Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien
16. Juni 2010
Stimulus-evozierte [Ca 2 +] I-Signale der einzelnen menschlichen Spermien beurteilt. Bewegliche Zellen mit Ca geladen 2 + Fluoreszenzfarbstoff (AM-Ester-Methode) und immobilisiert in einem perfundierbaren Kammer. Die Zellen werden durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und stimuliert über die Perfusion Medium. Responses von einzelnen Zellen (oder Regionen) sind offline analysiert mit Hilfe von Excel.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Bildserien von immobilisierten menschlichen Spermien zu erhalten, die mit einem fluoreszierenden Kalziumreporterfarbstoff markiert wurden. Zunächst werden bewegliche Zellen durch Aufschwimmen in ein Inkubationsmedium von der Samenflüssigkeit getrennt. Nach der Kapazitation werden die Zellen mit einem fluoreszierenden Kalziumindikator markiert und anschließend in eine schmelzbare Abbildungskammer überführt, die auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop befestigt ist.
Die Konzentrationsänderungen von Calciumionen werden als Zeitrafferserie aufgezeichnet und analysiert, um die Antworten einzelner Zellen zu extrahieren. Hallo, ich bin Edwin Andres Morales Garcia aus dem Labor von Dr. Steven J. Public Cova an der School of Biosciences der University of Birmingham im Vereinigten Königreich. Ich bin Katherine Nash, ebenfalls aus dem Public Overlap.
Und ich bin Jennifer Morris vom Public Overlap. Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Abbildung intrazellulärer Kalziumantworten in einzelnen menschlichen Spermien. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Regulation von Spermienaktivitäten mittels von der Eizelle und dem weiblichen Trakt abgeleiteter Stimuli zu untersuchen.
Beginnen wir nun. Lagern Sie Samenproben ab dem Zeitpunkt der Sammlung nicht länger als 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie ein Milliliter der L'S-Pufferlösung mit Salzen, ergänzt mit 0,3 % BSA (abgekürzt als S-E-B-S-S), in eine Reihe von fünf-Milliliter-Polystyrol-Rundbodentuben. Unterlaufen Sie vorsichtig das S-E-B-S-S in jeder Tube mit 0,3 Millilitern Samenflüssigkeit und verschließen Sie die Tube locker.
Inkubieren Sie die Röhrchen im Winkel von 45 Grad eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Um beweglichen Zellen zu ermöglichen, in das S-E-B-S-S aufzuschwimmen, pipettieren Sie vorsichtig die oberen 0,7 Milliliter der Lösung ab und ziehen Sie die Lösung aus allen Röhrchen in ein sauberes 15-Milliliter-Polystyrol-Zentrifugenröhrchen. Schütteln Sie vorsichtig, um die Zellen zu mischen, und zählen Sie die mit Formalin immobilisierten Zellen in einer neuen Zählkammer.
Stellen Sie die Konzentration auf 6 Millionen Zellen pro Milliliter in S-E-B-S-S ein und portionieren Sie das Sperma in 200-Mikroliter-Aliquote in 5-Milliliter-Polystyrol-Rundbodentuben. Verschließen Sie die Tuben locker. Wenn die Reaktion kapazitierter Zellen untersucht wird, inkubieren Sie die Tuben fünf bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid, um die Kapazitation zu ermöglichen. Geben Sie 10 Mikroliter einer 10 %igen Polylysin-Lösung als mehrere kleine Tropfen in die Mitte eines 22 mal 50 Millimeter großen Objektträgers.
Deckglas Nummer eins beschriften und vollständig trocknen lassen. Mit Vakuumfett das Deckglas mit der behandelten Seite nach oben an eine fusible Abbildungskammer befestigen. Zu diesem Zweck.
Wählen Sie für jedes Bildgebungs-Experiment ein einzelnes Röhrchen mit kapazitierten Zellen aus und geben Sie 1,2 Mikroliter einer 2,5 Milligramm pro Milliliter-Lösung von calciumabhängiger Organ Green, gelöst in DMSO, hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar zu erreichen. Inkubieren Sie das Röhrchen 40 Minuten bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid.
