Photokonversion von gereinigtem fluoreszierende Proteine ​​und Dual-Sonde Optische Hervorhebung in lebenden Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die fluoreszierenden Proteine mOrange2 und Dronpa für eine optische Doppelmarkierung zu verwenden, um vier einzelne Zellpopulationen oder zelluläre Kompartimente selektiv zu markieren. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit schwachem 488-Nanometer-Anregungslicht bestrahlt werden, wodurch die gesamte grüne Dronpa-Fluoreszenz ausgeschaltet wird. Im zweiten Schritt werden die Zellen einem intensiven 488-Nanometer-Anregungslicht ausgesetzt, das die mOrange-Fluoreszenz photochemisch in rote Fluoreszenz umwandelt.

Anschließend werden die Zellen einer Zwei-Photonen-Anregung mit 800 Nanometer ausgesetzt, um die Dral-Fluoreszenz einzuschalten. Auch hier liefern die Ergebnisse den Nachweis, dass eine Markierung von Zellen in vier unterschiedlichen Kombinationen auf der Grundlage einer optischen Hervorhebung mit zwei Sonden mittels M Orange zwei und gezogenem ppa möglich ist. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Experimenten wie der subzellulären Fraktionierung besteht darin, dass es an lebenden Zellen durchgeführt wird.

Dieses Verfahren kann helfen, zentrale Fragen in der Biologie der Beta-Zellen zu beantworten, beispielsweise warum nur ein kleiner Bruchteil der Insulinvesikel freigesetzt wird. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in die Funktion der Beta-Zellen ermöglicht, kann es auch auf andere Systeme angewendet werden. Zum Beispiel die Verfolgung von Krebszellen in vivo. Eine Probe mit fluoreszierenden Proteintropfen besteht aus einer oktalen Wasseremulsion, in deren wässriger Phase ein fluoreszierendes Protein vorliegt.

Diese Emulsion wird für mikroskopische Anwendungen zwischen einer Objektträgerplatte und einer 22 Millimeter großen quadratischen Deckglasplatte eingeschlossen. Zu Beginn dieses Verfahrens müssen die Objektträger und Deckgläser gereinigt und mit einem hydrophoben Mittel beschichtet werden. Reinigen Sie die Glaswaren, indem Sie sie fünf Minuten lang mit Aceton waschen.

Nach dem Spülen lassen Sie das Glasgerät an der Luft trocknen. Bereiten Sie anschließend eine 2%-ige Methyltrimethoxysilanslösung in Aceton vor und beschichten Sie das Glasgerät zwei Minuten lang mit dieser Lösung. Nach der Beschichtung nehmen Sie das Glasgerät aus der Lösung und lassen es trocknen.

Anschließend spülen Sie das Glasgerät mit 70 % Ethanol aus einer Sprühflasche ab. Nach dem Spülen lassen Sie das Glasgerät erneut an der Luft trocknen und entfernen jegliche restliche Flüssigkeit. Unter Verwendung von Druckluft kann das beschichtete Glasgerät mindestens einen Monat lang aufbewahrt werden.

Nachdem das Glaswerk vorbereitet wurde, beschaffen Sie fluoreszierende Proteine, die zuvor als His-markierte Proteine aus E. coli gereinigt wurden. Messen Sie das Absorptionsspektrum des gereinigten Proteins. Bereiten Sie eine Stammlösung mit einer optischen Dichte von etwa 0,1 in Tris-gepufferter Salzlösung mit pH 8, die 0,1 % Rinderserumalbumin enthält, her.

Bereiten Sie zusätzlich 10 Milliliter einer 1:1-Mischung aus einem Octal und einer Tris-gepufferten Salzlösung in einem 15-Milliliter-Kegelrohr vor und mischen Sie diese gründlich. Lassen Sie die Mischung nach dem Mischen stehen, bis die Phasentrennung vollständig ist. Die obere Phase ist das Octal. Geben Sie zur Herstellung der Emulsion 45 Mikroliter eines Octals und 5 Mikroliter fluoreszierendes Protein in ein Epi- oder Orph-Röhrchen.

Tippen Sie einige Male auf das Röhrchen, um die Emulsionsbildung einzuleiten, und behandeln Sie das Röhrchen anschließend 30 Sekunden im Ultraschallbad. In der Zwischenzeit bereiten Sie einen beschichteten Objektträger und eine Deckglas vor, die nach der Beschallung verwendet werden. Die Emulsion sollte vollständig trüb sein.

