Name: Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung primärer neuronaler Kulturen aus Drosophila-Puppenhirnen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Neuritenwachstum und Calciumdynamik in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom NIH NS27501 zu DKOD unterstützt. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeiten wurde durch ein Stipendium, um UC Irvine zur Unterstützung der DKOD durch die HHMI Professor Programm zur Verfügung gestellt.

Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung: <ol><li> Machen Sie sterile Sezieren Lösung. </li><li> Machen Sie sterile DMEM und behalten in 10 ml Aliquots bei 4 ° C für 2 Wochen. </li><li> Machen Sie sterile DDM2 Ergänzungen und frieren in 50 oder 100 ul Aliquots für 1 Monat. </li><li> Machen ConA / Laminin. </li><li> Coat Deckgläser. Optional: Stellen sterile CNBM und Speicher für bis zu 4 Monate eingefroren. </li></ol> Am Tag der Kultivierung I. Vorbereitung Enzymlösung (ES) in Laminarströmungshaube <ol><li> Setzen Sie 5 ml zu sezieren Lösung (DS) in einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wiegen 0,8 mg L-Cystein in einem 0,6 ml Eppendorf und fügen 150 ul DS. Pipette auf und ab, bis sich Kristalle verschwunden sind. </li><li> Add 150 ml DS / Cysteine ​​an die 5 ml DS und gut mischen. </li><li> Add 50 U (Einheiten) von Papain. </li><li> Add 7 ml 0,1 N Na OH und gut mischen. Lösung wird innerhalb von 30 min klar. wenn aktiviert. </li><li> Filter Enzymlösung mit 0,2 mm Spritzenfilter in ein steriles 1,5 ml Schraubverschluss Mikrozentrifugenröhrchen Papain: Want 50 U in 5 ml DS. Jede Charge ist etwas anders, so muss berechnen, wie viel: 37,3 mg / ml und 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Machen DDM2 Medien Am Tag der Kultivierung: fügen Sie die folgenden Ergänzungen zu machen DDM2 Zu 10 ml DMEM fügen Sie die Ergänzungen, kurz vor Kultivierung: <ol><li> 100 &amp;mgr; l Transferrin </li><li> 100 &amp;mgr; Putrescin </li><li> 100 &amp;mgr; l Selen </li><li> 100 &amp;mgr; l Progesteron </li><li> 50 ul Insulin </li><li> 10 &amp;mgr; l 20-Hydroxyecdysone </li></ol> Hinweis: Achten Sie genug DDM2 für alle Kulturen geplant (jedes Gehirn auf einem einzigen Deckglas in eine individuelle 35 mm Petrischale, 1,5 ms der Medien / Kultur verchromt) Step III-VI kann mit einer nicht sterilen getan Labortisch und sollte in 45 Minuten oder weniger abgeschlossen sein. III. Puppen-Sammlung <ol><li> Wählen Sie 10-15 Puppen von Seiten der Flasche unter einem Binokular. </li><li> Legen Sie Puppen in den Deckel einer trockenen 35 mm Petrischale. </li></ol> Hinweis: Wir verwenden in der Regel Gehirn aus Puppen zwischen 55-78 Stunden nach Puparium Bildung (APF). Es ist etwas schwieriger zu sezieren das Hirn aus der jüngeren Puppen da der Kopf Kapseln zum Einsturz neigen, während das gesamte Niveau der Neuritenwachstum ist etwas geringer aus dem ältesten Puppen. In der Canton-S Wildtypstamm, werden diese Phasen durch pigmentierte Augen, hellbraune bis leicht rötlich anerkannt sind, mit wenig Pigment anderswo. IV. Enthauptung unter Präpariermikroskop <ol><li> Legen Sie zwei Tropfen sterile Sezieren Lösung im Deckel der Petrischale, neben