Entfernen Sie mithilfe einer 200-Mikroliter-Pepto mit einer P-200-Spitze die gesamte Lösung vollständig aus dem Röhrchen. Füllen Sie die Kammer, indem Sie vorsichtig in den Zuflussstutzen injizieren. Kippen Sie die Kammer, damit Blasen über den Ausfluss entweichen können.
Stellen Sie die gesamte Kammer in den Inkubator und inkubieren Sie sie weitere 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Um die Spermien an das Poly-D-Lysin binden zu lassen. Befestigen Sie die Kammer am inversierten Fluoreszenzmikroskop und schließen Sie sie an die Perfusionsapparatur an.
Lassen Sie die Vorbereitung mindestens 10 Minuten im Dunkeln, damit die Perfusion abfließen kann. Lockere Zellen und extrazelluläre Substanzen unter Phasenkontrast bei 40x- oder 60x-Vergrößerung; wählen Sie ein Sichtfeld, in dem der Zellabstand ausreichend groß ist, um die Fluoreszenz jeder einzelnen Zelle separat beurteilen zu können. Die Zellen sollten ausreichend angeheftet sein, vorzugsweise jedoch deutliche Flimmerbewegungen zeigen.
Schalten Sie das Mikroskop auf den grün fluoreszierenden Kanal. Halten Sie die Belichtungszeiten auf das Minimum, das für ein klares Fluoreszenzbild erforderlich ist, um die Photobleiche in der IQ-Software zu reduzieren.
Aktivieren Sie die zeitaufgelöste Bildaufnahme. Nehmen Sie Bilder mit 0,1 Hertz auf und verwenden Sie einen softwaregesteuerten Verschluss, um die Beleuchtung zu begrenzen. Nehmen Sie zunächst drei bis fünf Minuten lang eine Kontrollphase auf, verändern Sie dann die Kalziumkonzentration des Puffers und applizieren Sie Wirkstoffe, indem Sie den Puffer am Eingang des Perfusionsystems wechseln.
Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem jeder Reiz dem Header hinzugefügt wird, und berechnen Sie die Ankunftszeit im Kammerinneren, wie im schriftlichen Teil dieses Protokolls beschrieben. Zur Offline-Analyse der Bilder verwenden Sie eines der Zeichenwerkzeuge, um einen interessierenden Bereich oder ROI um jede Zelle beziehungsweise einen Zellteil – hier den hinteren Spermakopf, da gespeicherter Kalzium in diesem Bereich mobilisiert wird – zu zeichnen. Blättern Sie mit der Schiebeleiste, um die Bildserie zu überprüfen.
Identifizieren und entfernen Sie Zellen, die nicht vollständig innerhalb der ROI verbleiben, andere Zellen überlappen oder einen starken und schnellen Anstieg gefolgt von einem starken Abfall der Fluoreszenzintensität gezeigt haben, der charakteristisch für Zelltod ist. Verwenden Sie die Analysefunktion, um eine Zeit-Fluoreszenzintensitätsreihe für jede ROI zu generieren. Die Daten können anschließend exportiert und in einer Tabellenkalkulation analysiert werden.
Diese Bilder stammen aus einer Serie, die während der Stimulation mit drei Mikromolar Progesteron aufgenommen wurde. Die untere Reihe wurde mit Pseudofarben überlagert. Um relative Intensitätsänderungen besser zu veranschaulichen, trat Progesteron hier in die Kammer ein. Hier.
Diese Ergebnisse werden in einem Zeitraffervideo animiert. Beachten Sie den schnellen Anstieg der Fluoreszenzintensität, gefolgt von einem langsamen Anstieg, der entsprechende Änderungen der intrazellulären Kalziumspiegel anzeigt. Diese Daten werden hier aus den durchschnittlichen Intensitäten des hinteren Kopfbereichs von drei Zellen quantifiziert.
