Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, komplexe Muster von Licht in Zeit und Raum zu steuern, sodass sie zur Stimulation von Neuronen eingesetzt werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst ein DMD-Chip in einer geeigneten konjugierten Bildebene im optischen Pfad des Mikroskops positioniert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, den DMD mit einer intensiven Lichtquelle wie einem Laser korrekt zu beleuchten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Bildrauscheffekt einer kohärenten Beleuchtung zu eliminieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Integration einer grafischen Benutzeroberfläche zur Steuerung des DMD-Chips. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Experimente, die zuvor nur schwer durchführbar waren, nun relativ einfach über eine Mehrfach-Lyse von cagierten Neurotransmittern mithilfe des DMD-Systems realisiert werden können.

Hallo, ich bin Michael Mohammed aus dem Labor von Dr. Chaman Tang an der Abteilung für Neurologie der University of Maryland. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Erzeugung komplexer Muster der Eliminierung in einem optischen Mikroskop. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die dendritische Integration zu untersuchen.

Beginnen wir also. Dieses Protokoll demonstriert den Betrieb eines digitalen Mikrospiegelbausteins oder eines DMD-Beleuchtungssystems für die experimentelle Neurowissenschaft. Ein DMD ist ein optischer Halbleiterchip mit mehreren hunderttausend mikroskopisch kleinen beweglichen Spiegeln, die in einer rechteckigen Anordnung auf seiner Oberfläche angeordnet sind. Die Position jedes Spiegels entspricht dem Pixel eines Bildes.

Jeder Spiegel kann einzeln gesteuert werden, um zwischen zwei Orientierungen zu kippen. In der ausgeschalteten Orientierung wird das Licht von der optischen Achse der Probenausleuchtung weggeleitet. In der eingeschalteten Orientierung wird das Licht entlang der optischen Achse gelenkt.

DMD eignet sich gut für die Lyse, da es sehr intensive UV-Strahlung verträgt, hohe Kontrastverhältnisse zwischen den ein- und ausgeschalteten Pixeln erzeugt und innerhalb von zehn Mikrosekunden zwischen den beiden Zuständen wechseln kann. Die Anwendung von DMDs in der biomedizinischen Forschung wird durch die weite Verbreitung von Bildverarbeitungssoftware und -hardware sowie durch das kommerzielle Interesse im Bereich der Bildanzeige unterstützt. Modulare Komponenten werden von Texas Instruments als DLP-Discovery-Kits vermarktet, die die erforderlichen elektronischen Treiber bereitstellen, um das DMD in ein mikroskopisches System zu integrieren.

Grundlegende Konzepte zur Optik der Mikroskopie müssen verstanden werden. Das moderne fluoreszierende Mikroskop besteht aus einem Abbildungsweg und einem Beleuchtungsweg. Es umfasst ein Objektiv, einen Filterwürfel und zwei unterschiedliche Tubuslinsen für den Abbildungsweg und den Beleuchtungsweg.

Das Mikroskop ist so konstruiert, dass es Positionen besitzt, die konjugiert zur Bildebene des Präparats sind, wobei Objekte, die in der Präparatebene scharf gestellt sind, auch an diesen konjugierten Bildebenen scharf erscheinen. Eine Folgerung aus diesem Konzept ist, dass jedes helle Bild, das in der konjugierten Bildebene erzeugt wird, auch scharf auf die Bildebene des Präparats projiziert würde. Diese Strategie wird verwendet, um ein computergeneriertes Beleuchtungsmuster auf das Präparat zu projizieren.

Der Laserstrahl dient als sehr helle Lichtquelle, die das von den Mikrospiegeln auf den DMD-Chips erzeugte Muster beleuchtet, die sich in einer konjugierten Bildebene befinden. Die Konstruktion eines DMD-Beleuchtungssystems hängt von den zur Anregung verwendeten Lichtquellen bei Optogenetik-Experimenten ab, bei denen sichtbares Licht im Wellenlängenbereich genutzt wird. Das beleuchtete Muster kann über den Kamerapfad geleitet werden.

Daher kann der DMD-Chip einfach an einem der beiden Kameraports eines Dual-Kameraport-Moduls montiert werden. Umgekehrt muss bei Experimenten, die Licht im UV-Bereich verwenden, wie beispielsweise die Spaltung von „caged“ Verbindungen, das Licht über den Epi-Beleuchtungsweg geführt und eine besser zugängliche konjugierte Bildebene geschaffen werden. Der Grund hierfür ist, dass die Abbildungstubuslinse nicht für die Transmission von UV-Licht ausgelegt ist.

Stattdessen wird die Beleuchtungs-Objektivlinse für die UV-Übertragung verwendet und erfüllt ihre Aufgabe bei der Bildformation ausreichend gut. Jeder Mikrospiegel auf der DMD kann zwischen einer positiven und einer negativen Neigung von 12 Grad relativ zur Ebene des Chips wechseln. Abhängig von dem digitalen Eingangssignal, das er vom Computer erhält, verläuft die Drehachse entlang der diagonalen Ecken jedes Spiegels, also in einem Winkel von 45 Grad zu den rechteckigen Seiten des Chips.

Die Ausrichtung der Spiegelneigung wird durch ein goldfarbenes Dreieck an einer Ecke der Vorderfläche des Chips gekennzeichnet. Die Neigung des Mikrospiegels bestimmt die Ausrichtung von Neigungswinkel (Pitch) und Azimut des einfallenden Beleuchtungsstrahls. Um die DMD zu beleuchten, stellen Sie zunächst den Neigungswinkel des Beleuchtungsstrahls auf 24 Grad bezüglich der senkrechten Achse des DMD-Chips ein und justieren Sie das Azimut so, dass es senkrecht zur Drehachse des Spiegels steht.