Pipettieren Sie sofort vier Mikroliter der Emulsion aus der Mitte des Röhrchens auf einen beschichteten Objektträger und decken Sie sie mit einem beschichteten Deckglas ab. Die Emulsion sollte sich gleichmäßig zwischen Objektträger und Deckglas verteilen. Innerhalb weniger Minuten sollte die Probe stabil sein.

Das folgende Verfahren stellt eine allgemeine Strategie zur Durchführung eines Photo-Konversions-Experiments mit einem fluoreszierenden Protein an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop dar. Dieses Verfahren kann sowohl für gereinigte Proteine als auch für lebende Zellen angewendet werden. In diesem Experiment dient eine Tropfenprobe, die das gereinigte m orange two Protein enthält, als allgemeiner Ausgangspunkt für die Photo-Konversion.

Richten Sie das konfokale Laserscanning-Mikroskop wie folgt ein. Verwenden Sie ein 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3 und eine Bildgröße von 512 mal 512 Pixeln. Stellen Sie die Pixelverweilzeit auf sechs Mikrosekunden ein, den Scan-Zoom auf vier und vergrößern Sie die Lochblende, um eine Z-Auflösung von drei Mikrometern zu erreichen.

Konfigurieren Sie zwei Detektionskanäle für die anfängliche und die photochemisch umgewandelte Fluoreszenz sowie einen Photoumwandlungskanal. Beobachten Sie die orange Spezies mit 561 Nanometer Anregungslicht und sammeln Sie die Fluoreszenz zwischen 570 und 630 Nanometern. Detektieren Sie die photochemisch umgewandelte rote Spezies mit 633 Nanometer Anregungslicht und sammeln Sie die Fluoreszenz zwischen 640 und 700 Nanometern.

Für den Photo-Konversionskanal wählen Sie die 488-Nanometer-Laserlinie aus und erfassen Sie die Fluoreszenz zwischen 490 und 540 Nanometern. Die Aufnahme des Photo-Konversionskanals ist nicht zwingend erforderlich, kann aber hilfreich sein. Beginnen Sie das Experiment, indem Sie mit dem Detektorkanal die anfängliche Fluoreszenz unter kontinuierlichem Scannen abbilden, um die Laserleistung und den Detektorgewinn für eine optimale Bildqualität einzustellen.

Danach aktivieren Sie den Photo-Konvertierungs-Kanal und wählen Sie eine niedrige Laserleistung. Beginnen Sie mit der Aufnahme einer Zeitrafferserie und erhöhen Sie schrittweise die Leistung des Photo-Konvertierungs-Lasers, bis eine signifikante Ausbleichung der ursprünglichen Fluoreszenz beobachtet wird. Setzen Sie das Scannen fort, bis die ursprüngliche Fluoreszenz etwa zu 75 % ausgeblichen ist.

Als Nächstes deaktivieren Sie den Photo-Konvertierungs-Kanal und aktivieren den Detektionskanal für die photo-konvertierte Fluoreszenz. Beginnen Sie die Aufnahme mit einer hohen Detektorverstärkung und geringer Laserleistung. Erhöhen Sie dann schrittweise die Laserleistung, bis die photo-konvertierte Fluoreszenz detektiert wird.

Stellen Sie nach dem Erkennen die Laserleistung sowie die Detektion oder Verstärkung für eine optimale Bildqualität ein. Optimieren Sie abschließend die zum Fotoumwandeln verwendete Laserleistung sowie deren Dauer. Eine Erhöhung der Laserleistung beschleunigt die Rate der Fotoumwandlung.

Jedoch führt zu hohe Laserleistung zur Photobleiche des Proteins. Sobald die optimale photochemische Umwandlung, Laserleistung und Dauer bestimmt wurden, können diese Parameter zur Konfiguration eines standardmäßigen Photobleichmoduls oder eines Fluoreszenz-Wiederherstellungs-nach-Photobleiche-Moduls verwendet werden. Danach wird der Kanal für die photochemische Umwandlung aufgrund der Redshift-Spektraleigenschaften von M orange two nicht mehr benötigt.

Es kann in Kombination mit dem grünen, lichtschaltbaren fluoreszierenden Protein dPUP für eine optische Markierung mit zwei Sonden verwendet werden. Beginnen Sie mit der optischen Markierung mittels zweier Sonden, indem Sie Hela-Zellen in Glasboden-Mat-Tech-Schalen kultivieren und die Zellen 24 Stunden vor der Bildgebung mithilfe einer Standard-LIPECTOMY-2000-Transfektion mit Plasmiden transfectieren, die die fluoreszierenden Proteine kodieren.