Puppen. </li><li> Vorsichtig halten eine einzige Puppe mit feinen Pinzetten in der linken Hand und mit einem 27-Gauge-Kanüle an einer 1 ml-Spritze in die rechte Hand auf die Nagelhaut am vorderen Ende der Puppe zu entfernen. </li><li> Squeeze Puppe leicht mit einer Pinzette und als Leiter entsteht verwenden 27-Gauge-Nadel, um den Hals zu durchtrennen. </li><li> Mit der Nadelspitze oder der Zange, Transfer Kopf bis zu sezieren Lösung fallen zu lassen. </li><li> Wiederholen, bis vor einem 10-15 Köpfe in einem einzigen Tropfen haben. </li></ol> V. Entfernung des Gehirns von Kopf unter Präpariermikroskop <ol><li> In jeder Hand halten eine 1 ml-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel. </li><li> Verwenden Sie diese, um die Fliege den Kopf in den Tropfen zu sezieren Lösung so den Rüssel steht vor Ihnen und der dorsalen Oberfläche des Kopfes liegt nördlich Position. </li><li> Setzen Sie die linke Nadel in den Rüssel auf den Kopf festnageln und mit der rechten Nadel, um einen Schlitz in das rechte Auge, die von der ventralen zur dorsalen Fläche hinausgeht. </li><li> Legen Sie die rechte Nadel in der Nähe der linken in die Region des Rüssels und dann mit der linken Nadel vorsichtig drücken Sie die Nagelhaut über dem linken Auge, schob das Gehirn auf den Schlitz in das rechte Auge. Das Gehirn soll aus dem Schlitz auf der rechten Seite auftauchen, relativ intakt, oft mit beiden optischen lobes noch angebracht und manchmal auch die pigmentierte Augengewebes auch. </li><li> Schieben Sie das Gehirn auf die Rückseite der Nadel und den Transfer zu einem Rückgang der sterile Kochsalzlösung zerlegt in eine neue sterile, 35 mm Petrischale. </li><li> Sammeln 10-15 Gehirn für jeden Genotyp. </li></ol> VI. Entfernung von Sehlappen und Enzymbehandlung <ol><li> In jeder Hand halten eine 1 ml-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel und nutzen diese, um alle Gehirne in einem kleinen Bereich des Tropfens zu sezieren Lösung sammeln </li><li> Verwenden Sie Spritzen als Schneidwerkzeuge der optischen Loben von jedem Gehirn zu entfernen, damit das Gewebe bleibt für Kultur ist die zentrale Region des Gehirns. </li><li> Verwenden Sie eine 20 ul Pipetman, bei 5 ul gesetzt, für alle die Gehirne von einem einzigen Genotyp in ein Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml sterilem Papain-Lösung übertragen. </li><li> Brains in Papain für 10-15 Minuten auf einem Rotator bei 60 rpm inkubiert. </li><li> Zentrifugation bei 3000 rpm für 3 Minuten. </li></ol> Innerhalb sterile Laminarströmungshaube - alle Schritte, bei denen Gewebe der Luft ausgesetzt ist, sollte in Laminarströmungshaube für die verbleibenden Schritte getan werden. VII. Waschen <ol><li> Entfernen Enzymlösung und ersetzen mit steriler Sezieren Lösung. </li><li> Zentrifugation bei 3000 rpm für 3 Minuten. </li><li> Waschen mit sterilem Sezieren Lösung insgesamt 3-mal. </li><li> Entfernen Sie sezieren Kochsalzlösung und ersetzen mit DDM2. </li><li> Zentrifuge und waschen insgesamt 2-mal mit DDM2. </li><li> Transfer-Köpfe und Medien, um eine sterile 35 mm Petrischalen. </li></ol> VIII. Trituration und Plating unter Präpariermikroskop <ol><li> Platz 5 ul DDM2 in der Mitte