Eine präzise Ausrichtung des Strahls ist entscheidend für einen effizienten Betrieb. Für Lyse-Experimente verwenden Sie eine Laserquelle, um den hochintensiven, fokussierbaren Strahl zu erzeugen, der für eine schnelle Freisetzung erforderlich ist.

Hier wird ein quasi kontinuierlicher, diodengepumpter, frequenzverdreifachter Festkörperlaser auf der Basis von ND verwendet; nutzen Sie einen Laser mit relativ hoher Leistung, da nur ein kleiner Bruchteil der Laserleistung tatsächlich an die Probe abgegeben wird. Bei Verwendung eines DMD-Systems leiten Sie die Laserleistung in eine Multimode-Faser ein, sodass diese leicht positioniert und entlang der korrekten Achse ausgerichtet werden kann, um die DMD zu beleuchten und so das aus kohärenter Beleuchtung resultierende Speckle-Problem zu lösen. Leiten Sie das Licht durch die optische Faser.

Die Faser wird um einen elektrischen Faserdehner von Pazo gewickelt, der so angesteuert wird, dass er mit etwa 40 Kilohertz oszilliert. Die mikroskopisch kleine Dehnung der Faser reicht aus, um das Specklemuster während der millisekundenlangen Dauer jedes Lichtstimulationspulses mehrfach zu verschieben, wodurch die Speckelbildung effektiv eliminiert wird. Schließlich wird das Ausgangslicht der optischen Faser mit einem UV-Mikroskopobjektiv kollimiert, um die DMDs zu beleuchten. Die Software zur Koregistrierung des CCD-Pixels mit dem DMD-Bild, die einzelne DMD-Spiegel bestimmten Pixeln der abbildenden CCD-Kamera zuordnet, wurde verfasst.

Die grafische Benutzeroberfläche in der Software ermöglicht es dem Anwender, mithilfe der Computermaus die DMD-Spiegelorientierung zuzuweisen, die dem Bereich auf dem CCD-Bild entspricht. Markieren Sie die Stelle für die photochemische Stimulation, indem Sie den Cursor über das auf dem Bildschirm angezeigte Bild bewegen, und klicken Sie auf den markierten Bereich von Interesse, um die Muster für die Lichtabgabe im Speicher zu programmieren. Das auf dem Computerbildschirm als Serie separater Bilder markierte Muster programmiert die zeitliche Abfolge der Laserimpulse für jedes räumliche Muster in die Software ein.

Dies wird mit dem Datenerfassungsprogramm P clamp integriert. Verwenden Sie abschließend das Datenerfassungsprogramm, um die zeitliche Abstimmung der DMD-Elektronik, die Gating-Funktion des Lasers und die Erfassung des patchgekoppelten elektrischen Signals vom Zielneuron zu koordinieren. Hier wird eine Kalibrierung der Auflösung des optischen Systems gezeigt.

Die minimale Spotgröße wird anhand eines fluoreszierenden Targets angegeben. Die effektive physiologische Auflösung wird durch die Amplitude des Stromflusses in Abhängigkeit von der photochemischen Stimulation gemessen. Die Spotposition liegt hier vor, wobei cagiertes Glutamat neben einem dendritischen Ast mit zwei Mikrometer Durchmesser photoaktiviert wurde.

Während der Fleck verschoben wurde, sind orthogonale elektrische Antworten auf die fotoelektrische Stimulation unterschiedlicher Intensitäten dargestellt. Spannungsgekoppelte Antworten in Abhängigkeit von der Lichtintensität sind gezeigt.

Die verteilte dendritische Stimulation kann mithilfe eines auf einer DMD-basierten System einfach umgesetzt werden. Hier wurde die Eingangsintensität variiert, indem die Anzahl der als Kreise markierten Stellen der Lichtstimulation auf den beiden dendritischen Ästen erhöht wurde. Die räumliche Summation kann an Verzweigungsstellen nichtlinear sein.

Es wird zunehmend überlinear mit steigenden Eingangsamplituden, die an den beiden Zweigen der Tür eintreffen. Diese Ergebnisse veranschaulichen eindeutig die nichtlineare Art der Summation an dendritischen Verzweigungsstellen. Die Überlinearität wird weitgehend durch NMDA-Rezeptoren und nicht durch spannungsabhängige Kanäle vermittelt.

Dies kann gezeigt werden, indem zwei NMDA-Antagonisten, PV und MK-801, eingesetzt werden, die das nichtlineare Verhalten weitgehend unterdrücken. Wir haben Ihnen soeben die grundlegende Konstruktion und Funktionsweise eines auf DMD basierenden Systems zur Musteroptostimulation von Nervengewebe vorgestellt. Das System kann für die Stimulation mit sichtbarem Licht angepasst werden, wie es beispielsweise bei optogenetischen Experimenten verwendet wird.

Es kann auch für Nah-UV-Lichtquellen adaptiert werden, wie sie bei der Einzelphotonenlyse verwendet werden. Bei dieser Prozedur ist es wichtig zu beachten, dass, wenn Licht mit einer Wellenlänge unterhalb von 400 Nanometern verwendet wird und die meisten Personen über den Epi-Beleuchtungsweg arbeiten, eine präzise Ausrichtung des Beleuchtungsstrahls auf wenige Grad genau entscheidend ist und dass bei Verwendung kohärenten Lichts die Streuung (Speckling) wirksam unterbunden werden muss. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.