Name: Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie die Vorbereitung von Drosophila S2-Zellen für die Lichtmikroskopie. Diese Methode umfasst die Beschichtung mit Lectin zur Zelladhäsion, Fixierung und Immunfärbung für die Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde teilweise von der National Cancer Institute P30 CA23074, die American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, und der Univ unterstützt. of Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Für die Zellbiologie Feld wäre ein ideales System kostengünstig in der Wartung, leicht zu manipulieren, und zugänglich für eine Vielzahl von Techniken. Drosophila S2-Zellen erfüllen diese Anforderungen, und so haben sie schnell das System der Wahl für eine wachsende Zahl von Zellen Biologie-Labors. Wir haben einen kurzen Überblick über die Methoden, die S2-Zellen für die Mikroskopie vorbereitet präsentiert. Eine bemerkenswerte Tugend der S2-Zellen ist die Tatsache, dass sie gut wach...

<table><tbody><tr><td>S2-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-Zellen</td><td>DGRC</td><td>Bestellnummer 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>serumfreies Medium</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>serumfreies Medium</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>serumfreies Medium</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>10 % (endgültig) hitzeinaktiviertes FBS hinzufügen, um komplettes Medium herzustellen.</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>100× Antibiotikum-Lösung</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>enthält Penicillin (10000 U/mL),&lt;br/&gt;Streptomycin (10000 &amp;#x03BC;g/mL) und&lt;br/&gt;Amphotericin B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32%ige Lösung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>wasserfrei, ACS-Reinheit</td></tr><tr><td>Molekularsiebe</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>Typ 3A</td></tr></tbody></table>

vorbereitung der drosophila s2-zellen für lichtmikroskopie

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Die ideale experimentelles System wäre billig und leicht zu pflegen, zugänglich für eine Vielzahl von Techniken und würde durch eine umfangreiche Literatur-und Genom-Sequenz-Datenbank unterstützt werden. Cultured Drosophila S2-Zellen, das Produkt der distanzierte 20-24 Stunden alte Embryonen 1, besitzen alle diese Eigenschaften. Folglich sind S2-Zellen extrem für die Analyse von zellulären Prozessen, einschließlich der Entdeckung der Gene, die molekularen Komponenten des Prozesses oder der Mechanismus von Interesse gut geeignet. Die Features von S2-Zellen, die die größte Verantwortung für deren Nutzen sind, sind die Leichtigkeit, mit der sie gehalten werden, ihren exquisiten Sensibilität für doppelsträngige (ds) RNA-Interferenz (RNAi), und ihre Handhabbarkeit zu Fluoreszenzmikroskopie als entweder live oder feste Zellen. S2-Zellen können in einer Vielzahl von Medien gezüchtet werden, darunter eine Reihe von preiswerten, handelsüblichen, vollständig definierte, Serum-freien Medien 2. Darüber hinaus wachsen sie optimal und schnell auf 21-24 ° C und kann in einer Vielzahl von Containern kultiviert werden. Im Gegensatz zu Säugerzellen tun S2-Zellen benötigen kein geregelter Atmosphäre, sondern tun auch mit normaler Luft und können sogar in verschlossenen Flaschen aufrechterhalten werden. Ergänzend zu der einfachen RNAi in S2-Zellen ist die Fähigkeit, leicht zu analysieren experimentell induzierten Phänotypen von Phase oder Fluoreszenzmikroskopie von festen oder lebenden Zellen. S2 Zellen wachsen in Kultur als eine einzige Monolage aber nicht angezeigt, wenden Sie Hemmung. Stattdessen neigen Zellen in Kolonien in dichten Kulturen wachsen. Bei geringer Dichte, S2 Kulturen auf Glas-oder Gewebekultur-behandelte Kunststoff gewachsen sind rund und lose befestigt. Allerdings kann die Zytologie von S2-Zellen stark durch die sie dazu veranlassen weitgehend flach durch kurzes kultiviert auf einer Fläche mit dem Lektin Concanavalin A (ConA) 3 beschichtet verbessert werden. S2-Zellen können auch stabil mit Fluoreszenz-markierten Marker zu beschriften Strukturen oder Organellen Interesse an Live-oder fixierten Zellen transfiziert werden. Daher ist das Szenario für die mikroskopische Analyse von Zellen: Erstens, S2-Zellen (die Transgene mit Tags Marker zum Ausdruck besitzen) werden durch RNAi behandelt, um ein Zielprotein (s) zu beseitigen. RNAi-Behandlung Zeit kann eingestellt werden, um Unterschiede in Protein zu ermöglichen turn-over-Kinetik und die Zelle Trauma / Tod zu minimieren, wenn das Zielprotein für die Lebensfähigkeit wichtig. Anschließend werden die behandelten Zellen zu einer Schale mit einem Deckglas vorbeschichtet mit conA, um Zellen zu verbreiten induzieren und fest mit dem Glas haften übertragen. Schließlich werden die Zellen mit dem Forscher die Wahl der Mikroskopie-Modi abgebildet. S2 Zellen sind besonders gut für Studien erfordern erweiterte Visualisierung von lebenden Zellen, da diese Zellen bei Raumtemperatur und normaler Atmosphäre gesund zu bleiben.