des Deckglases. </li><li> Transfer 1 Gehirn, diese Tropfen DDM2 mit einer gelben Spitze. </li><li> Unter dem Mikroskop, verwenden 27-Gauge-Nadel, um Würfel Gehirn in kleine Stücke (sollte &lt;1 Minute dauern). </li><li> Unter visuelle Führung, brechen die Spitze einer Glaspipette, die zu einer feinen Spitze gezogen worden ist, so dass die größeren Teile können leicht in die Spitze der Pipette angesaugt und wieder in das Medium vertrieben. Wir verwenden Mund Saugrohre, die standardmäßig mit 100 ul Hämatokrit Kapillare Glas kommen. Hinweis: Achten Sie darauf, Blasen in den Medien zu bekommen und Sie müssen empirisch zu bestimmen, die beste Größe Pipette zu verwenden. Guten ermöglichen es Ihnen, das Gehirn mit einzelnen Zellen und noch einige große Klumpen distanzieren, in ca. 30 Sekunden / Gehirn. Wenn Sie an diesen Blick auf höhere Gewalt, sollte ca. 10-20% der Neuronen noch einige Prozesse noch und es wird noch einige große Klumpen werden. Wenn Sie distanzieren zu viel, dann alle Zellen werden rund und sie wird so viel Schaden, den sie nicht überleben wird erlitten haben. Dieser Schritt erfordert Übung und muss schnell erfolgen, da gibt es ein großes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis und die Osmolalität und pH-Wert der Tropfen DDM2 kann sich schnell ändern. Tissue muss in CO 2-Inkubator gelegt werden so schnell wie möglich. </li><li> Schreiben Petrischale Deckel: &quot;Genotype, Datum und Uhrzeit&quot;. </li><li> Setzen Sie die 35 mm Petrischale in einem 100 mm Petrischale (mit nassen Kimwipe) und lassen Sie siedeln sich in der CO 2-Inkubator für 30 min. </li><li> Flood die 35 mm-Schale mit 1,5 ml DDM2. </li><li> Keep Kulturen in den Brutschrank bei 5% CO 2-Inkubator (23 ° C). Hinweis: Wenn Sie keinen Zugang zu einer Abkühlung CO 2-Inkubator, verwenden Sie ein Standard-Säugetier-Zellkultur-Inkubator und entweder steckte es in einen kühlen Raum und Wärme bis 23 ° C, oder im Labor setzen, schalten Sie temp, und verwenden Sie Eis in einem Fach an der Unterseite des Inkubators zu temp um Umgebungslicht zu regeln. </li></ol> IX. Feeding Cells <ol><li> Am Tag 1 (nächster Tag), 0,5 ml CNBM/B27 (konditionierte Medien) zum 3:1 DDM2 machen: CNBM/B27. </li><li> Am Tag 5 ersetzen 1 ml der Medien für 03.01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Keep Fütterung Zellen mit 3:1 DDM2: CNBM/B27 alle 4-5 Tage. Hinweis: Kulturen können ohne die nicht-neuronalen konditionierten Medien angebaut werden, aber die Neuronen scheint ein wenig zerbrechlich und sind schwieriger für die Verwendung in der Elektrophysiologie Experimente. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neuronen aus dem Gehirn von embryonalen / postnatale Nagetiere geerntet werden in primären Zellkulturen gezüchtet werden, wo sie Neuriten und erweitern Form funktioneller synaptischer Verbindungen. Methoden zur Herstellung dieser Kulturen sind gut etabliert und Studien in Nagetieren neuronalen Kulturen haben eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Genen und Umweltfaktoren bei der Regulierung der Synapsenbildung und Funktion (Banker und Goslin, 1991) beteiligt gespielt. Während Insekten Neuronen aus einer Vielzahl von Arten könn...

