Name: Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Erfahren Sie systemische und lokale Arzneimittelverabreichung für das zentrale Nervensystem in Mäusen. Diese Methoden umfassen intravenöse, intraperitoneale und orale Gabe sowie konvektionsverstärkte Zufuhr direkt ins Gehirn.

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NS65819 (CDJ, TO), NS049720 (CDJ), CA097257 (CDJ, TO), CIRM DR1-01426 Wir möchten Raquel Santos für die technische Unterstützung danken.

1. Systemische Delivery Methods Obwohl die systemische Verabreichung von Medikamenten ist nicht der effizienteste Ansatz für die Erreichung hoher Wirkstoffkonzentrationen im ZNS, sind systemische Lieferungen bequem und von den Patienten gut akzeptiert. Hier zeigen wir Ihnen, geeignete Verfahren für drei routinemäßig eingesetzt systemische Verabreichung Ansätze: intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und orale Gabe. A. intravenöse Injektion (Schwanzvene Injection) <ol><li> Vor Beginn des Verfahrens sollte das Körpergewicht jede Maus aufgezeichnet werden. Wie bei allen präklinischen Studien sollte das Körpergewicht regelmäßig überwacht werden (zweimal pro Woche oder mehr), um potenzielle Toxizität von Medikamenten zu beurteilen. Nicht mehr als 1% der Maus das Körpergewicht in Volumen sollte ein einziges Mal injiziert werden. Zum Beispiel sollte nicht mehr als 0,2 ml Flüssigkeit in einer 20g-Maus injiziert werden. Alle Flüssigkeiten intravenös injiziert sollte durch eine geeignete Methode sterilisiert werden. </li><li> Die Maus sollte für 5-10 Minuten entweder mit einem Heizkissen oder eine Wärmelampe, die Schwanzvene erweitern erwärmt werden. Bei Verwendung einer Wärmelampe, überwachen die Maus jederzeit Hyperthermie zu vermeiden. </li><li> Die Maus ist eine Haltevorrichtung, die mit der Maus hemmt dabei den Zugriff auf die Schwanzvene (siehe Video) übertragen. In der Maus tail gibt es vier sichtbaren Gefäße: Die Gefäße auf der Rücken-und Seitenflächen sind Adern, und das Schiff auf der Bauchseite ist eine Arterie. Für den Zugriff auf die Schwanzvene, ist der Schwanz der Maus auf die distale Spitze gehalten, und um 90 Grad gedreht, so dass die Vene nach oben zeigt. Die Einstichstelle wird mit einem Alkoholtupfer gereinigt und 28g Insulinspritze eingelegt ist, abgeschrägte Seite nach oben in die Vene (siehe Video). Wenn die Nadel richtig in die Vene gelegt, sollte sie frei und ohne Druck bewegen. Spritzen Sie das Arzneimittel mit gleichmäßigem Druck über 5-10 Sekunden. Wenn eine Blase erscheint auf dem Schluss-, Brems injiziert, da dies bedeutet, dass die Nadel nicht mehr in die Vene. </li><li> Nach der Injektion sanften Druck auf die Injektionsstelle, bis die Blutung aufhört. Dies dauert in der Regel 30-60 Sekunden. Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten nach der Injektion, um sicherzustellen, dass es keine weiteren Blutungen. </li></ol> B. intraperitoneale Injektion <ol><li> Vor Beginn der Injektion soll das Medikament in eine Spritze an einer 28g Nadel geladen werden. Stellen Sie sicher, dass es Raum in der Spritze zum Zeichnen Sie den Kolben vor der Injektion (z. B. wenn Injektion 200 ul, stellen Sie sicher, dass die Spritze Kapazität 300μL oder höher). </li><li> Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig von seinem Schwanz und legen Sie es auf eine strukturierte Oberfläche, so dass die Maus etwas zu greifen hat. Ein Käfig Deckel ist in der Regel ausreichend. Lassen Sie die Maus an den Körper dehnen und dann mit Ihrer nicht dominanten Hand, fassen Sie die Haut auf dem Rücken der Maus, wobei darauf zu leicht Prise so viel Haut wie möglich zwischen Daumen und Zeigefinger und Mittelfinger (siehe Video). Drehen Sie die Maus um, so dass der Bauch der Maus nach oben zeigt. Wenn die Maus frei bewegen können den Kopf, lassen Sie den Griff und versuchen Sie es erneut, um so zu verhindern, dass während der Injektion gebissen. </li><li> Mit Ihrer dominanten Hand, nehmen Sie die Spritze und die Nadel in einem 30 Grad-Winkel in den linken unteren Quadranten der Maus (siehe Video). Halten Sie die Maus leicht invertiert wird dazu beitragen, die Organe entfernt von der Injektionsstelle. Um sicherzustellen, dass die Nadel in die intraperitoneale Raum ist, zurückziehen auf den Spritzenkolben. Wenn keine Flüssigkeit oder Blut erscheint in der Spritze, dann wird die Nadel nicht in den intraperitonealen Raum und sollte entfernt werden. Wenn keine Flüssigkeit in die Spritze gesaugt wird, dann spritzen die Spritze Inhalte mit gleichmäßigem Druck über 1-5 Sekunden und lassen Sie die Maustaste. </li><li> Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Maus zu normaler Aktivität zurück. </li></ol> C. orale Gabe <ol><li> Vor Beginn der Injektion, und das Gewicht der Maus. Die maximale Lautstärke, die durch orale Gabe geliefert werden kann, ist 10 ml pro Kilogramm Körpergewicht. Zum Beispiel würde das maximale Volumen für ein 20g-Maus werden 200 ul. Der Versuch, größere Volumina zu injizieren kann in Rückfluss Dadurch wird die dazu führen können unvollständig Drug Delivery. Wenn es notwendig ist, um größere Volumina als oben angegeben zu verwalten, können so viele wie drei Dosen über 24 Stunden verabreicht werden. </li><li> Um zu vermeiden, Punktion der Speiseröhre, ist es wichtig, die Länge der Sonde Nadel für jede Maus zu messen. Halten Sie ein 18g Kugelspitze gebogene Sonde Nadel an der letzten Rippe der Maus, und markieren Sie dann die Länge an der Spitze der Maus den Kopf mit einem Permanent-Marker (siehe Video). Während der Magensonde, wird diese Marke ein Haltepunkt, wie Sie die Nadel in den Mund einführen der Maus verschoben werden. </li><li> Restrain der Maus mit