Platzieren Sie die lebenden Zellen auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop und richten Sie das Mikroskop wie zuvor beschrieben für die M-Orange-Zwei-Photonen-Umwandlung ein. Konfigurieren Sie anschließend das Mikroskop für die DPA-Photoschaltung. DPA wird mit 488 Nanometer Licht angeregt und seine Fluoreszenz kann unter Verwendung des M-Orange-Zwei-Photonen-Umwandlungs-Kanals abgebildet werden.

Stellen Sie sicher, dass die zum Abbilden von MPA verwendete Laserleistung minimiert wird, da eine zu hohe Laserleistung die Inaktivierung von mpa verursacht. Fügen Sie einen Kanal für die MPA-Photoaktivierung unter Verwendung von 800 Nanometer Zwei-Photonen-Anregung hinzu und bestimmen Sie anschließend die für die Bildgebung erforderliche Laserleistung für Photoaktivierung und Photoinaktivierung der OFA-Fluoreszenz.

Einer der schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens besteht darin, RPA zu inaktivieren, ohne M orange photochemisch umzuwandeln, da beide Ereignisse bei derselben Wellenlänge stattfinden. Um dies zu verhindern, ist es äußerst wichtig, die photochemische Umwandlung sorgfältig zu optimieren.

Laserleistung und -dauer: Vorsicht ist geboten, da eine Photo-Umwandlung von M orange zwei sowie eine Inaktivierung von PU beide bei Anregung mit 488 Nanometer Licht auftreten können. Verwenden Sie eine niedrigere Laserleistung, sobald die Parameter für die Photo-Umwandlung von M orange zwei und den DPA-Photoschaltvorgang festgelegt sind.

Durch eine Doppelsonden-Optik kann eine optische Hervorhebung erzielt werden. Zunächst wird die DPA-Fluoreszenz im gesamten Sichtfeld durch schwache 488-Nanometer-Anregung deaktiviert. Anschließend wird ein interessierender Bereich ausgewählt und mOrange2 durch intensive 488-Nanometer-Anregung umgewandelt.

Schließlich einen interessierenden Bereich auswählen und die DPA-Fluoreszenz mittels 800 Nanometer Zwei-Photonen-Anregung aktivieren. Proben von fluoreszierenden Proteintropfen eignen sich besonders gut für die Einrichtung von Photo-Konvertierungsanwendungen an konfokalen Mikroskopen. Wenn die Tropfenprobe korrekt vorbereitet ist, erscheinen die Tropfen sehr homogen.

Wenn die Probe jedoch ohne Beschichtung des Mikroskopobjektträgers mit einem Deckglas präpariert wird, neigen die Tröpfchen in den präparierten Proben dazu, gegen eine der Glasoberflächen gequetscht zu werden. In Abwesenheit von 0,1 % BSA neigt das fluoreszierende Protein dazu, sich an der oktalen Wasser-Grenzfläche anzusammeln. Die Erzeugung eines fluoreszenten Halo durch photochemische Umwandlung hängt entscheidend von der Laserleistung und der Belichtungsdauer ab.

Zu hohe Laserleistung oder zu lange Belichtung führt zu Photobleichen und bewirkt eine Verringerung der photochemisch umgewandelten roten Fluoreszenz. Die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften von M orange zwei und PHO erlauben eine optische Markierung mit zwei Sonden vor der photochemischen Umwandlung. Zellen, die M orange zwei, Histon H zwei B und DPA mito exprimieren, zeigen orange Fluoreszenz im Zellkern und grüne Fluoreszenz in den Mitochondrien. Wenn die gesamte Fluoreszenz mit niederer Leistung bei 488 Nanometer-Anregung ausgeschaltet wird, tritt eine minimale photochemische Umwandlung von M orange auf.

Zwei M Orange zwei können anschließend mit intensiver 488-Nanometer-Anregung in Rot photokonvertiert werden. Sobald M Orange zwei photokonvertiert wurde, kann die Fluoreszenz des gezeichneten Puffs mit 800-Nanometer-Zwei-Photonen-Anregung wieder eingeschaltet werden. Mit der dualen Sonde zur optischen Markierung können Zellen auf vier verschiedene Arten markiert werden.

Mithilfe dieser Technik ist es möglich, vier verschiedene Zellpopulationen gezielt zu markieren. Wie Sie gesehen haben, gehört die Inaktivierung von MPA, ohne mOrange photochemisch umzuwandeln, zu den schwierigsten Aspekten dieses Verfahrens. Sobald diese Beherrschung erreicht ist, können mit diesem System weitere Experimente durchgeführt werden, beispielsweise die Verfolgung mehrerer Populationen in pankreatischen Beta-Zellen.

Das war's. Ich hoffe, diese Präsentation war für Sie hilfreich, und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.