Coating Deckgläser: Put autoklaviert Deckgläschen in einer 60 mm Petrischale. Pipettieren Sie 5 ul der Con A / Laminin-Mix auf Mitte jedes Deckglas. Legen Sie in 37 C Inkubator für 2 Stunden. Spülen Sie 3x Deckgläschen mit 100 ul autoklaviert Wasser jeden. Verwenden Sie einen Staubsauger an einer sterilen Pasteur-Pipette. Während der letzten Spülgang, nehmen Sie den Deckglas mit einer Pinzette und trocken beiden Seiten. Übertragen Sie die Deckglas zu einer 35-mm-Petrischale. Lagerung bei Raumtemperatur für bis zu einem Monat.

primäre neuronale kulturen aus den gehirnen von late stage drosophila puppen

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In diesem Video zeigen wir die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Das Verfahren beginnt mit der Entfernung der Gehirne von Tieren, bei 70-78 Std. nach Puparium Bildung. Die isolierte Gehirne sind nach kurzer Inkubationszeit in Papain von mehreren Wäschen in serumfreien Wachstumsmedium gefolgt gezeigt. Der Prozess der mechanischen Dissoziation jedes Gehirn in einem 5-ul Tropfen Medien auf einem Deckglas dargestellt. Die Axone und Dendriten der post-mitotischen Neuronen off in der Nähe des Soma während Dissoziation sheered aber die Neuronen beginnen, um Prozesse innerhalb von wenigen Stunden plating regenerieren. Bilder zeigen, lebende Kulturen in 2 Tagen. Neuronen weiterhin Prozesse während der ersten Woche in Kultur zu erarbeiten. Speziellen neuronalen Populationen können in Kultur identifiziert werden mit GAL4 Linien gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Markern wie GFP oder RFP-Laufwerk. Ganzzell-Aufnahmen haben gezeigt, den kultivierten Neuronen bilden funktionelle, spontan aktive cholinergen und GABAergen Synapsen. Ein kurzes Video Segment zeigt Calcium-Dynamik in der kultivierten Neuronen mit Fura-2 als Kalzium-Indikator-Farbstoff zu spontanen Kalzium Transienten und Nikotin hervorgerufenen Calcium-Reaktionen in eine Schüssel mit kultivierten Neuronen zu überwachen. Diese Puppen Gehirn Kulturen sind ein nützliches Modell, bei dem genetische und pharmakologische Werkzeuge zur inneren und äußeren Faktoren, die Bildung und Funktion von zentralen Synapsen beeinflussen identifiziert werden können.

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus den Gehirnen von Spätstadium Drosophila Puppen. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Neuritenwachstum und Bildgebung von Calcium-Spiegel mit Fura-2.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung primärer Neuronenkulturen aus den Gehirnen von Drosophila-Puppen in einem späten Entwicklungsstadium. Das Verfahren beginnt mit der ...