den gleichen Handgriff für eine intraperitoneale Injektion. Legen Sie die Sonde Nadel in den Mund, über die Zunge, und ADVAnce die Nadel durch den Rachen. Stecken Sie nicht die Nadel hinter dem Anhalten zu markieren. Die Nadel sollte reibungslos ablaufen ohne Druck (siehe Video). Wenn Sie Druck begegnen, zu stoppen und ziehen Sie die Nadel zu vermeiden Einspritzen von Fluid in die Lunge. </li><li> Mit der Nadel in Stelle, drücken Sie den Kolben über 1-5 Sekunden und entfernen Sie dann die Nadel im gleichen Winkel, dass es eingefügt wurde. Überwachen Sie die Maus für 5-10 Minuten, aufmerksam auf Anzeichen von Atemnot, die zeigen, dass Flüssigkeit in der Lunge gemacht hat, kann. </li></ol> 2. Local Delivery Akute Konvektion-Enhanced Lieferung A. Probe Construction Ein Rückfluss-resistente CED Kanüle für Nager ist noch nicht im Handel erhältlich. Hier zeigen wir Ihnen eine Methode zur Kanüle Konstruktion, die von einer Methode zuerst von Krauze et al (Krauze 2005) beschrieben angepasst wurde. <ul><li> Die Kanüle besteht aus drei Teilen (Abbildung 1): 100 um Durchmesser Kieselsäure Schläuche, durch die der Infusionslösung fließt, eine starre Metall-Nadel für die strukturelle Unterstützung und flexible Teflon-Schlauch für das Laden der Infusionslösung. </li><li> Um die starre Metall-Nadel, mit einer offenen Flamme, die aus Kunststoff auf einem Surflo IV-Katheter (24g Mandrin) schmelzen und mit einer Pinzette entfernen Sie die Nadel aus Metall. Der Rest des Katheters kann verworfen werden. Cut eine Länge von Silica-Schlauch (OD 0.163mm), etwas länger als die Metall-Nadel, mit einem Single-Rasierklinge. Die Rolle der Silica-Schlauch in einen kleinen Tropfen Cyanacrylat enthält, schnell wirkende Kleber (zB Krazy Glue), wobei darauf geachtet, keine Kleber an den Enden der Röhre zu bekommen. Legen Sie die Silica-Schlauch in der Metall-Nadel und lassen Sie für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Nach dem Trocknen sollte die Silica-Schlauch fest mit der Nadel befestigt werden. Die Enden der Kieselsäure entfernt werden sollen, so dass 2mm von Silica-Schlauch ragt aus dem spitzen Ende der Nadel und 3mm von Silica-Schlauch ragt aus dem flachen Ende (siehe Video). </li><li> Schneiden Sie einen Teil der Teflon-Schlauch 20 cm in der Länge. Rollen Sie die Metall-Nadel in einen kleinen Tropfen Kleber wieder dabei nicht zum Aufkleben auf die Enden der Silica-Schlauch zu bekommen, da dies die Kanüle verstopfen. Legen Sie die Nadel in die Teflon-Schlauch bis zu einer Tiefe von 1 cm. Lassen Sie für 1 Minute trocken. Mit einer Heißklebepistole, einen Tropfen Heißkleber auf die Verbindung zwischen dem Metall-Nadel und die Teflon-Schlauch (siehe Video). Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gelenk von allen Seiten bedeckt ist und lassen Sie für mindestens 1 Stunde trocknen lassen. Kanülen kann bis zu einer Woche im Voraus möglich und bei Raumtemperatur gelagert. </li></ul> B. Infusion Procedure <ul><li> Zur Vorbereitung der OP-Bereich, sollten alle Oberflächen mit einem Desinfektionsmittel, wie eine 2% ige Chlorhexidin-Lösung besprüht werden. Sterile OP-Handschuhe sollten während des Verfahrens zu tragen. Die Flächen werden dann mit einem saugfähigen Tüchern abgedeckt. Folgendes sollte in den OP-Bereich platziert werden: <ul><li> Heizkissen für Maus Körpertemperatur aufrecht zu erhalten </li><li> Zwei kleine Petrischalen, eine mit 3% Wasserstoffperoxid und einem Gehalt von 2% Chlorhexidin </li><li> Sterile Gaze und Wattestäbchen </li><li> Sterile Einweg-Skalpelle (Number 21) </li><li> Sterile Nadeln 22g </li><li> Maus stereotaktischen Rahmen </li><li> Controlled Rate Spritzenpumpe </li><li> Autoklaviert Mäusehaut Hefter, Heftklammern und Enthefter </li></ul></li><li> Zum Einrichten der CED Kanüle, fügen Sie eine 1-ml-Spritze mit dem Teflon-Schlauch mit einem Satz von Kunststoff-Spritze Adapter. Die Kanüle sollte der stereotaktischen Rahmen befestigt werden, so dass es senkrecht auf der chirurgischen Oberfläche (siehe Video). Zur Desinfektion der Kanüle, füllen Sie die 1-ml-Spritze mit 70% Ethanol und drücken Sie den Kolben auf die Ethanol durch die Kanüle laufen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer sterilen Kochsalzlösung, und auf eventuelle Lecks um die Kanüle Gelenke. Zur Desinfektion der Außenseite der Kanüle vorsichtig mit einem 70% igem Ethanol wischen wischen. </li><li> Füllen Sie die Kanüle mit steriler Kochsalzlösung und dann zurück ziehen auf Spritze, so dass eine kleine Luftblase in die Kanüle gezogen wird. Diese Luftblase wird der Infusionslösung aus der Kochsalzlösung in die Kanüle zu trennen. Dann tendieren, Ihre Infusionslösung (siehe Video). Die Spritze an die Spritzenpumpe und Pumpe entlüften durch kurzes Laufenlassen der Kanüle. </li><li> Sedate der Maus mit einem injizierten Anästhetikums und bereiten die Haut durch Abtupfen mehrmals (5-10 Sekunden) mit einem Stück steriler Gaze eingetaucht in die 2% Chlorhexidin-Lösung. Ophthalmic Salbe sollte die Maus aufgetragen werden, um ausreichende Feuchtigkeit während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Mit einem sterilen Skalpell, erstellen Sie eine sagittale Schnittführung entlang der Mittellinie des Schädels, etwa 1,5 cm lang (siehe Video). Der Schädel Oberfläche wird dann gereinigt mit einem Wattestäbchen in eine 3% ige Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. Achten Sie darauf, zu vermeiden, Wasserstoffperoxid in den Augen der Maus. Die Naht Linien des Schädels sollte an dieser Stelle deutlich: wenn sie nicht sichtbar sind, sanft Tupfer den Schädel mit einem fresh Wattestäbchen in 3% Wasserstoffperoxid-Lösung getränkt. </li><li> Identifizieren Sie