Name: Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung von Ca²⁺-Signalen in menschlichen Spermien mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Analyse dynamischer Calciumantworten auf Stimuli.

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Diese Arbeit wird durch den Wellcome Trust, The Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City und die Unfruchtbarkeit Research Trust finanziert. Wir möchten die fachkundige Unterstützung von Cairn Research in den Bau und die Integration der Imaging-Rigs bestätigen.

Sperma von gesunden fruchtbaren Männchen, mit einem normalen Spermiogramm, sind in der Regel für die Bildgebung wie folgt hergestellt. <ol><li> Semen Proben werden bei 37 ° C nicht länger als 30 min gespeichert. 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4: mM; Zellen werden aus der Samenflüssigkeit von Swim-up in ergänzt balanced salt Earle-Lösung (sEBSS isoliert. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-Glucose, 2,73 Na-Pyruvat, 41,8 Na-Lactat) mit 0,3% Holzkohle de-lipidated/fatty säurefrei Fraction V BSA (Qualität der BSA ist Voraussetzung für erfolgreiche Kapazitation der Spermien) ergänzt. 1 ml der sEBBS ist in jedem der eine Reihe von 5 ml pipettiert und vorsichtig mit 0,3 ml des Samens underlayered. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde (37 ° C, 6% CO 2) der oberen 0,7 ml wird sanft aus jedem Rohr entfernt und gepoolt. 10 ul der Spermien-Suspension mit 90 ul 1% (v / v) Formalin, um die Zellen zu immobilisieren verdünnt wird, dann Spermien werden in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zelldichte in der Suspension wird dann angepasst (mit sEBSS) bis 6 Millionen Zellen / ml. </li><li> In für 5-6 h auf Kapazitation zu ermöglichen.; Die Probe wird dann in Aliquots von 200 ul in locker-Röhrchen mit und inkubiert (6% CO 2 37 ° C) unterteilt </li><li> Deckgläser (22X50 mm) haben zuvor mit Poly-D-Lysin behandelt worden. 10 ul der Poly-D-Lysin-Lösung (10% w / v) wird als eine Reihe von kleinen Tropfen in die Mitte des Deckglases aufgetragen. Die Poly-D-Lysin wird dann an der Luft getrocknet. Dies kann auf einem beheizten Bühne zu stehen und sollte bis zur vollständigen Trockne. . Ähnlich wie die Warner RC20 Kammer Die Poly-D-Lysin, einem Deckglas wird mit Vakuum-Fett auf einem geschlossenen, für diesen Zweck gebaut, perfundierbaren, Polycarbonat Bildgebung Kammer (Kapazität ≈ 180 ul Abmessungen 35 mm x 20 mm x 5 mm) befestigt beschichteten Deckglas bildet die Basis der Kammer, wenn die Zellen auf einem inversen Mikroskop betrachtet und ein 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckglas bildet die Oberseite der Kammer, so dass Lichtdurchlässigkeit. </li><li> Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) oder Calcium Green 1-AM für die Markierung von Zellen eingesetzt. OGB wird durch Lösen in DMSO. Pluronic F127 Säure (ein Waschmittel) ist in der DMSO aufgenommen, um "Verklumpung" des Farbstoffes zu verhindern. Dies kann im Labor (100 mg Pluronic in 0,5 ml DMSO) hergestellt werden, unmittelbar vor dem Gebrauch oder kann bestellt vorbereitete werden. 20 pl ist es, eine 50 ug Aliquot OGB (2,5 mg / ml) aufgenommen. Das Fläschchen kann dann gespeichert werden eingefroren und wieder aufgetaut für den späteren Gebrauch werden. </li><li> Nach Kapazitation der Spermien (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% CO 2) ein Rohr für die Bildgebung und 1,2 ul der OGB-Lösung ausgewählt wird, wird hinzugefügt, was zu einer Endkonzentration von 10 uM. Das Rohr wird dann für weitere 40 min inkubiert, wonach die Zellsuspension vorsichtig in die Einströmöffnung der Bildgebung Kammer mit einem p1000 (blau) Pipettenspitze injiziert. Die Kammer ist in den Inkubator, Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas nach unten, für 20 min gestellt. Zellen neigen dazu, entlang der Oberflächen der Kammer schwimmen und wird dem Poly-D-Lysin-beschichtete Fläche haften. </li><li> Die Kammer ist nun auf dem Mikroskop montiert, angeschlossen an die Perfusionsapparatur und perfundierten mit ca. 0,5 ml / min. Eine Walze Pumpe fördert Kochsalzlösung in die Kammer-und Überlauf von der Ausfahrt Port durch eine Saugpumpe mit trap wird entfernt. Die Zubereitung ist im Dunkeln für mindestens 10 min nach links, während lose Zellen und extrazellulären Farbstoff durch Perfusion der Kammer entfernt werden. Temperaturbeständigkeit ist von entscheidender Bedeutung, weil kleine Schwankungen können nicht nur die Ca 2 +-Homöostase, sondern kann auch Auswirkungen auf K d des Farbstoffs. Experimente sind in der Regel bei 25 ° C, erreicht, indem die Temperatur der dunklen Raum auf dieser Ebene. Wir haben festgestellt, dass die Aufrechterhaltung Raumtemperatur auf dem erforderlichen Niveau bietet größere Temperatur und Konzentration Stabilität als mit einer Temperatur gesteuert Bühne oder eine thermostatisch gesteuerte Heizung auf der Saline Zufluss. </li><li> Die Zellen werden unter Phasenkontrast (40x oder 60x Öl-Immersion) Ziel und einen Bereich für die Bildgebung gewählt wird angezeigt. Der Anteil der Poly-D-Lysin beschichtete Fläche, die in der Nähe der Einlassöffnung ist bevorzugt, wobei Kochsalzlösung Strömung laminar und konsequent. Es ist auch wichtig, um ein Gebiet, wo Zelldichte angemessene Verwendung (zu hohe Dichte wirkt sich auf die Qualität und Integrität der Daten durch Abholung des Signals von benachbarten Zellen) und in denen Zellen ausreichend befestigt, sondern Flagellen Aktivität erkennbar ist. Ein Phasenkontrast-Bild wird gespeichert. Und Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um eine klare Fluoreszenzbild (in der Regel 50-200 ms) zu erhalten reduziert wird; Das Mikroskop wird dann zur Fluoreszenz-Modus (Emission 540 nm Anregung 480 nm) eingeschaltet. </li><li> Das Experiment wird durch die Aktivierung der Zeitreihen-Bildaufnahme-Software (IQ) gestartet. Typischerweise Bilder bei 0,1 Hz erfasst und Beleuchtung ist es, die Zeit der Bildaufnahme nur eingeschränkt mit Hilfe eines Software gesteuertem Verschluss. Viel größer Bildaufnahmeraten kann verwendet werden, aber Zulage muss für Probleme der Bleiche und der Erzeugung von Artefakten durch Foto-Schäden an den Zellen (siehe Diskussion) vorgenommen werden. IQ (und die meisten anderen Akquisition Software-Plattformen) werden in Echtzeit grafische Darstellung der Fluoreszenz während des Experiments zu ermöglichen. </li><li> Nach einer Kontrolle Zeitraum von 3-5 Minuten Dauer Manipulation von Kochsalzlösung Bestandteile (z. B. [Ca 2 +] o) und Applikation von Medikamenten wird durch Ersatz von Kochsalz in der Perfusion Header erreicht. Zeitpunkt der Zugabe der einzelnen Stimulus wird darauf hingewiesen, so dass die Zeit der Ankunft in der Imaging-Kammer berechnet werden kann, eine ausreichende Genauigkeit für die Beurteilung der langsamen Reaktionen hier beschriebene (abgetastet bei 0,1 Hz). Für weitere schnelle Reaktionen eine höhere Genauigkeit kann durch Zugabe von Stimuli direkt an der Saline durch eine zweite Einströmöffnung wie in der Warner RC20 Kammer vorgesehen erreicht werden. </li><li> Die Bilder werden analysiert offline mit IQ. Regions of Interest (ROI) sind rund jeder Zelle (oder einen Teil der Zelle) gezogen und auch eine Zelle frei ist angewählt (für die automatische Subtraktion des Hintergrundes durch die Software. Die