Mein Name ist Diana Dowd und ich bin Professorin in den Abteilungen für Anatomie und Neurobiologie sowie für Entwicklung und Zellbiologie hier an der UC Irvine. Heute werde ich Ihnen die Herstellung neuronaler Kulturen aus Drosophila-Puppen beschreiben. Dabei wird das Gehirn aus späten Puppenstadien entnommen, wobei wir in der Regel lediglich die Region des Zentralgehirns kultivieren.Und in diesem Stadium sind die wichtigsten anatomischen Strukturen, die im erwachsenen Gehirn vorhanden sind, bereits ausgebildet. Dazu gehören die Antennenlappen, in denen Projektionsneuronen liegen, deren Axone bis in den Bereich des Pilzkörpers verlaufen, sowie die Pilzkörperneuronen, die Kenyon-Zellen, deren Axone durch die Alpha-, Beta- und Gamma-Lappen zu ihren Zielneuronen hinabreichen. Am Tag der Kultivierung betreten wir zunächst die laminare Flusswerkbank und bereiten steril die Enzymlösung vor, die wir zur Dissoziation des Gewebes verwenden werden.Und wir bereiten außerdem das Medium vor, das wir für das Kultivieren der Zellen verwenden werden. Dieses wird aus Stämmen hergestellt, die wir zuvor vorbereitet haben. Der nächste Schritt besteht darin, die Puppen zu sammeln, die wir für diese Dissoziation oder für die Dissektion verwenden werden.Und das geschieht außerhalb des Sicherheitswerks, da diese in Gefäßen gezüchtet werden, die Hefe und allerlei andere Substanzen enthalten. Daher führen wir die anfänglichen Schritte unserer Dissektion außerhalb des Sicherheitswerks durch. Dies sind Pipetten, die ich gerade von der Seite eines Gefäßes genommen habe, und in dieser linken Reihe haben wir Tiere mit roten Augen, die sich gut für die Kultivierung eignen.Diese hier sind etwas jünger, diese PPP hier sind etwas jünger. Sie haben orangerote oder gelbe Augen, und dies ist eine akzeptable 1 0 7 Linie. Ihre Augen sind etwas heller als bei normalen Wildtypen, bei denen die Farbe in diesen Stadien etwas bräunlicher wäre.Alle diese Stadien eignen sich gut zum Kultivieren, um Gehirnkulturen herzustellen. Als ersten Schritt geben wir ein paar Tropfen der Dissektionslösung direkt neben die Puppen, die ich aus dem Reagenzglas entnommen und in meiner Petrischale aufgereiht habe. Wir verwenden die Deckel von 35-Millimeter-Petrischalen.Dann nehme ich mit der linken Hand ein Paar Pinzetten der Größe Nr. 5 und mit der rechten Hand eine 1-cc-Tuberkulinspritze mit einer 27-Gauge-Nadel an der Spitze. Dies sind meine beiden dissezierenden Werkzeuge. Um den Kopf aus dem Pupillarkasten oder aus dem Pupi zu entfernen, halte ich den Pupi mit der Pinzette in der linken Hand und verwende dann die Nadel in der rechten Hand, um die Vorderseite des Pupillarkastens zu entfernen.Dann ziehe ich die Cuticula zurück, wodurch der Kopf nach vorne austritt. Anschließend durchtrenne ich mit der Nadel den Körper im Nackenbereich, nehme den Kopf auf und lege ihn in den Tropfen mit dem Aufbrechpuffer. Ich werde diesen Vorgang 10 bis 15 Mal wiederholen, da ich für eine gute Kultur 10 bis 15 Tiere jedes Genotyps benötige.Also gut, ich werde das Gehirn aus dem Kopf des Tieres entfernen. Dazu verwende ich zwei Tuberkulinspritzen, von denen jede eine Nadel mit 27 Gauge hält. Die linke Nadel führe ich direkt durch das Foramen magnum des Tieres, um den Kopf am Boden der Petrischale festzustecken.Dann verwende ich meine rechte Nadel, um einen Schlitz auf der rechten Seite zu öffnen, und dort werde ich das Gehirn herausschieben. Okay, der nächste Schritt besteht nun darin, meine linke Nadel über das linke Auge zu legen. Jetzt schiebe ich tatsächlich das Gehirn heraus, und es sollte auf der rechten Seite durch den Schlitz austreten.Hier ist es. Man kann es auf der rechten Seite sehen, und nun kann ich einfach meine rechte Nadel benutzen, um es von der übrigen Kopfkapsel und den Augen zu trennen. Gut. Bevor ich nun den letzten Schnitt durchführe, bei dem