Drosophila Schneider (S2) Zellen sind ein zunehmend beliebtes System für die Entdeckung und funktionelle Analyse von Genen. Unser Ziel ist es, einige der mikroskopischen Techniken, die S2-Zellen zu machen, wie eine zunehmend wichtige experimentelle System zu beschreiben.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

Das ideale experimentelle System wäre kostengünstig, leicht zu warten, für eine Vielzahl von Techniken zugänglich und durch eine umfangreiche Literatur gestützt ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung von Drosophila S2-Zellen für die Lichtmikroskopie zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst Kulturschalen mit Glasboden vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den Glasboden mit dem Lektin Conval zu beschichten.A, um die Adhäsion und Flachwerdung der S zwei-Zellen zu fördern. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, Kulturmedium und S zwei-Zellen in die Kulturschale zu geben. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Fixierung und Immunfärbung der S zwei-Zellen in der Kulturschale.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Lokalisation von mit Fluoro vier markierten oder immunmarkierten Proteinen des Interesses durch Fluoreszenzmikroskopie von jeweils lebenden oder fixierten S zwei Zellen zeigen. Hallo, ich bin Joey Club aus dem Labor von Greg Rogers am Department für Zellbiologie und Anatomie an der University of Arizona. Ich bin John Nye, ebenfalls aus dem Rogers-Labor.Und ich bin auch Dan Buster, aus dem Labor von Greg Rogers. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vorbereitung von Drosophila S zwei Zellen für die Lichtmikroskopie.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Regulation der Zentriolenverdopplung in Drosophila zu untersuchen, indem wir Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Zentriolen nach Eliminierung oder Überexpression wichtiger regulatorischer Proteine analysieren. Beginnen wir also. Wir verwenden standardmäßige 35 Millimeter Petrischalen, um unsere Glasbodenschalen herzustellen.Diese Glasbodenschalen halten die Zellen in einem Zustand, der ihren normalen Kultivierungsbedingungen stark ähnelt, und ermöglichen gleichzeitig die Untersuchung lebender Zellen durch mikroskopisches Glas. Zum Zusammenbau der Glasbodenschalen dient eine mit Klebeband abgedeckte Oberfläche einer Styroporbox mit dicken Wänden als Bohrfläche. Legen Sie die untere Hälfte einer 35-Millimeter-Petri-Schale mit der Unterseite der Schale auf die Styroporbox, halten Sie dabei die Seiten der Schale fest und bohren Sie mit einer Handbohrmaschine und einem Zentlochbohrer mit einer Größe von drei Viertel Zoll ein Loch durch die Schale.Nachdem Sie alle Ihre Platten gebohrt haben, verwenden Sie einen kegelförmigen Schleifbohrer mit grober Körnung und einem Durchmesser, der etwa dem des Spreizbohrers entspricht, um den äußeren Rand der Löcher zu glätten. Stellen Sie den Bohrer seitlich ab, sodass der Bohrer über die Kante der Arbeitsplatte hinausragt. Halten Sie den Bohrer an Ort und Stelle, indem Sie etwas Schweres, aber Formbares darauflegen, beispielsweise eine strapazierfähige Plastiktüte, die 10 Kilogramm Sand enthält.Verwenden Sie die Feststelltaste, um den Bohrer kontinuierlich laufen zu lassen. Glätten Sie den Rand Ihrer Schale, indem Sie sie gegen das Schleifwerkzeug führen, um die raue Kante des neuen Lochs zu entfernen. Nachdem die Außenränder der Löcher geglättet wurden, legen Sie die Schalenböden in einen großen Becher und spülen Sie sie mehrmals mit destilliertem Wasser ab.Dadurch werden die kleinen losen Kunststoff- oder Styroporstücke entfernt, die danach schwimmen werden. Legen Sie die Schalenböden zum Trocknen aus. Wenn die Schalen