Bildserie wird dann überprüft werden, um Zellen, die starben oder unterzog Akrosomreaktion zu entfernen ( die erscheint als eine starke und rasche Zunahme der Fluoreszenz durch den Verlust der zytoplasmatischen Farbstoff) während des Experiments und diejenigen, die ausreichende Bewegung, um Artefakte zu verursachen, wenn sie als Zeitreihen analysiert zeigte gefolgt. </li><li> Eine Zeit-Fluoreszenzintensität Serie wird dann für jede ROI erzielt und diese Daten werden in Excel analysiert offline. Zunächst Fluoreszenz wird auf den Mittelwert während der Kontrollperiode erhalten normalisiert, mit der Gleichung R = [(FF rest) / F Rest] x 100%, wobei R% Veränderung der Fluoreszenz ist im Vergleich zur Kontrollgruppe Zeit, F ist Fluoreszenzintensität zu einem Zeitpunkt t und F Rest ist der Mittelwert von mindestens 30 Bestimmungen des F während der Kontrollperiode erhalten. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt eine Serie von Bildern aus einem Experiment, in dem die Zellen mit 3 uM Progesteron stimuliert wurden. Die obere Zeile und Film 1 zeigen die Fluoreszenz-Bildern in Graustufen-und derselben Magier sind unten (und in Film 2) in Falschfarben dargestellt (Lookup-Tabelle '16_colors "in Image J), ​​wo 'cool' Farben niedrige Fluoreszenzintensität zeigen und 'warm' Farben zeigen hohe Fluoreszenzintensität. Die Zellen können in Falschfarben während des Experiments betrachtet werden, mit Lookup-Tabellen in IQ, sondern mit Graustufen ist in der Regel aussagekräftiger für die Bewertung. Ob die Zellen gut beschriftet sind. Die ersten beiden Bilder wurden bei 0 s und 100 s nach Beginn der Aufzeichnung gesammelt. Fluoreszenz sollte stabil und neigt dazu, am stärksten in der post akrosomalen Bereich und Spermien Hals. Progesteron in die Bildgebung Kammer bei ca. 175 s und die 3. und 4. Bilder (180 s und 220 s) zeigt einen raschen Anstieg der [Ca 2 +] i (Fluoreszenz) mit Ursprung in den hinteren Kopf-und Halsregion der Zelle. Nachfolgende Bilder sind bei 290, 360, 740, 990 und 1440 s, zeigt den Verfall der ursprünglichen [Ca 2 +] i transient und Entwicklung einer sekundären anhaltende Erhöhung. Abbildung 2 zeigt eine Tabellenkalkulation, Umwandlung von Roh-Fluoreszenz-Werte für jede ROI zu normalisierten Fluoreszenz (% Veränderung der Fluoreszenz im Vergleich zur Kontrollgruppe Periode) Abbildung 3 zeigt die Zeit-normalisierte Fluoreszenz Parzellen für 3 Zellen zeigen "typische" Reaktionen auf 3 uM Progesteron. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Beispiel Daten aus einer Zelle mit Progesteron stimuliert. Eine Reihe von Fluoreszenz-Bildern in Graustufen (obere Reihe) und Falschfarbendarstellung (untere Reihe) gezeigt werden. Zeitpunkten 0, 180, 220, 290, 360 und 990er. 3 uM Progesteron in die Bildgebung Kammer bei 175 s. ROIs sind in der ersten Tafel dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Analyse der einzelnen Zelle Fluoreszenz-Daten in Excel. Die Zahlen in schwarz sind Zeitreihen von Fluoreszenz-Daten, vertikal angeordnet. Die Zahlen in rot (unten) sind normalisierten Daten unter Verwendung der Gleichung im Text angegeben. Graph zeigt normalisierte Fluoreszenz-Zeit-Diagramm für die Zelle 64 in diesem Experiment, das nach Stimulation zeigt einen vorübergehenden Anstieg der Fluoreszenz, die durch einen langsamen Anstieg und eine Reihe von kleinen Schwingungen folgen. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Fluoreszenz-time Spuren für 3 einzelne Zellen, wie Veränderung in% in Bezug auf Wert-Regelung zum Ausdruck gebracht .. 3 uM Progesteron war zu der Zeit durch den Pfeil markiert aufgenommen. Eine gestrichelte Linie zeigt die mittlere Kontrolle Fluoreszenz.