die optischen Lappen entfernt werden, überführe ich das Gehirn in einen sauberen Tropfen Salzlösung.Ich kann entweder eine Pipettenspitze verwenden, um das zu tun, und nehme sie mit der Spitze einer 20-Mikroliter-Pipettenspitze auf, die ich auf fünf Mikroliter eingestellt habe, oder ich kann sie auch direkt auf die Nadeln übertragen. Dies ist die letzte Stufe des Dissektionsverfahrens. Es erfolgt in einem frischen Tropfen Salzlösung, und normalerweise hätte ich hier etwa 10 bis 15 Gehirne.Danach entferne ich die Opticallappen von jedem Gehirn, indem ich 27-Gauge-Nadeln als Schneidewerkzeuge verwende, und trenne einfach den linken Opticallappen ab, gefolgt vom rechten Opticallappen an jedem Gehirn. Zu diesem Zeitpunkt werden alle Gehirne, die auf diese Weise bearbeitet wurden, in ein Röhrchen überführt, das die Enzymlösung enthält, die für die enzymatische Dissoziation verwendet wird. Alle Gehirne eines einzelnen Genotyps kommen in ein einziges Eppendorf-Schraubkappenröhrchen, das ein Milliliter der Enzymlösung enthält.Und dann stellen wir sie einfach in einen Reagenzglashalter und geben sie auf einen Rotator, wo sie 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur verbleiben. Dies ist die eigentliche Dauer der Dissoziation. Um den Enzym-Dissoziationsschritt abzuschließen, müssen wir das Enzym tatsächlich entfernen.Daher bringen wir die Röhrchen zu einer EOR-Zentrifuge, stellen die Röhrchen in die Zentrifuge ein und zentrifugieren sie drei Minuten lang bei 3000 U/min. Nachdem wir die Gehirne zentrifugiert haben, bringen wir sie nun in unsere laminare Flusswerkbank. Hier beginnt der sterile Teil des Verfahrens.Wir öffnen den Tuben jetzt nicht mehr, es sei denn, wir befinden uns in der laminaren Luftströmungshaube, und entfernen nun die Enzymlösung. Wir ersetzen sie durch Dissektionslösung und zentrifugieren und waschen anschließend mehrmals abwechselnd mit Dissektionslösung, wobei wir schließlich mit einem definierten Medium enden, in dem wir die Zellen kultivieren. In Ordnung.Das Erste, was ich hier tun muss, ist, einen Tropfen Salzlösung von fünf Mikrolitern auf jedes der Deckgläser zu geben, die ich in diesen Petrischalen habe. In jeder Petrischale befindet sich ein einzelnes Deckglas, das mit Con A und Laminin beschichtet wurde. Daher gebe ich einen Tropfen von fünf Mikrolitern genau in die Mitte des Deckglases. Dort befindet sich mein Tropfen Laminin.Es ist sehr wichtig, weil Sie Ihre Zellen genau in der Mitte des Feldes konzentrieren möchten, da wir etwa 10.000 Zellen pro Gehirn erhalten, und daraus stellen wir eine einzelne Kultur her. Gut, wenn wir nun durch das Mikroskop schauen, sehen wir hier neun Gehirne, die bereits dem Enzym-Dissociationsverfahren unterzogen wurden. Sie sind noch weitgehend intakt.Sie besitzen ihre Opticallappen nicht mehr. Diese wurden entfernt, sodass nur noch der zentrale Gehirnbereich vorhanden ist, und nun werde ich mithilfe einer Pipette ein einzelnes Gehirn aufnehmen und es auf einen Tropfen von fünf Mikrolitern auf einem Deckglas übertragen. Dies wiederhole ich insgesamt viermal.Ich nehme zwei Ein-Kubikzentimeter-Spritzen und setze 27-Gauge-Nadeln auf. Nochmals: Es ist sehr wichtig zu beachten, dass dies sehr preiswerte und verwerfbare Präparationswerkzeuge sind, sodass Studierende dies durchführen können, ohne sich um das Budget sorgen zu müssen. Gut, jetzt habe ich die beiden Nadeln und führe die erste mechanische Dissoziation durch, bei der ich dieses Gehirn einfach in mehrere Stücke schneide. Dadurch kann ich die Stücke gleich innerhalb einer Minute mit einer Glaspipette aufsaugen, um die endgültige Dissoziation abzuschließen.Wenn ich dies durchführe, zerkleinere ich sie nicht zu winzigen Stücken, ich möchte lediglich die Gesamtgröße verringern, sodass ich etwas kleineres erhalte, damit die Pipette bei der Dissoziation etwas kleinere Stücke