Es wurden drei Mikromolar Progesteron zum Zeitpunkt, der durch den Pfeil markiert ist, hinzugefügt. Die gestrichelte Linie zeigt die durchschnittliche Kontrollfluoreszenz. Heute haben wir Ihnen gezeigt, wie man Zellen von guter Qualität isoliert, sie mit einem kalziumempfindlichen Farbstoff belädt und die Reaktion einzelner Zellen auf eine Stimulation überwacht.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die bestmögliche Zellpopulation zu verwenden, die Beleuchtung der Zellen zu minimieren, um photoinduzierte Schäden zu vermeiden, und den Farbstoff auszuwählen, der am besten für die beobachteten Reaktionen geeignet ist. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
Diese Studie bewertet stimulierte Kalziumionenkonzentrationssignale in einzelnen menschlichen Spermien mittels zeitraffenden Fluoreszenzmikroskopie. Die beweglichen Spermienzellen werden mit einem kalziumempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff beladen und zur Bildgebung und Analyse immobilisiert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Reproduktionsbiologie
Hintergrund
- Die Kalziumsignalübertragung spielt eine entscheidende Rolle bei der Spermienfunktion und der Befruchtung.
- Das Verständnis der Kalziumdynamik kann Einblicke in die Regulation und Aktivität von Spermien liefern.
- Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig verwendet, um intrazelluläre Kalziumspiegel sichtbar zu machen.
- Mittels Zeitrafferaufnahmen lassen sich dynamische zelluläre Reaktionen beobachten.
Zweck der Studie
- Gewinnung beweglicher menschlicher Spermien und Untersuchung ihrer Kalziumantworten auf Stimuli.
- Entwicklung einer Methode zur Abbildung und Analyse der Kalziumdynamik in einzelnen Spermienzellen.
- Verbesserung des Verständnisses über das Verhalten von Spermien als Reaktion auf eizellabgeleitete Stimuli.
Verwendete Methoden
- Isolierung beweglicher Spermien aus dem Samenplasma mittels Swim-up-Technik.
- Laden der Spermien mit einem kalziumsensitiven fluoreszierenden Farbstoff.
- Immobilisierung der Spermien in einer durchströmbaren Abbildungskammer.
- Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zur Aufzeichnung von Änderungen der Kalziumionenkonzentration.
Hauptergebnisse
- Kalziumantworten wurden erfolgreich von einzelnen Spermienzellen aufgezeichnet.
- Die Stimulation mit Progesteron führte zu beobachtbaren Anstiegen der Fluoreszenzintensität.
- Die Datenanalyse zeigte signifikante Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentrationen.
- Die Ergebnisse wurden zur besseren Veranschaulichung in Form eines Zeitraffervideos dargestellt.
Schlussfolgerungen
- Die Methode bietet einen zuverlässigen Ansatz, um die Kalziumsignalgebung in menschlichen Spermien zu untersuchen.
- Das Verständnis der Kalziumdynamik kann die Fortpflanzungsbiologie und die Forschung zur Fruchtbarkeit voranbringen.