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

Als erfolgreich durchgeführt, ermöglicht diese Technik die Aufnahme des Vertriebs und der Kinetik der spontanen und induzierten Ca 2 +-Signale in menschlichen Spermien. Die Antworten können aus einer großen Anzahl von Zellen (bis 200), die wichtig ist, da menschliche Spermien können eine Menge von Variationen in ihre spontane und stimulierte Ca 2 +-Signale zeigen, gewonnen werden. Erfolgreiche Kennzeichnung und Überleben der Zellen während der Aufnahme sind hochgradig abhängig von Sample-Qualität. Schlechte Beispiele gibt schlechte Kennzeichnung, schlechte Antworten und Zellen können während der Aufnahme sterben. Menschliche Spermien sind sehr empfindlich auf Foto-Schäden und wir daher den minimal erforderlichen Beleuchtung (sowohl Intensität und Belichtungszeit), um das Überleben der Zelle zu maximieren und minimieren Artefakte durch Zelltod. Eine hochempfindliche Kamera (erlaubt Einsatz von Low-Intensity-Beleuchtung) ist ein großer Vorteil, da die Kamera holt schwache Fluoreszenz. Back-beleuchteten, sind EM-CCD-Kameras besonders gut geeignet, wenn auch sehr teuer. LED-Beleuchtung (anstelle der Verwendung einer Xenon-oder Quecksilber-Lampe mit Anregungsfilter verbessert auch das Überleben der Zelle (Nishigaki et al, 2006). Wir verwenden keine Fura-2, trotz der offensichtlichen Vorteile von ratio-metrischen Bildgebung, da Fura erfordert Anregung mit UV-Licht und weil es notwendig, zwei Bilder für jedes Verhältnis zu nehmen. Für Daten mit einer Wellenlänge, sichtbares Licht Farbstoffe, die Normalisierung der Fluoreszenz-Intensität weitgehend kompensiert Unterschied in der Farbstoff-Laden zwischen den Zellen, nicht aber für Farbverteilung innerhalb einer einzelnen Zelle, und dies muss berücksichtigt werden, erhalten. Obwohl einzelne Wellenlänge Farbstoffe können im Prinzip kalibriert werden, ist die Genauigkeit des Verfahrens Armen und wir versuchen nicht, dies zu tun. Während das Verhältnis von Daten mit Fura-2 (oder die Emission Verhältnis Farbstoff Indo) erhalten, auch ohne Kalibrierung, geben einen akzeptablen getreue Darstellung der relativen Veränderungen in [Ca 2 +] i, ist die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Wellenlängen Farbstoffe weit von linear bezogen auf [Ca 2 +] i. In den nützlichsten Teil der Sättigungskurve die Beziehung zur einzigen Wellenlänge Farbstoffe in der Regel nähert sich logarithmisch. Wir verwenden derzeit Oregon Green BAPTA-1 (Abbildung 4), weil sie empfindlich auf kleine Änderungen in ist [Ca 2 +] i in der Nähe von Ruhepegel s (50-100 nM). Wenn [Ca 2 +] i steigt über 1 uM Reaktionen werden in Bezug auf die Fluoreszenz-Änderung und der Farbstoff unterrepräsentiert kann zu sättigen. Eine Option für die Verbesserung der Technik, ohne auf UV-Anregung ist Wägezellen mit einem Farbstoff wie Fluo-3 und Fura roten Doppeldecker. Beides kann bei 488 nm angeregt werden, aber gleichzeitig ihre Reaktionen sind sehr unterschiedlich. Aufzeichnung der Emission bei 540 und 650 nm liefert ein Verhältnis, das eine bessere Methode für die genaue Überwachung der liefern kann [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) und kann für Spermien (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Beziehung zwischen freien [Ca 2 +] (nM) und Fluoreszenz-Emission bei Peakwellenlänge (ca. 525 nm) für Oregon Green BAPTA-1 und Oregon Green BAPTA-2. OGB1 ergibt eine höhere Fluoreszenz bei ruhenden [Ca 2 +], sondern sättigt auf den unteren Ebenen und hat somit eine geringere nutzbare Bandbreite. Die Daten für diese Grundstücke wurden von der Molecular Probes Handbuch (Haughland, 2002) erhalten.