aufnimmt als beim gesamten Gehirn. Ich möchte dies auch relativ schnell durchführen, da die Tropfen des Mediums klein sind. Das bedeutet, dass wir ein hohes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis haben, und sowohl der pH-Wert als auch die Osmolarität der Lösung können sich ändern, wenn ich sie über einen längeren Zeitraum stehen lasse.Als ich das zuerst gemacht habe, habe ich jeweils nur zwei Gehirne, zwei Kulturen gleichzeitig bearbeitet. Inzwischen mache ich normalerweise vier, und jetzt werde ich die Pipette brechen, aber ich darf nicht darüber sprechen oder sonst etwas, richtig? Dieses hier habe ich gerade beendet.Die Dissoziation, die Größe der Pipette war ziemlich gut. Ich konnte das Gewebe mehrmals auf und ab aufsaugen, und man sieht einzelne Zellen; wir haben noch Klumpen, aber das ist in Ordnung. Diese werden weggespült. Jetzt werden die Kulturen, sobald sie ausgestrichen wurden, in eine zweite Petrischale überführt und innerhalb weniger Minuten in den CO2-Inkubator gestellt, da wir sicherstellen möchten, dass der pH-Wert und die Osmolarität auf einem Niveau gehalten werden, das ihr Überleben unterstützt. Wir lassen sie hier also 30 Minuten lang stehen, bevor wir die Schale überschwemmen. Diese Kulturen wurden aus den Gehirnen von späten Puppenstadien hergestellt.Die Kultur wurde zwei Tage lang in einem CO2-Inkubator gezüchtet, und Sie können einzelne Zellen erkennen, die Fortsätze ausgebildet haben. Der Grad der Fortsatzbildung ist geringer als am fünften Tag und größer als am ersten Tag. Mein Name ist Jorge Ano.Ich arbeite im Doubts-Labor. Ich zeige Ihnen jetzt, wie wir das Experiment durchführen, das Kalzium-Bildgebungs-Experiment in den Zellkulturen, die wir gerade vorbereitet haben. Dies ist ein Video eines Kalzium-Bildgebungs-Experiments, bei dem Sie blaue Zellen mit niedrigen Kalziumkonzentrationen und rote Zellen mit hohen Kalziumkonzentrationen sehen.Wir werden sehen, dass einige Zellen rot gefärbt werden, was auf steigende intrazelluläre Kalziumspiegel hinweist. Diese sind spontan und vorübergehend. Im Laufe der Zeit kehren sie zu den Ausgangswerten der Kalziumkonzentration zurück, und nach einer Weile werden wir ein Medikament, in diesem Fall Nikotin, hinzufügen, woraufhin Sie einen Anstieg der intrazellulären Kalziumspiegel in den Zellen beobachten werden.Wir applizieren Nikotin für 100 Sekunden, danach waschen wir das Nikotin aus, und anschließend kehren die Zellen zu ihren basalen Kalziumspiegeln zurück. Der eigentliche Vorteil dieses Kultursystems liegt darin, dass wir unsere Kulturen sowohl aus transgenen als auch aus mutierten Fliegenlinien herstellen können, verschiedene Linien, in denen unterschiedliche neuronale Teilpopulationen mit GFP markiert sind. Dies ist das Gehirn einer der Linien, die wir verwendet haben, in der GFP im Pilzkörper und in Kenyon-Zellen exprimiert wird, Neuronen, die an der Vermittlung komplexer Verhaltensweisen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, beteiligt sind.Die Zellkörper befinden sich im dorsalen Bereich des Gehirns in der Umgebung, wo die roten Pfeile zeigen. Und diese L-förmigen Strukturen, die GFP-positiv sind, stellen tatsächlich die axonalen Fortsätze dieser Kenyonzellen des Pilzkörpers dar, nach der Dissoziation dieses Gehirngewebes.Die Neuronen regenerieren ihre Fortsätze in der Kultur, und Sie können in diesem Fall die GFP-positiven Kenyan-Zellen leicht identifizieren. Diese sind sowohl für standardmäßige elektrophysiologische Ableitungen als auch für Kalzium-Bildgebungsstudien zugänglich. Daher sind diese Kulturen äußerst nützliche Werkzeuge, um genetische und umweltbedingte Faktoren zu untersuchen, die wichtig für die Regulation der Funktion von Neuronen sind, von denen bekannt ist, dass sie bei der Vermittlung komplexer Verhaltensweisen im erwachsenen Tier eine wichtige Rolle spielen.