die Bregma (Abbildung 2) und messen Sie dann 2mm nach rechts und 1mm posterior dieser Struktur, um die Infusion Site zu suchen. Mit dem sterilen 22g Nadel, sanft erstellen ein Loch in den Schädel an dieser Stelle durch Drehen der Nadel gegen den Schädel (siehe Video). Vermeiden Sie zwingen die Nadel nach unten gegen den Schädel. </li><li> An diesem Punkt sollte die Maus in der stereotaktischen Rahmen platziert werden und beginnen Erhalt eingeatmet Betäubung (siehe Video). Verwalten der Narkose auf einem niedrigen Niveau (1%) und sorgfältig überwachen die Maus für Veränderungen in der Atemfrequenz, die Anpassung der Narkose entsprechend. </li><li> Position der Kanüle über den Schädel Loch und senken Sie dann 3 mm unterhalb der Kopfoberfläche. Beginnen Sie die Infusion mit den folgenden Raten und Laufzeiten: <table border="0"><tbody><tr><td> 0,1 ul / min für 5 Minuten </td><td rowspan="5"><img src="/files/ftp_upload/1992/1992tablefigure.png" alt="Gesamtvolumen 10 ul" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Gesamtvolumen 10 ul"></td></tr><tr><td> 0,2 ul / min für 5 Minuten </td></tr><tr><td> 0,5 ul / min für 5 Minuten </td></tr><tr><td> 0,8 ul / min für 7,5 Minuten </td></tr><tr><td> OFF für 1 Minute </td></tr></tbody></table></li><li> Am Ende der Infusion langsam entfernen Sie die Kanüle und Tupfer des Schädels mit 3% Wasserstoffperoxid. Bewerben sterile Knochenwachs, um das Loch (siehe Video). Mit einer Pinzette, ziehen die Haut zusammen über den Schädel und heften sich zu schließen. Buprenorphin sollte für post-operative Schmerzlinderung verabreicht werden. </li><li> Überwachen Sie die Maus nach der Operation, bis er das Bewusstsein wiedererlangt und Mobilität. Aufgrund der Länge des Verfahrens, kann es bis zu einer Stunde für die Maus, um volle Aktivität wiederzugewinnen. Während dieser Zeit die Maus Käfig auf einem Heizkissen zu vermeiden, Hypothermie und nicht Haus der Erholung Maus mit anderen aktiven Mäusen. </li><li> Hautklammern sollten entfernt werden eine Woche nach der Operation. </li></ul> C. In Vivo Imaging Fluoreszenzmarkierten Infusionslösung kann nach CED Verwaltung abgebildet werden, und können auf Veränderungen in der Signalintensität sowie Signal Lage überwacht werden. In der Regel ist es am besten 2-3 Stunden nach der Infusion zu Bild warten, um damit die Maus, um aus der Infusion zu erholen. <ul><li> Für Anästhesie während der Bildgebung, verwenden Sie ein niedriges Niveau eines inhalativen Narkosemittel. Bewegen Sie die Maus, dorsale Seite nach oben in einem bildgebenden Station (zB IVIS Lumina, Caliper Life Sciences, Alameda, CA). Mit einem entsprechenden Filter-Einstellung für die Fluor, dass belichtet wird, erwerben Sie ein Bild. Für CED sollte eine erfolgreiche Infusion zeigen das meiste Material in das Gehirn in der Nähe der Injektionsstelle (Abbildung 3). </li></ul> 3. Repräsentative Ergebnisse Ein Mangel an Nebenwirkung der Gabe von Therapie ist ein wichtiger Indikator für eine erfolgreiche Injektion. Zum Beispiel folgende Schwanzvene Injektion sollte es keine Veränderung im Aussehen (zB Größe, Farbe) des Schwanzes werden. Eine Blase oder Blase folgenden Schwanzvene Injektion würde bedeuten, subkutane, anstatt intravenös, Lieferung der Therapie. Für intraperitoneale Injektionen, kann eine Beule auf der Haut oder Verfärbung des Bauches zeigen subkutane Injektion oder Schäden an inneren Strukturen. In orale Gabe, arbeitete eine Maus mit Atmen oder Husten kann darauf hindeuten, dass Flüssigkeit in die Lunge injiziert wurde, anstatt in den Magen. Für CED ist die neurologische Funktion für die Beurteilung der erfolgreichen Verwaltung der Therapie wichtig. Eine Maus, die ausstellenden Anfälle oder Hemiparese ist, kann eine falsche Infusion erhalten haben. Wenn eine fluoreszierende Infusionslösung verwendet wird, kann in-vivo-Bildgebung zur Beurteilung der erfolgreichen Verwaltung (Abbildung 3) angewendet werden. Wenn die Infusionslösung nicht an der Injektionsstelle lokalisierte, wurde die Infusion nicht erfolgreich. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: CED Kanüle und OP-Set-up. Die Grundelemente der Konvektion-enhanced Lieferung OP-Set-up gezeigt. Eine Mikroinjektion Pumpe (A) ist es, die Infusionskanüle beigefügt (B, gezeigt oben vergrößert). Ein stereotaktischen Rahmen (C) wird verwendet, um die Sonde Position. Dieses Bild enthält keine Heiz-und Anästhesie-Utensilien auch während des Verfahrens verwendet. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Maus Schädel Nahtlinien. Der CED Infusionsstelle (roter Stern) kann durch die Identifizierung der Schnittpunkt der sagittalen und koronaren Nähte (Bregma) und dann die Messung 2mm lateral und 1mm hinteren Teil des Bregma liegen. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse aus Erfolgreiche CED. Liposomes mit weit rot fluoreszierenden Farbstoff markiert wurden in das Gehirn der Maus mit CED infundiert und abgebildet in vivo und ex vivo. Eine erfolgreiche Infusion zeigt ein Fluoreszenz-Signal lokalisiert an den Ort der Infusion sowohl in vivo (A) und ex vivo (B). Das Signal sollte die Infusion Hemisphäre ohne Leckage in der kontralateralen Hemisphäre lokalisiert werden. <img src="/files/ftp_upload/1992/1992fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: Repräsentative Image of Erfolgreiche CED in den Rat Hirnstamm. Fluoreszenzmarkierten Liposomen wurden in der Ratte Hirnstamm infundiert. Bei Ratten können so viel wie 20 &amp;mgr; l infundiert werden. Die erhöhte Dicke der Ratte Schädel und Tiefe der Injektion in vivo-Bildgebung ausgeschlossen, aber richtige Infusion Lage könnte durch Ex-vivo-Bildgebung des Gehirns seziert überprüft werden.