<table><tbody><tr><td>Kamera mit niedriger Lichtempfindlichkeit</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Software im öffentlichen Bereich</td></tr><tr><td>LED-Beleuchtungssystem</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20 %ige Lösung in DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for imaging ca 2 + signaling in menschlichen spermien

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluoreszenz-Mikroskopie von Zellen mit fluoreszierenden, Ca geladen<sup&gt; 2 +</sup&gt; Farbstoffe für die Messung von räumlichen und zeitlichen Aspekte der Ca verwendet<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalisierung in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir die Methode in unseren Labors verwendet zum Laden Suspensionen von menschlichen Spermien mit Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Berichterstattung Farbstoffe und Messung der Fluoreszenz-Signal während der physiologischen Stimulation. Bewegliche Zellen werden durch direkte Swim-up isoliert und inkubiert unter capacitating Bedingungen für 0-24 h, je nach dem Experiment. Die Zell-Permeationsmittel AM (Acetoxy-Methylester) ester Form des Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Berichterstattung Farbstoff wird dann in eine Zelle Aliquot und einen Zeitraum von 1 h zum Laden des Farbstoffes in das Zytoplasma darf hinzugefügt. Wir verwenden sichtbaren Wellenlängenbereich Farbstoffe Foto-Schäden an den Zellen gering zu halten, aber dies bedeutet, dass ratiometrische Aufnahme nicht möglich ist. Vor-und Nachteile dieses Ansatzes werden diskutiert. Während der Ladezeit Zellen werden in einem bildgebenden Kammer eingeführt und lässt auf ein Poly-D-Lysin beschichteten Deckglas haften. Am Ende der Ladezeit überschüssiger Farbstoff und lose Zellen werden durch Verbindung der Kammer an die Perfusionsapparatur entfernt. Die Kammer wird kontinuierlich perfundierten, sind Reize und modifiziert Salinen dann auf die Perfusion-Header hinzugefügt. Die Experimente werden durch Zeitraffer-Übernahme von Fluoreszenz-Bildern erfasst und analysiert im Detail offline, durch manuelles Zeichnen regions of interest. Die Daten werden vor Stimulus Ebenen, so dass für jede Zelle (oder ein Teil einer Zelle), eine Grafik der Ca zeigt normalisierte<sup&gt; 2 +</sup&gt; Antwort in% Veränderung der Fluoreszenz erreicht ist.

