunden. Dann sehen Sie, dass das OCT schön flach ist.

Jetzt habe ich mein Gewebe und muss die eigentliche OCT-Position markieren. Gut, ich markiere einen Punkt am OCT, um dessen Lage anzugeben. Dort, ich habe gerade die Oberseite mit einem blauen Punkt markiert.

Jetzt nehme ich den Gewebeprobeblock aus der Form heraus, indem ich einfach gegen die Rückseite drücke. Ich werde also vorsichtig gegen die Rückseite drücken und ihn in meine Hand schieben, aber erneut möchte ich vermeiden, dass er auftaut. Daher lege ich ihn sofort wieder zurück.

Jetzt können Sie den Gewebeklotz mit der blauen Markierung sehen, die ich darauf angebracht habe. So weiß ich, dass dies die Kopfoberseite des Embryos ist. Und ich möchte durch das Gesicht schneiden, da es sich hierbei um frontale Schnitte handelt.

Jetzt werde ich einen weiteren Tropfen OCT hinzufügen, einen größeren Tropfen, und ich muss mich beeilen, da alles kalt ist. Dann nehme ich mein Gewebe und platziere es genau in der Mitte, wobei ich sicherstelle, dass es flach auf der bereits vorbereiteten OCT-Schicht aufliegt. Nun lasse ich das Ganze gefrieren, was etwa eine bis zwei Minuten dauern wird.

Jetzt ist das Einfrieren abgeschlossen. Ich werde das Gewebe, das auf dem Blockhalter befestigt ist, in den Kopf einsetzen, so gerade wie möglich ausrichten und dann festziehen. Es sitzt fest und sicher.

Ich werde es direkt vor der Klinge platzieren und dann vorrücken, was mehrere Sekunden dauern kann. Okay, jetzt werde ich die flache Kante der Klinge verwenden, um die Gewebepositionierung fein zu justieren. Ich schaue einfach auf die Kante und bewege das Gewebe leicht auf und ab, um sicherzustellen, dass die Ränder exakt ausgerichtet sind.

Wenn sie es nicht täten, könnte es etwa so aussehen. Ich übertreibe offensichtlich, aber Sie können hier erkennen, dass es nicht gerade an der Klinge anliegt. Daher nehme ich einfach solange Anpassungen vor, bis ich das Gefühl habe, dass es so gerade wie möglich ist.

Ich denke, das ist ziemlich gut. Ich schaue also aus jedem Winkel, um sicherzustellen, dass das Gewebe gerade gegen die Klinge schneiden wird, und ich benutze die Kanten der Klinge, um dies zu überprüfen. Ich schaue von oben und von der Seite, und das Gewebe sieht tatsächlich ziemlich gut aus.

Ich muss nur wenige Einstellungen vornehmen, aber falls nötig, würde ich einfach die Regler an der Rückseite des Kopfes verwenden. Durch Drehen nach links oder rechts können Sie feine Justierungen auf diese Weise vornehmen. Aber es sieht ziemlich gut aus.

Jetzt bewege ich das Gewebe tatsächlich vorwärts. Es schneidet noch nicht, weil es noch nicht an der Klinge anliegt. Das Gewebe ist tief in das OCT eingebettet.

Daher kann es mehrere Minuten dauern, bis zum Gewebe vorzudringen. Sie sollten nicht zu schnell vorgehen, da dies dazu führen könnte, dass das OCT und Ihr Gewebe einreißen oder springen; andererseits sollten Sie auch nicht zu langsam arbeiten, da es sonst endlos lange dauern könnte. An dieser Maschine gibt es eine praktische Funktion, mit der Sie einen Schnitt mit dickerem Schnittmaß durchführen können, wodurch Sie schneller vorgehen können.

Jetzt schneide ich tatsächlich durch das OCT-Material, weshalb ich etwas langsamer werde. Ich bin noch nicht beim Gewebe angelangt, aber genau hier bewerte ich, wie der Schnittverlauf weitergehen wird. Viele Variablen können dazu führen, dass das Gewebeschnitten sehr gut oder sehr schlecht verläuft.

Was meiner Erfahrung nach am häufigsten bei diesem Kryostaten auftritt, ist, dass das Gewebe tatsächlich etwas zu kalt ist. Ich habe die Temperatur bereits gesenkt, aber dennoch scheint es noch immer etwas zu kalt zu sein. Das Ergebnis ist, dass die Klinge beim Durchschneiden des Gewebes oder des OCTs zu vibrieren beginnt.

Sie erhalten also diese kleinen Linien, diese horizontalen Linien durch das OCT hindurch. Was ich mache, ist, mit dem Daumen die Kante leicht aufzuwärmen, das OCT vorsichtig durch Berührung und Verschieben des Daumens zu erwärmen, jedoch nicht allzu lange. Wenn ich dann daraufhin schneide, stellen ich fest, dass die Schnitte viel besser ausfallen und das Zittern aufgehört hat.

Das sind also die Dinge, die ich überprüfe, bevor ich zum Gewebe komme. Ich habe bemerkt, dass beim Durchtrennen des Gewebes die Klinge an einer Stelle hängen bleibt oder tatsächlich ein Riss im OCT auftritt. Daher wechsle ich als Erstes die Klinge.