<ol><li>Bobo, R. H., Laske, D. W., Akbasak, A., Morrison, P. F., Dedrick, R. L., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 2076-2080 (1994).</li>
<li>Degen, J. W., Walbridge, S., Vortmeyer, A. O., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+convection-enhanced+delivery+of+gemcitabine+or+carboplatin+in+a+malignant+glioma+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of convection-enhanced delivery of gemcitabine or carboplatin in a malignant glioma model in rats.</a> J Neurosurg. 99, 893-898 (2003).</li>
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<li>Murad, G. J., Walbridge, S., Morrison, P. F., Garmestani, K., Degen, J. W., Brechbiel, M. W., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+image-guided%2C+convection-enhanced+delivery+of+interleukin+13+bound+to+pseudomonas+exotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time, image-guided, convection-enhanced delivery of interleukin 13 bound to pseudomonas exotoxin.</a> Clin Cancer Res. 12, 3145-3151 Forthcoming.</li>
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<li>Szerlip, N. J., Walbridge, S., Yang, L., Morrison, P. F., Degen, J. W., Jarrell, S. T., Kouri, J., Kerr, P. B., Kotin, R., Oldfield, E. H., Lonser, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> J Neurosurg. 107, 560-567 (2007).</li>
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<li>Yamashita, Y., Krauze, M. T., Kawaguchi, T., Noble, C. O., Drummond, D. C., Park, J. W., Bankiewicz, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+a+topoisomerase+I+inhibitor+%28nanoliposomal+topotecan%29+and+a+topoisomerase+II+inhibitor+%28pegylated+liposomal+doxorubicin%29+in+intracranial+brain+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of a topoisomerase I inhibitor (nanoliposomal topotecan) and a topoisomerase II inhibitor (pegylated liposomal doxorubicin) in intracranial brain tumor xenografts.</a> Neuro Oncol. 9, 20-28 (2007).</li>
</ol>