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt die Herstellung von primären neuronalen Kulturen aus midgastrula Bühne Drosophila-Embryos. Ansichten von lebenden Kulturen zeigen Zellen 1 Stunde nach dem Ausplattieren und differenzierten Neuronen nach 2 Tagen Wachstum in einem Bicarbonat-basierten definiertem Medium. Die Neuronen sind elektrisch erregbar und bilden synaptische Verbindungen.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen...

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Identifizierung exogener Faktoren, die die Reaktivierung von Drosophila-neuralen Stammzellen des Gehirns aus ihrem Ruhezustand initiieren. Frisch geschlüpfte Larven werden präpariert, um ihre Gehirne zu isolieren, die dann mit oder ohne Testhormon in Medien kultiviert werden, um das Potenzial des Hormons zur Reaktivierung und Proliferation von neuralen Stammzellen zu bewerten.

Analyse der Reaktivierung neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantaten

Eine Verletzung Paradigma mit der Drosophila Larve Bauchmark des zentralen Nervensystems Regeneration und Reparatur zu untersuchen beschrieben. Stabbing gefolgt von Laser-Scanning-konfokalen Mikroskopie im Zeitraffer und festen Proben mit quantitativen Analyse mit gezielt entwickelten Software und Genetik kombiniert werden verwendet, um die molekularen Mechanismen der ZNS-Regeneration und Reparatur zu untersuchen.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

Drosophila S2-Zellen und kultivierten Neuronen sind große Systeme für die Bildgebung von motorbetriebenen Organellentransport in vivo. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Kultivierung beider Zelltypen, die Abbildung und Analyse des Verkehrs.

Organell-Transport in kultivierten Drosophila Zellen: S2-Zelllinie und primären Neuronen.

Immunfärbung ist eine effektive Technik zur Visualisierung spezifischer Zelltypen und Proteine innerhalb von Geweben. Durch die Verwendung von Ultraschall verringert das hier beschriebene Protokoll die Notwendigkeit, Drosophila melanogaster-Gewebe von Embryonen und Larven im Spätstadium vor der Immunfärbung zu präparieren. Wir bieten eine effiziente Methodik für die Immunfärbung von Formaldehyd-fixierten Whole-Mount-Larven.

Beschallung-erleichtert Immunfluoreszenzfärbungen der Late-Stage embryonalen und Larven<em&gt; Drosophila</em&gt; Gewebe<em&gt; In-situ</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Das Ziel dieses Protokolls ist, ex Vivo Drosophila Larven Gehirn Kultur so optimiert, dass circadiane molekulare Rhythmen mit langfristigen Zeitraffer Fluoreszenz-Bildgebung überwachen zu etablieren. Die Anwendung dieser Methode auf pharmakologische Tests wird auch diskutiert.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Dieser Artikel enthält detaillierte Protokolle zur Zufügung einer penetrierenden traumatischen Hirnverletzung (PTBI) bei erwachsenen Drosophila und zur Untersuchung der daraus resultierenden Neurogenese.

Stimulation und Analyse der adulten Neurogenese im zentralen Gehirn von Drosophila

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

Erfahren Sie die Herstellung primärer neuronaler Kulturen aus Drosophila-Puppenhirnen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Neuritenwachstum und Calciumdynamik in vitro.

Primäre neuronale Kulturen aus den Gehirnen von Late Stage Drosophila Puppen

Weitere Videos entdecken