Ich bin mir nicht sicher, wie lange dieses Messer hier bereits ist und wer es vor mir benutzt hat, daher werde ich einfach ein neues Messer einsetzen. Diese Messer sind offensichtlich sehr scharf, daher muss man vorsichtig sein. Ich werde nun die Anti-Rutsch-Platte justieren. Dazu befindet sich hier unten eine Schraube mit Federvorspannung, unter die man greifen muss, um sie nach innen oder außen zu bewegen.

Ich habe also bereits so weit fortgeschritten und eingebettet, dass ich nun im Gewebe bin. Leider gibt es einen Riss im OCT-Block, was häufig vorkommt und leider nicht wirklich vermeidbar ist, aber es gibt Maßnahmen, um ihn zu beheben. Wenn der Riss durch das Gewebe verlaufen wäre, müsste die Probe verworfen werden oder man könnte versuchen, soweit wie möglich zu retten.

In diesem Fall scheint sich der Riss oberhalb des Gewebes zu befinden. Daher werde ich ein Rasiermesser nehmen, das sich bereits im Kryostaten befunden hat. Es ist gekühlt.

Und ich werde versuchen, lediglich den Riss entfernen, der sich an der Oberseite des OCT-Blocks befindet. Also werde ich erneut meinen Daumen verwenden, um die Schnittfläche des OCT-Blocks leicht aufzuwärmen. Anschließend werde ich einreihen, und wie Sie hier erkennen können, ist der Block rissig.

Ich habe also das Stück mit dem Gewebe abgenommen und den restlichen OCT, den ich einfach weggeschleudert habe, da es der gebrochene Teil war. Als Nächstes werde ich versuchen, den gebrochenen Teil mit einem gekühlten Rasiermesser abzuschneiden. Ich muss dabei sehr gerade schneiden, beide Hände benutzen und gleichmäßigen Druck auf die Klinge ausüben.

Und ich bewege die Klinge hin und her in das OCT hinein. Ich schneide also langsam durch das OCT. Hoffentlich entferne ich den rissigen Teil.

Okay, ich werde durch Abschneiden dieses überschüssigen OCT-Materials vorgehen. Okay, sieht gut aus. Anschließend werde ich den Kopf leicht zurückziehen, da ich Kanten erzeugt habe, die am Messer hängen bleiben könnten. Wenn dies passiert, könnte das OCT und das Gewebe abbrechen und somit meine Probe beschädigen.

Ich habe also zurückgezogen, daher muss ich etwas weiter vordringen, um wieder ins Gewebe einzudringen, und hoffentlich habe ich den Riss korrigiert. Okay, jetzt dringe ich wieder ins Gewebe ein. Okay, es sieht so aus, als hätte ich ihn tatsächlich korrigiert.

Es gibt also keine Risse mehr im OCT, was das Erfassen der Schnitte erheblich erleichtert. Nun werde ich zu dem Teil des Gewebes vordringen, der mich interessiert. Im Moment erreiche ich gerade die Oberfläche und möchte nun in das Gehirn dieses Embryos vordringen.

Das sind groß genug, dass ich tatsächlich die Strukturen sehen kann, die mich interessieren. Ich habe vergessen zu erwähnen, dass ich diese Pinsel verwende, um die Klinge zwischen jeder zu sammelnden Schnittprobe zu reinigen. Dieser große dient lediglich dazu, die Fläche zu säubern und überschüssiges OCT-Material zu entfernen.

Ich verwende diese feineren Pinsel auch, um den Schnitt gegen diese gekühlte Platte zu führen und ihn zu positionieren, während ich ihn auf dem Objektträger fixiere. Auch diese werden kalt gehalten, damit das OCT nicht schmilzt und an den Pinseln haften bleibt. Um das Gewebe zu fixieren, erwärme ich zunächst das OCT und das Gewebe mit meinem Daumen.

Und ich nehme eine dieser Objektträger, die ich bereits beschriftet habe. Ich halte ihn verkehrt herum, und jeder macht das unterschiedlich. Aber ich halte gerne die obere rechte Ecke, wenn der Objektträger mit der Unterseite nach oben zeigt, mit meiner rechten Hand.

Und dann verwende ich meinen linken Daumen als Drehpunkt, um senkrecht auf die Probe zuzugehen und den Schnitt zu fixieren. Das OCT und das Gewebe schmelzen tatsächlich an der Objektträgerfläche und befestigen sich von selbst. Zuerst erwärme ich das Gewebe langsam mit dem Daumen, schneide hindurch, nehme den Objektträger, halte die rechte Ecke mit der rechten Hand, bewege die Platte, senke sie gerade ab und lasse sie schmelzen.

Ich betrachte das Gewebe, um sicherzustellen, dass keine Falten oder Blasen vorhanden sind und es gut aussieht. Ich werde dies fortsetzen, bis ich das gesamte Gehirn eingebettet habe. Jetzt betrachte ich die Schnitte unter dem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass sie gut aussehen – und das tun sie; Sie können das Vorderhirn am oberen Rand des Schnitts erkennen, und alle sehen sehr gut aus.

Sie können diese Kryoschnitte für Anwendungen wie die in situ-Hybridisierung verwenden. Manchmal führen wir auch grundlegende histologische Färbungen, wie H-und-E-Färbungen, durch. Außerdem ist die Durchführung von Immunfluoreszenz und einer Reihe ähnlicher Assays möglich.

Insbesondere für mich wurden diese Abschnitte fixiert und für die In-situ-Hybridisierung aufbereitet. Das werde ich als Nächstes tun.