Alle Verfahren gezeigt, hier wurden von der UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

Präklinische Beurteilung der Wirksamkeit eines therapeutischen Wirkstoffs muss berücksichtigt pharmakologischen Eigenschaften des Erregers und das Zielgewebe des Interesses zu nehmen. Während systemische Methoden der Verwaltung im Allgemeinen sind leicht und von den Patienten besser vertragen, die Selektivität der Blut-Hirn-Schranke erfordert häufig lokale Auslieferung der Therapie zur Behandlung von ZNS-Erkrankungen. CED: Hier haben wir eine Methode zur direkten Abgabe an das Gehirn nachgewiesen. Andere Formen der lokalen Übermittlung an das Gehirn sind direkte Verabreichung an den Liquor, intratumorale Bolus-Injektion, und ventrikuläre Injektion. Für diese Verfahren ist Diffusionsfähigkeit von therapeutischen entscheidender Bedeutung, mit einer schlechten Diffusionsgrenzstrombereich der Region der Berichterstattung auf wenige Millimeter an der Injektionsstelle (Jain 1989, Bobo 1994). Im Gegensatz dazu nutzt CED positive Druck auf den Bereich der Verteilung von Medikamenten (Bobo 1994) zu erhöhen, während noch Therapien ermöglichen gezielt auf bestimmte neuroanatomische Strukturen. In unserem Labor haben wir erfolgreich durchgeführt in den Hirnstamm sowie in den caudatus Putamen bei Nagetieren (Abbildung 4) CED. Die Fähigkeit zur Durchführung CED in Nagermodellen immer wichtiger geworden in Verbindung mit zunehmenden Interesse an der Maximierung therapeutische Wirksamkeit bei der Behandlung von verschiedenen Arten von ZNS-Erkrankungen. CED lassen sich eine Vielzahl von Wirkstoffen, einschliesslich gereinigte Proteine, Medikamente aus kleinen Molekülen und Viren (Gill 2003, Degen 2003, Szerlip 2007) zu liefern. Das Spektrum der Krankheiten, die mit CED behandelt werden können, gehören Krebserkrankungen des zentralen Nervensystems (Yamashita 2007) sowie neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson (Gill 2003). Da CED Forschung weiter ausgebaut wird, die Notwendigkeit in-vivo-Bildgebung von CED-Therapie verabreicht wird ähnlich zu. Während die Fluoreszenz-Bildgebung zeigte sich hier wahrscheinlich nicht durch den menschlichen Schädel zu sehen, sind andere Methoden unter Verwendung von Co-Infusion von MRI-Kontrastmitteln (Dickinson 2008) das Interesse für die Beurteilung der Anwendbarkeit für die Überwachung der Infusionen bei Patienten mit ZNS-Erkrankung.

<table><tbody><tr><td>2% Chlorhexidin</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td>AKA Nolvasan&amp;#8221;</td></tr><tr><td>20g-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>28g-Nadel (mit Spritze)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-004-270</td><td>AKA Insulinspritze</td></tr><tr><td>3% Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td>Vor Licht geschützt lagern</td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td>Vor Gebrauch autoklavieren</td></tr><tr><td>Haftkleber auf Cyanoacrylat-Basis</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9592632</td><td>AKA Krazy Glue&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Einweg-Skalpelle</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>Nr. 21</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td>Vor Gebrauch autoklavieren</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>I.V.-Katheter</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-20</td><td></td></tr><tr><td>Infusionspumpe</td><td>BASi</td><td>MD-1000, MD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Living-Image-Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Preisanfrage erforderlich</td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>AKA Akwa Tears&amp;#8221;</td></tr><tr><td>Kunststoff-Spritzenadapter</td><td>Upchurch Scientific</td><td>P-604, P-200NX, P-215X, P-630</td><td>Passt auf Luer-Lock-Spritzen</td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000020</td><td></td></tr><tr><td>Hautheftgerät, Klammern, Entferner</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Teflonschlauch</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1520</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Preisanfrage erforderlich</td><td></td></tr></tbody></table>

systemischen und lokalen drug delivery zur behandlung von erkrankungen des zentralen nervensystems in nagermodellen

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Gründliche präklinische Testung des zentralen Nervensystems (ZNS)-Therapeutika enthält eine Betrachtung der Verabreichungswege und Agenten Bioverteilung bei der Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit. Zwischen den beiden großen Klassifikationen der Verwaltung, sind lokale vs systemische, systemische Verabreichung Ansätze oft bevorzugt wegen der Verwaltung zu vereinfachen. Allerdings kann die systemische Verabreichung in suboptimal Wirkstoffkonzentration in das ZNS erzielten Ergebnis und führen zu falschen Schlussfolgerungen hinsichtlich Agent Wirksamkeit. Local Drug-Delivery-Methoden sind invasiv, kann aber erforderlich sein, um therapeutische ZNS-Medikamenten zu erreichen. Hier zeigen wir die richtige Technik für drei Routen von systemischen Drug Delivery: intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und orale Gabe. Darüber hinaus zeigen wir eine Methode zur lokalen Übermittlung an das Gehirn: Konvektion-Enhanced Delivery (CED). Die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Verbindungen ist für In-vivo-Bildgebung und Überprüfung der ordnungsgemäßen Drug Administration enthalten. Die Methoden werden anhand von Mausmodellen, kann aber leicht für die Verwendung in Ratten angepasst werden.