trocken sind, bereiten Sie den Sard 180 4 Kleber vor.Mischen Sie das Harz und das Härtemittel im Gewichtsverhältnis 10 zu 1 und rühren Sie gründlich um. Tragen Sie einen kleinen Klebestreifen rund um das gebohrte Loch auf der Außenseite jeder Schale auf. Legen Sie anschließend ein Deckglas über das Loch, sodass es mit dem Kleber in Kontakt kommt.Das Deckglas muss mindestens etwa einen Millimeter größer sein als das Loch in der Petrischale und kleiner als der Durchmesser der Schale. Das Deckglas sollte glatt und gleichmäßig an der Schale anliegen. Stellen Sie die Schalen nun beiseite.Unterseite, bis trocken. Dies kann einen Tag oder länger bei Raumtemperatur dauern, aber Sie können die Aushärtung beschleunigen, indem Sie die Schalen in einen warmen Inkubator stellen. Sobald die Schalen trocken sind, können sie mit dem Lectin Concanavalin A oder Con A beschichtet werden. Wir verwenden Con A, da sich zwei Zellen, die auf mit Con A beschichteten Deckgläsern angesiedelt sind, stark ausbreiten und ausgezeichnete Präparate für die Mikroskopie ergeben.Um eine Beschichtung auf einem Glasbodenbehälter vorzunehmen, 10 µL Konne-Lösung auf die obere Seite des Glases auftragen. Nach dem Trocknen den Behälter und seinen Deckel mit UV-Licht sterilisieren. In einer Zellkulturhaube die Stücke so drehen, dass ihre inneren Oberflächen direkt der UV-Lampe zugewandt sind, und das sterilisierende UV-Licht mindestens 45 Minuten lang einschalten.S zwei Zellen können in verschiedenen Medien kultiviert werden. Für unsere Zwecke verwenden wir das VITROGEN SF 902 Medium. Um S zwei Zellen, die mit RNAi behandelt wurden, für die Mikroskopie vorzubereiten, resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig und übertragen Sie sie in eine mit Conne beschichtete Glasbodenkulturschale, die zwei Milliliter Medium enthält. Gesunde Zellen, die mit dem mit Conne beschichteten Deckglas in Kontakt kommen, haften fest daran und beginnen, sich auszubreiten.Dieser Prozess sollte innerhalb von etwa 15 Minuten sichtbar sein und nach 45 Minuten bis einer Stunde abgeschlossen sein. Da S zwei Zellen unter normalen Laborbedingungen bezüglich Temperatur und Atmosphäre leicht gehalten werden können, sind keine besonderen Bedingungen oder Geräte erforderlich, wenn sich die Zellen unter dem Mikroskop befinden, um Austrocknung vorzubeugen; halten Sie ausreichend Medium in der Schale auf dem Mikroskop. Die Live-Bildgebung von S zwei Zellen über längere Zeiträume ist möglich.Die Versuchszeit ist lediglich durch die üblichen Probleme der Photobleiche und Phototoxizität begrenzt. Die beiden Zellen können entweder auf einer Glasbodenkulturschale oder einem einfachen Deckglas fixiert werden. In diesem Video demonstrieren wir jedoch die Fixierung und Immunfärbung in einer Glasbodenkulturschale.Methanol und Formaldehyd sind zwei gängige Fixanzien für S-Zellen. Zum Fixieren der Zellen mit Methanol kühlen Sie zunächst etwa 300 Milliliter wasserfreies Methanol in einem abgedeckten Ein-Liter-Glaskolben in einem explosionsgeschützten Gefrierschrank auf minus 20 Grad Celsius. Sobald das Methanol gekühlt ist, nehmen Sie es aus dem Gefrierschrank. Entfernen Sie schnell das Medium aus der Glasboden-Schale und tauchen Sie die Schale dann rasch in das Methanol. Stellen Sie das Becherglas mit der Schale schnell wieder in den Gefrierschrank und fixieren Sie die Zellen 10 bis 15 Minuten lang. Nach 10 bis 15 Minuten nehmen Sie die Schale aus dem Becherglas, gießen das verbleibende Methanol ab und rehydrieren die Zellen. Durch Zugabe von PBST sind die Zellen nun bereit für die üblichen Färbeprozeduren, wie später bei der Zellfixierung gezeigt wird.Mit Formaldehyd verwenden wir 10 % Formaldehyd und Puffer. Diese relativ hohe