Stimulus-evozierte [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I-Signale der einzelnen menschlichen Spermien beurteilt. Bewegliche Zellen mit Ca geladen<sup&gt; 2 +</sup&gt; Fluoreszenzfarbstoff (AM-Ester-Methode) und immobilisiert in einem perfundierbaren Kammer. Die Zellen werden durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und stimuliert über die Perfusion Medium. Responses von einzelnen Zellen (oder Regionen) sind offline analysiert mit Hilfe von Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Die Fluoreszenzmikroskopie von Zellen, die mit fluoreszierenden, Ca²⁺-sensitiven Farbstoffen beladen sind, wird zur Messung räumlicher und zeitlicher Aspekte der Ca²⁺-Signalisierung in ... eingesetzt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Bildserien von immobilisierten menschlichen Spermien zu erhalten, die mit einem fluoreszierenden Kalziumreporterfarbstoff markiert wurden. Zunächst werden bewegliche Zellen durch Aufschwimmen in ein Inkubationsmedium von der Samenflüssigkeit getrennt. Nach der Kapazitation werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator markiert und anschließend in eine schmelzbare Abbildungskammer überführt, die auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop befestigt ist.Die Konzentrationsänderungen von Calciumionen werden als Zeitrafferserie aufgezeichnet und analysiert, um die Antworten einzelner Zellen zu extrahieren. Hallo, ich bin Edwin Andres Morales Garcia aus dem Labor von Dr. Steven J. Public Cova an der School of Biosciences der University of Birmingham im Vereinigten Königreich. Ich bin Katherine Nash, ebenfalls aus dem Public Overlap.Und ich bin Jennifer Morris vom Public Overlap. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Abbildung intrazellulärer Kalziumantworten in einzelnen menschlichen Spermien. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Regulation von Spermienaktivitäten mittels von der Eizelle und dem weiblichen Trakt abgeleiteter Stimuli zu untersuchen.Beginnen wir nun. Lagern Sie Samenproben ab dem Zeitpunkt der Sammlung nicht länger als 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie ein Milliliter der L'S-Pufferlösung mit Salzen, ergänzt mit 0,3 % BSA (abgekürzt als S-E-B-S-S), in eine Reihe von fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodentuben. Unterlaufen Sie vorsichtig das S-E-B-S-S in jeder Tube mit 0,3 Millilitern Samenflüssigkeit und verschließen Sie die Tube locker.Inkubieren Sie die Röhrchen im Winkel von 45 Grad eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Um beweglichen Zellen zu ermöglichen, in das S-E-B-S-S aufzuschwimmen, pipettieren Sie vorsichtig die oberen 0,7 Milliliter der Lösung ab und ziehen Sie die Lösung aus allen Röhrchen in ein sauberes 15-Milliliter-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen. Schütteln Sie vorsichtig, um die Zellen zu mischen, und zählen Sie die mit Formalin immobilisierten Zellen in einer neuen Zählkammer.Stellen Sie die Konzentration auf 6 Millionen Zellen pro Milliliter in S-E-B-S-S ein und portionieren Sie das Sperma in 200-Mikroliter-Aliquote in 5-Milliliter-Polystyrol-Rundbodentuben. Verschließen Sie die Tuben locker. Wenn die Reaktion kapazitierter Zellen untersucht wird, inkubieren Sie die Tuben fünf bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid, um die Kapazitation zu ermöglichen. Geben Sie 10 Mikroliter einer 10 %igen Polylysin-Lösung als mehrere kleine Tropfen in die Mitte eines 22 mal 50 Millimeter großen Objektträgers.Deckglas Nummer eins beschriften und vollständig trocknen lassen. Mit Vakuumfett das Deckglas mit der behandelten Seite nach oben an eine fusible Abbildungskammer befestigen. Zu diesem Zweck.Wählen Sie für jedes Bildgebungs-Experiment ein einzelnes Röhrchen mit kapazitierten Zellen aus und geben Sie 1,2 Mikroliter einer 2,5 Milligramm pro Milliliter-Lösung von calciumabhängiger Organ Green, gelöst in DMSO, hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar zu erreichen. Inkubieren Sie das Röhrchen 40 Minuten bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid.Entfernen Sie mithilfe einer 200-Mikroliter-Pepto mit einer P-200-Spitze die gesamte Lösung vollständig aus dem Röhrchen. Füllen Sie die Kammer, indem Sie vorsichtig in den Zuflussstutzen injizieren. Kippen Sie die Kammer, damit Blasen über den Ausfluss entweichen können.Stellen Sie die gesamte Kammer in den Inkubator und inkubieren Sie sie weitere 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Um die Spermien an das Poly-D-Lysin binden zu lassen. Befestigen Sie die Kammer am inversierten Fluoreszenzmikroskop und schließen Sie sie an die Perfusionsapparatur an.Lassen Sie die Vorbereitung mindestens 10 Minuten im Dunkeln, damit die Perfusion abfließen kann. Lockere Zellen und extrazelluläre Substanzen unter Phasenkontrast bei 40x- oder 60x-Vergrößerung; wählen Sie ein Sichtfeld, in dem der Zellabstand ausreichend groß ist, um die Fluoreszenz jeder einzelnen Zelle separat beurteilen zu können. Die Zellen sollten ausreichend angeheftet sein, vorzugsweise jedoch deutliche Flimmerbewegungen zeigen.Schalten Sie das Mikroskop auf den grün fluoreszierenden Kanal. Halten Sie die Belichtungszeiten auf das Minimum, das für ein klares Fluoreszenzbild erforderlich ist, um die Photobleiche in der IQ-Software zu reduzieren.Aktivieren Sie die zeitaufgelöste Bildaufnahme. Nehmen Sie Bilder mit 0,1 Hertz auf und verwenden Sie einen softwaregesteuerten Verschluss, um die Beleuchtung zu begrenzen. Nehmen Sie zunächst drei bis fünf Minuten lang eine Kontrollphase auf, verändern Sie dann die Kalziumkonzentration des Puffers und applizieren Sie Wirkstoffe, indem Sie den Puffer am Eingang des Perfusionsystems wechseln.Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem jeder Reiz dem Header hinzugefügt wird, und berechnen Sie die Ankunftszeit im Kammerinneren, wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben. Zur Offline-Analyse der Bilder verwenden Sie eines der Zeichenwerkzeuge, um einen interessierenden Bereich oder ROI um jede Zelle beziehungsweise einen Zellteil – hier den hinteren Spermakopf, da gespeicherter Kalzium in diesem Bereich mobilisiert wird – zu zeichnen. Blättern Sie mit der Schiebeleiste, um die Bildserie zu überprüfen.Identifizieren und entfernen Sie Zellen, die nicht vollständig innerhalb der ROI verbleiben, andere Zellen überlappen oder einen starken und schnellen Anstieg gefolgt von einem starken Abfall der Fluoreszenzintensität gezeigt haben, der charakteristisch für Zelltod ist. Verwenden Sie die Analysefunktion, um eine Zeit-Fluoreszenzintensitätsreihe für jede ROI zu generieren. Die Daten können anschließend exportiert und in einer Tabellenkalkulation analysiert werden.Diese Bilder stammen aus einer Serie, die während der Stimulation mit drei Mikromolar Progesteron aufgenommen wurde. Die untere Reihe wurde mit Pseudofarben überlagert. Um relative Intensitätsänderungen besser zu veranschaulichen, trat Progesteron hier in die Kammer ein. Hier.Diese Ergebnisse werden in einem Zeitraffervideo animiert. Beachten Sie den schnellen Anstieg der Fluoreszenzintensität, gefolgt von einem langsamen Anstieg, der entsprechende Änderungen der intrazellulären Kalziumspiegel anzeigt. Diese Daten werden hier aus den durchschnittlichen Intensitäten des hinteren Kopfbereichs von drei Zellen quantifiziert.Es wurden drei Mikromolar Progesteron zum Zeitpunkt, der durch den Pfeil markiert ist, hinzugefügt. Die gestrichelte Linie zeigt die durchschnittliche Kontrollfluoreszenz. Heute haben wir Ihnen gezeigt, wie man Zellen von guter Qualität isoliert, sie mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff belädt und die Reaktion einzelner Zellen auf eine Stimulation überwacht.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die bestmögliche Zellpopulation zu verwenden, die Beleuchtung der Zellen zu minimieren, um photoinduzierte Schäden zu vermeiden, und den Farbstoff auszuwählen, der am besten für die beobachteten Reaktionen geeignet ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Biologie

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