Gründliche präklinische Testung von Medikamenten, die in das zentrale Nervensystem wirken oft mit der Beurteilung und den Vergleich von Medikament Bioverteilung in Verbindung mit bestimmten Arten der Verabreichung. Hier sind drei gängige Methoden der systemischen Verabreichung (intravenös, intraperitoneal, und mündlich) sowie eine Methode für die lokale Zustellung (Konvektion-Enhanced Delivery) bei Mäusen nachgewiesen.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Umfassende präklinische Tests von Therapeutika für das Zentralnervensystem (ZNS) beinhalten die Berücksichtigung der Verabreichungswege und der Biodistribution des Wirkstoffs ...

In diesem Videoartikel werden vier Methoden der Wirkstoffabgabe an das zentrale Nervensystem demonstriert. Die ersten drei Methoden sind intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion und orale Gavage. Alle drei Methoden führen zu einer systemischen Wirkstoffabgabe.Die letzte Methode ist eine lokale Medikamenteninfusion in das Gehirn der Maus. Bei dieser Methode wird eine optische Bildgebung in vivo verwendet, um die korrekte Infusion zu überprüfen. Die drei systemischen Verabreichungstechniken sind Standardverfahren, die in präklinischen Umgebungen weit verbreitet sind.Die lokale Applikationstechnik ist etwas anspruchsvoller, ermöglicht jedoch die direkte Verabreichung eines Wirkstoffs ins Gehirn unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen in der neuartigen Onkologie zu beantworten, wie beispielsweise die Wirksamkeit und Verteilung neuartiger Therapeutika, obwohl diese Methoden Einblicke in die neuartige Behandlung von Hirntumoren ermöglichen können.Diese Methoden können auch auf andere Erkrankungen des zentralen Nervensystems angewendet werden, wie beispielsweise neurodegenerative und psychiatrische Störungen. Um die Schwanzvene des Mäuschen mit einer Wärmelampe zu weiten, das Tier fünf bis zehn Minuten lang erwärmen und dabei die Maus stets sorgfältig überwachen, um eine Unterkühlung während der Erwärmung zu vermeiden. Die Substanz in eine 28-Gauge-Insulinspritze einfüllen.Es sollte nicht mehr als 1 % des Körpergewichts der Maus an Volumen auf einmal injiziert werden. Nachdem fünf bis zehn Minuten vergangen sind, um die Maus in eine Haltevorrichtung zu überführen, sind am Schwanz der Maus vier sichtbare Gefäße vorhanden.Die dorsalen und lateralen Gefäße sind Venen. Das ventrale Gefäß ist eine Arterie. Um die laterale Schwanzvene zu erreichen, halten Sie den Schwanz der Maus am distalsten Punkt und drehen Sie ihn um 90 Grad, sodass die Vene nach oben zeigt. Reinigen Sie die Injektionsstellen mit einem Alkoholtupfer.Als Nächstes führen Sie die vorbereitete Spritze mit der Schräge nach oben in die Vene ein. Wenn die Nadel korrekt in der Vene platziert ist, sollte sie sich frei und ohne Widerstand bewegen lassen. Injizieren Sie das Medikament langsam mit gleichmäßigem Druck über fünf bis zehn Sekunden.Wenn der Schwanz anschwillt, beenden Sie die Injektion, da dies darauf hinweist, dass sich die Nadel nicht mehr in der Vene befindet. Nach der Injektion sollte sanfter Druck auf die Injektionsstelle ausgeübt werden, bis die Blutung stoppt. Dies dauert normalerweise 30 bis 60 Sekunden.Überwachen Sie die Maus fünf bis zehn Minuten lang, um sicherzustellen, dass keine weitere Blutung auftritt. Bereiten Sie dieses Verfahren vor, indem Sie eine Spritze mit einer 28-Gauge-Nadel mit dem Wirkstoff befüllen. Nehmen Sie die Maus am Schwanz aus ihrem Käfig und setzen Sie sie auf eine strukturierte Oberfläche, beispielsweise einen Käfigdeckel, damit die Maus Halt finden kann.Lassen Sie die Maus ihren Körper strecken. Fassen Sie danach die Haut auf dem Rücken der Maus, wobei Sie so viel Haut wie möglich vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger sowie Mittelfinger leicht anfassen. Drehen Sie die Maus um, sodass der Bauch der Maus nach oben zeigt.Wenn die Maus ihren Kopf frei bewegen kann, lösen Sie den Griff und versuchen Sie es erneut. Um während der Injektion zu vermeiden, gebissen zu werden, halten Sie die Maus leicht invertiert, um die Organe von der Injektionsstelle wegzubewegen. Führen Sie die vorbereitete Spritzennadel in einem Winkel von 30 Grad in das untere linke Quadrant der Maus ein, um sicherzustellen, dass sich die Nadel im intraperitonealen Raum befindet.Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück. Wenn keine Flüssigkeit in die Spritze aspiriert wird, injizieren Sie den Spritzeninhalt mit gleichmäßigem Druck über eine bis fünf Sekunden. Lassen Sie die Maus los.