- Zukünftige Studien könnten verschiedene Reize und deren Auswirkungen auf die Spermienfunktion untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Abbildung der intrazellulären Kalziumsignalgebung in menschlichen Spermien liefert einen funktionellen Endpunkt zur Beurteilung der Spermienmotilität und Befruchtungsfähigkeit, die entscheidende Parameter in der Diagnostik männlicher Unfruchtbarkeit und der Entwicklung von Verhütungsmitteln darstellen. Diese Methode ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Wirkstoffen, die auf spezifische Ionenkanäle oder Signalwege in Spermien abzielen, indem physiologische Reaktionen direkt in einem krankheitsrelevanten System gemessen werden. Der Ansatz unterstützt die Zielvalidierung und Assay-Entwicklung für Programme im Bereich der Fortpflanzungsgesundheit, indem er quantitative Einzelzell-Daten zu stimulusinduzierten Kalziumflüssen bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der Modulation von Ionenkanälen in Spermien und intrazellulären Signalwegen.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem die funktionelle Bindung an das Zielmolekül in menschlichen Spermien unter kapazitierenden Bedingungen bestätigt wird.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt Dosis-Wirkungs-Daten, die die Identifizierung und Priorisierung von Wirkstoffkandidaten auf Grundlage der Modulation des Calcium-Flusses unterstützen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt validierte, mit Farbstoff beladene humane Spermensuspensionen, die für Screenings mit hohem Informationsgehalt mittels Fluoreszenz geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Liefert zeitlich aufgelöste Messungen der Fluoreszenzintensität, die die Berechnung der prozentualen Änderung gegenüber dem Ausgangswert ermöglichen, um Wirkstoffe vergleichen zu können.
- Reproduzierbarkeit: Standardisierte Beladungs- und Perfusionsprotokolle unterstützen die Erzeugung konsistenter Daten über verschiedene Experimente und Labore hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verwendet menschliche Spermien als direktes translationsmedizinisches Modell zur Untersuchung der Mechanismen von Unfruchtbarkeit und Verhütungswirkung.
- Mechanistische Entwederung Verbindet die Exposition gegenüber Verbindungen mit funktionellen Kalziumantworten und verringert damit die Uneindeutigkeit bezüglich des Wirkmechanismus.
- Translationaler Kontinuität: Verknüpft in-vitro-Befunde mit physiologischen Ergebnissen durch die Messung von Echtzeit-Signalwegen in beweglichen, kapazitierten Spermien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, insbesondere für Programme, die auf Zielstrukturen im Bereich des Fortpflanzungstrakts abzielen, wo funktionelle Spermientests die Wirksamkeit in vivo vorhersagen können.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung spermien-spezifischer Zielstrukturen durch die Verknüpfung der Ligandenexposition mit intrazellulären Kalziumdynamiken.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch kontrolliertes Anfärben mit Farbstoffen, Perfusion und bildgebende Bedingungen, die reproduzierbare Fluoreszenzsignale unterstützen.
- Analytik: Liefert daten zur Kalziumflussdynamik auf Einzelzell-Ebene mit zeitlicher Auflösung, die den Vergleich von Stimulationsbedingungen und Wirkstoffeffekten erlauben.
- Translationale Forschung: Verwendet humane Spermien, um die physiologische Relevanz zu bewahren, und unterstützt so die Kontinuität vom mechanistischen Verständnis bis zur präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf die Spermienfunktion über mehrere Projekte und therapeutische Anwendungsbereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielmodulation, indem direkte Nachweise für Veränderungen der Kalziumsignalisierung in menschlichen Zellen bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Verfahren zur Zellisolierung, Farbstoffbeladung und Perfusionsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem funktionelle Daten bereitgestellt werden, die die Abhängigkeit von surrogate Biomarkern verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf nachgewiesenen Effekten auf die Kalziumsignalisierung von Spermien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Spermien, in der Fluoreszenzmikroskopie und in der Bildanalyse, um die Datenqualität sicherzustellen.
- Benötigt Perfusionssysteme und invertierte Mikroskope, die Zeitrafferaufnahmen mit minimaler Phototoxizität ermöglichen.
- Setzt eine Standardisierung zwischen den Arbeitsgruppen hinsichtlich der Zellpräparation, der Farbstoffkonzentration und des Zeitpunkts der Stimulation voraus, um Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme kann eine Optimierung der Adhäsionsbedingungen und der Protokolle zur Farbstoffbeladung erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Effizienz der Farbstoffaufnahme und das Risiko der Photobleiche, die durch die Verwendung von Farbstoffen im sichtbaren Wellenlängenbereich und kontrollierte Beleuchtung verringert werden können.