Konzentration an Formaldehyd ist notwendig, da S-zwei-Zellen keine zytoplasmatischen Intermediärfilamente besitzen, die andernfalls während des Fixierungsprozesses zur Erhaltung der Zellmorphologie und -organisation beitragen würden. Fixieren Sie die Zellen für 10 bis 15 Minuten in 10 % Formaldehyd.Wenn die Fixierung abgeschlossen ist, gießen Sie das Formaldehyd in einen Abfallbecher und waschen Sie die fixierten Zellen mit drei kurzen Spülgängen PBST. Beginnen Sie die Immunfärbung, indem Sie den fixierten Zellen ein Milliliter Blockierungslösung für 15 Minuten hinzufügen. Üblicherweise verwenden wir 5 % normales Ziegenserum in PBST.Die Blockierungslösung abgießen und das primäre Antikörper direkt auf die Zellen geben. Den Petrischalen-Deckel wieder aufschrauben, um eine Verdunstung der Antikörperlösung zu verhindern, und den Antikörper 30 Minuten bei Raumtemperatur mit den Zellen inkubieren lassen. Nach 30 Minuten die Lösung mit dem primären Antikörper entfernen.Verwenden Sie eine Transferpipette, um zwei Milliliter PBST der Schale zuzugeben, und warten Sie fünf Minuten, bevor Sie das PBST ersetzen. Anschließend waschen Sie dreimal mit PBST. Nach dem letzten Waschschritt geben Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper direkt auf die Zellen.Legen Sie den Petrischalen-Deckel wieder auf die Schale und lassen Sie den Antikörper 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit den Zellen inkubieren. Nach Ablauf der 30 Minuten entfernen Sie den sekundären Antikörper und führen drei Waschschritte mit PBST durch, die jeweils fünf Minuten dauern.Gebe abschließend einige Tropfen Einbettmedium direkt auf die Zellen. Setze den Petrischalen-Deckel wieder auf und lagere die Schale bei Bedarf bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Hier sind repräsentative Phasenkontrastbilder von S2-Zellen nach der Aussaat auf einer ConA- und einer beschichteten Glasboden-Schale dargestellt, wobei die Zahlen die Minuten nach der Aussaat angeben.Die Selbstabflachung ist nach 15 Minuten erkennbar und im Wesentlichen nach 60 Minuten abgeschlossen. Beachten Sie, dass die Zellen phasendunkel werden, während sie sich auf dem beschichteten Deckglas abflachen. In diesem vergrößerten Bild angehefteter Zellen sind ihre ausgedehnten und abgeflachten Ränder, die durch den Pfeil markiert sind, deutlich sichtbar.S zwei Zellen können transfiziert werden, um fluoreszenzmarkierte Proteine zu exprimieren, die Strukturen von Interesse in fixierten oder lebenden Zellen kennzeichnen. In diesem Beispiel wurden S zwei Zellen vorübergehend mit einem Fusionskonstrukt transfiziert, das aus Nukleofin, einem Marker für den Zellkern, und dem Fluorophor EGFP besteht. Diese Zellen wurden auf einer mit ConA beschichteten Scheibe mit Glasboden ausgesät und anschließend mit DIC und epifluoreszenztechnisch abgebildet.S2-Zellen, die mit RNAi behandelt wurden, können ebenfalls fixiert und mittels Immunfluoreszenz analysiert werden. Diese Bilder zeigen fixierte S2-Zellen, die immunhistochemisch für das zentrale Markerprotein PLP in Grün und für Mikrotubuli in Rot gefärbt sind, sowie mit einer Anfärbung für Chromosomen in Blau. Vor der Fixierung und der Immunfärbung wurden die Zellen vier Tage lang entweder mit einer Kontroll-RNAi oder mit einer RNAi zur Herunterregulation des NCDA-KINESIN-ähnlichen Proteins, das die Fokussierung der Spindelpole fördert, behandelt.Die Behandlung mit NCD-RNAi führte zu Zellen mit gespreizten Spindelpolen und ungeordneten Spindeln. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, beim Bohren von Löchern in die Kulturschalen äußerst vorsichtig vorzugehen. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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