Überwachen Sie die Maus fünf bis 10 Minuten nach der Injektion, um sicherzustellen, dass sie zu normalen Aktivitätsniveaus zurückkehrt. Beginnen Sie die orale Gavage, indem Sie bestimmen, wie weit die Kanüle in den Mund der Maus eingeführt werden kann. Halten Sie eine gekrümmte Gave-Kanüle mit Kugeltipp, 18 G, am letzten Rippenbogen fest.Kennzeichnen Sie die Länge mit einem Permanentstift. Wiegen Sie die Maus, um das Injektionsvolumen zu bestimmen. Das maximale Volumen, das mittels oraler Gavage verabreicht werden kann, beträgt 10 Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht.Danach die Kanüle befüllen. Anschließend die Maus mit dem gleichen Griff fixieren, wie zuvor für die intraperitoneale Injektion gezeigt. Die Gavage-Kanüle über die Zunge in den Mund einführen und die Kanüle durch den Pharynx vorwärtsbewegen, um eine Perforation der Speiseröhre zu vermeiden.Stechen Sie die Nadel nicht über die Anschlagmarke hinaus ein. Die Nadel sollte sich ohne Druck sanft vorwärts bewegen lassen. Mit eingesetzter Nadel langsam den Kolben herunterdrücken.Entfernen Sie die Nadel im selben Winkel, in dem sie eingeführt wurde. Versuchen Sie nicht, größere Volumina als empfohlen zu injizieren, da dies zu Reflux und unvollständiger Medikamentenabgabe führen kann.Stellen Sie die Maus zurück in ihren Käfig und beobachten Sie sie fünf bis zehn Minuten lang. Achten Sie dabei besonders auf Anzeichen einer erschwerten Atmung, die darauf hindeuten könnten, dass Flüssigkeit in die Lunge gelangt ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang, falls erforderlich.Bis zu drei Dosen können innerhalb von 24 Stunden verabreicht werden, da eine refluxresistente CED-Kanüle für Nagetiere derzeit nicht kommerziell erhältlich ist. Konstruieren Sie eine Kanüle, die aus drei Teilen besteht: Einem Stück Kieselsäureschlauch mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern, durch den die Infusion fließt.Eine starre Metallnadel zur strukturellen Stützung und flexible Teflon-Schläuche zum Befüllen des Infuse.Eight. Zur Vorbereitung des chirurgischen Bereichs alle Oberflächen mit 2 % Chlorhexidin-Desinfektionsmittel besprühen. Anschließend die Oberflächen mit saugfähigen Tüchern abdecken.Folgende Materialien sollten im Operationsbereich bereitgelegt werden: zusätzliche Petrischalen, eine mit 3 % Wasserstoffperoxid und eine mit 2 % Chlorhexidin, sterile Tupfer und Wattestäbchen. Sterile Einweg-Scalpelle der Größe 21, Autoklav, Hautheftgerät für Mäuse, Heftklammern und Entferner für Heftklammern.Sterile 20-Gauge-Nadeln, eine Heizplatte zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur der Maus, ein stereotaktischer Halter für Mäuse und eine Spritzenpumpe mit einstellbarer Geschwindigkeit. Zum Einrichten der Kanüle befestigen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze an dem Teflonrohr. Befestigen Sie mithilfe eines Satzes plastischer Spritzenadapter die Kanüle am stereotaktischen Halter, sodass sie senkrecht zur Operationsfläche steht.Desinfizieren Sie die Kanüle mithilfe einer Ein-Milliliter-Spritze, indem Sie 70 % Ethanol hindurchlaufen lassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit steriler Kochsalzlösung. Überprüfen Sie anschließend, ob an den Kanülenverbindungen Leckagen vorhanden sind.Ziehen Sie den Kolben auf, sodass eine kleine Luftblase in die Kanüle aufgenommen wird. Diese Luftblase trennt das Infuse Eight vom Kochsalzlösung. Laden Sie anschließend das Infuse Eight rückwärts auf.Spülen Sie die Pumpe, indem Sie die Kanüle kurz durchlaufen lassen. Wechseln Sie die Haut eines anästhesierten Mäuses durch steriles Gore, das in 2 % Chlorhexidin getaucht wurde, und tragen Sie ein Augensalbe auf, um während des Eingriffs eine ausreichende Feuchtigkeit der Augen aufrechtzuerhalten. Erstellen Sie mit einem sterilen Skalpell einen sagittalen Schnitt entlang der Schädelmitte, etwa 1,5 Zentimeter lang.Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit einem in einer 3 %igen Wasserstoffperoxidlösung getränkten Wattestäbchen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Nähte des Schädels deutlich sichtbar sein. Falls erforderlich, tupfen Sie den Schädel vorsichtig mit einem frischen, in einer 3 %igen Wasserstoffperoxidlösung getränkten Wattestäbchen ab.Identifizieren Sie das bgma und messen Sie dann zwei Millimeter nach rechts und einen Millimeter posterior, um die Infusionsstelle zu bestimmen. Erstellen Sie mit einer sterilen 20-Gauge-Nadel vorsichtig ein Loch im Schädel an dieser Stelle, indem Sie die Nadel im Schädel drehen. Vermeiden Sie es, die Nadel mit Druck nach unten gegen den Schädel zu drücken.Zu diesem Zeitpunkt überführen Sie die Maus in den stereotaktischen Halter und beginnen mit der Verabreichung eines inhalativen Anästhetikums auf niedrigem Niveau. Überwachen Sie die Maus sorgfältig auf Veränderungen der Atemfrequenz und passen Sie das Anästhetikum entsprechend an.Daher ist dieser nächste Schritt vermutlich der schwierigste Aspekt der gesamten Methode. Achten Sie beim Einsetzen der Kanüle darauf, diese mittig über der Öffnung zu positionieren. Überprüfen Sie hierzu die Platzierung der Kanüle aus allen Blickwinkeln.Als Nächstes positionieren Sie die Kanüle über dem Schädelloch und senken sie dann drei Millimeter unter die Schädeloberfläche ab. Beginnen Sie die Infusion, indem Sie die Spritzenpumpe einschalten, und verwenden Sie die hier am Ende der Infusion angegebenen Raten und Dauern. Entfernen Sie die Kanüle langsam und spülen Sie den Schädel mit 3 % Wasserstoffperoxid aus.Tragen Sie sterile Knochenwachs mit einer Pinzette auf die Öffnung auf. Ziehen Sie die Haut zusammen und verschließen Sie sie mit Hautklammern. Verabreichen Sie Buprenorphin subkutan zur postoperativen Schmerzlinderung.Stellen Sie die Maus in einen Käfig auf eine Heizplatte, um eine Hypothermie zu vermeiden. Unterbringen Sie die sich erholende Maus nicht zusammen mit anderen aktiven Mäusen. Überwachen Sie die Maus postoperativ, bis sie das Bewusstsein und die Bewegungsfähigkeit wiedererlangt hat.Aufgrund der Länge des Verfahrens kann es bis zu einer Stunde dauern, bis die Maus ihre volle Aktivität wiedererlangt. Falls eine Bildgebung durchgeführt wird, ist es am besten, zwei bis drei Stunden zu warten, bevor die Bildgebung der fluoreszenzmarkierten Infusion erfolgt. Acht. Nach der CED-Gabe positionieren Sie die anästhesierte Maus mit der dorsalen Seite nach oben in einer Bildgebungskammer unter Verwendung der geeigneten Filtereinstellung für die zu bildgebende Fluoreszenz.Erfassen Sie ein Bild für die CED. Bei einer erfolgreichen Infusion sollte sich das meiste Material innerhalb des Schädels in der Nähe der Infusionsstelle befinden. Das Fehlen einer Nebenwirkung nach der Verabreichung der Therapie ist ein wichtiger Hinweis auf eine erfolgreiche Injektion.Die folgenden Anzeichen deuten auf fehlerhafte Injektionen bei Schwanzinjektionen hin: Veränderungen im Aussehen von Größe oder Farbe des Schwanzes, eine Blase oder ein Bläschen im Schwanz, was auf eine subkutane statt intravenöse Applikation hindeutet. Bei intraperitonealen Injektionen kann ein Hautknubbel oder eine Verfärbung des Abdomens auf eine subkutane Injektion oder eine Schädigung innerer Strukturen hindeuten.Bei der oralen Gavage kann eine Maus mit schwerer Atmung oder Husten darauf hinweisen, dass die Flüssigkeit in die Lunge und nicht in den Magen injiziert wurde. Bei der CED ist die neurologische Funktion wichtig, um eine erfolgreiche Applikation der Therapie zu beurteilen. Eine Maus, die Anfälle oder eine Hemiparese zeigt, hat möglicherweise eine fehlerhafte Infusion erhalten.Hier wurde die In-vivo-Bildgebung an einer Maus durchgeführt, wobei links eine erfolgreiche CED-Infusion und rechts eine erfolglose Infusion gezeigt wird. Beachten Sie, dass beim erfolgreichen Infusionsvorgang das Bildgebungssignal auf das Gehirn beschränkt ist. Bei der erfolglosen Infusion hingegen hat sich das Signal entlang der Nervenachse ausgebreitet.Wie Sie gesehen haben, besteht der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens in der richtigen Auswahl der Applikationsroute. Bei der Verabreichung von Arzneimitteln an das zentrale Nervensystem ist es wichtig, die pharmakologischen Eigenschaften der Arzneimittel zu berücksichtigen, um die beste Applikationsform auszuwählen. Das war's also.Ich hoffe, diese Präsentation war für Sie hilfreich, und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine mikrochirurgische Infusionstechnik für Mäuse, die effektiv Substanzen direkt über die Arteria carotis interna in das Gehirn abgibt.

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS über Die Arteria carotis interna

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Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem

Hier beschreiben wir eine Methode zur Abgabe von Medikamenten an das zentrale Nervensystem der Ratte, indem wir einen Katheter in den lendenintrathekalen Raum der Wirbelsäule implantieren. Wir konzentrieren uns auf die Lieferung von Antisense-Oligonukleotiden, obwohl diese Methode auch für die Lieferung anderer therapeutischer Modalitäten geeignet ist.

Intrathekale Lieferung von Antisense Oligonukleotiden im Zentralen Nervensystem der Ratte

Eine Methode zur Abgabe neuronaler Stammzellen, anpassungsfähig für Injektionslösungen oder Suspensionen, durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) nach ischämischem Schlaganfall wird berichtet. Injizierte Zellen sind breit über das Gehirn Parenchym verteilt und kann bis zu 30 d nach der Geburt nachgewiesen werden.

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