Gemusterte Photostimulation mit Digital Micromirror Devices auf Dendritische Integration über Verzweigungspunkte Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, komplexe Lichtmuster in Zeit und Raum zu kontrollieren, damit es zur Stimulation von Neuronen verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst ein DMD-Chip auf einer geeigneten konjugierten Bildebene im Strahlengang des Mikroskops positioniert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das DMD mit einer intensiven Lichtquelle wie einem Laser richtig zu beleuchten.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Fleckeneffekt der kohärenten Beleuchtung zu eliminieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine grafische Benutzeroberfläche zu integrieren, um den DMD-Chip zu manipulieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass Experimente, die zuvor schwer durchzuführen waren, jetzt relativ einfach durch die Multi-Site-Lyse von Käfig-Neurotransmittern unter Verwendung des DMD-Systems durchgeführt werden können.

Hallo, ich bin Michael Mohammed und das Labor von Dr. Chaman Tang an der Abteilung für Neurologie der Universität von Maryland. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem sich komplexe Eliminationsmuster im Lichtmikroskop erzeugen lassen. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die dendritische Integration zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Dieses Protokoll wird den Betrieb eines digitalen Mikrospiegelgeräts oder DMD-Beleuchtungssystems für die experimentellen Neurowissenschaften demonstrieren. Ein DMD ist ein optischer Halbleiterchip mit mehreren hunderttausend mikroskopisch kleinen beweglichen Spiegeln, die in einem rechteckigen Array angeordnet sind. Auf seiner Oberfläche entspricht die Position jedes Spiegels dem Pixel eines Bildes.

Jeder Spiegel kann individuell gesteuert werden, um zwischen zwei Ausrichtungen zu kippen. In der ausgeschalteten Ausrichtung wird das Licht von der optischen Achse der Probenbeleuchtung weg gerichtet. In der Ein-Orientierung wird das Licht entlang der optischen Achse gelenkt.

DMD eignet sich gut für die Lyse, da es sehr intensives UV-Licht toleriert, hohe Kontrastverhältnisse zwischen den Ein- und Aus-Pixeln erzeugt und in Dutzenden von Mikrosekunden zwischen den beiden Zuständen wechseln kann. Die Anwendung von DMDs für die biomedizinische Forschung wird durch den breiten Einsatz von Bildbearbeitungssoftware und -hardware sowie durch das kommerzielle Interesse im Bereich der Bilddarstellung unterstützt. Modulare Komponenten werden von Texas Instruments als DLP-Discovery-Kits vermarktet, die die unterstützenden elektronischen Treiber zur Anpassung des DMD an ein mikroskopisches System bereitstellen.

Grundlegende Konzepte zur Optik der Mikroskopie müssen verstanden werden. Das moderne Fluoreszenzmikroskop besteht aus einem Abbildungsweg und einem Beleuchtungsweg. Es besteht aus einem Objektiv, einem Filterwürfel und zwei unterschiedlichen Tubuslinsen für den Abbildungs- und Beleuchtungsweg.

Das Mikroskop ist so konzipiert, dass es Positionen hat, die zur Bildebene der Probe konjugiert sind, wobei Objekte, die in der Probenebene fokussiert sind, auch in diesen konjugierten Bildebenen im Fokus erscheinen. Eine logische Folge dieses Konzepts ist, dass jedes helle Bild, das auf der konjugierten Bildebene erzeugt wird, auch scharf auf die Probenbildebene projiziert wird. Diese Strategie wird verwendet, um ein computergeneriertes Beleuchtungsmuster auf die Probe zu projizieren.

Der Laserstrahl dient als sehr helle Lichtquelle, die das Muster beleuchtet, das von den Mikrospiegeln auf den DMD-Chips auf einer konjugierten Bildebene implementiert wird. Das Design eines DMD-Beleuchtungssystems hängt von den Anregungslichtern ab, die für optogenetische Experimente verwendet werden, bei denen Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich verwendet wird. Das beleuchtete Muster kann durch den Kameraweg gebracht werden.

Daher kann der DMD-Chip einfach auf einen von zwei Kameraanschlüssen eines Dual-Kamera-Port-Moduls montiert werden. Umgekehrt muss bei Experimenten, bei denen Licht im UV-Bereich verwendet wird, wie z. B. bei der Lyse von Käfigverbindungen, das Licht durch den Epi-Beleuchtungspfad gebracht und eine besser zugängliche konjugierte Bildebene erstellt werden. Dies liegt daran, dass die Bildtubuslinse nicht für die UV-Transmission ausgelegt ist.

Stattdessen wird die Leuchtröhrenlinse für die UV-Transmission verwendet und leistet eine adäquate Arbeit bei der Bilderzeugung. Jeder Mikrospiegel auf dem DMD kann zwischen einer positiven und einer negativen Neigung von 12 Grad relativ zur Ebene des Chips umschalten. Abhängig von der digitalen Eingabe, die er vom Computer erhält, verläuft die Drehachse entlang der diagonalen Ecken jedes Spiegels, 45 Grad zu den rechteckigen Seiten des Chips.

Die Ausrichtung der Spiegelneigung wird durch ein goldfarbenes Dreieck an einer Ecke auf der Vorderseite des Chips gekennzeichnet. Die Neigung des Mikrospiegels bestimmt die Ausrichtung der Tonhöhe und des Azimuts des einfallenden Beleuchtungsstrahls. Um den DMD zu beleuchten, konfigurieren Sie zunächst die Steigung des Beleuchtungsstrahls so, dass sie 24 Grad von der senkrechten Achse des DMD-Chips entfernt ist, und konfigurieren Sie den Azimut so, dass er senkrecht zur Drehachse des Spiegels steht.

Eine präzise Strahlausrichtung ist entscheidend für einen effizienten Betrieb. Für Lyseexperimente. Verwenden Sie eine Laserquelle, um den fokussierbaren Strahl mit hoher Intensität zu erzeugen, der für eine schnelle Entkopplung erforderlich ist.

Hier wird ein quasi kontinuierlicher diodengepumpter Festkörperfrequenzlaser mit verdreifachter ND-Geschwindigkeit verwendet, wobei ein relativ leistungsstarker Laser verwendet wird, da nur ein kleiner Bruchteil der Laserleistung tatsächlich an die Probe abgegeben wird. Wenn Sie ein DMD-System verwenden, starten Sie die Ausgabe des Lasers in eine Multimode-Faser, damit sie leicht positioniert und entlang der richtigen Achse ausgerichtet werden kann, um das DMD zu beleuchten und eine Lösung für das Speckle zu finden. Problem, das durch kohärente Beleuchtung erzeugt wird, überträgt das Licht durch die optische Faser.

Die Faser wird um einen Pazo-Elektrofaserspanner gewickelt, der dazu angetrieben wird, sie um 40 Kilohertz zu schwingen. Die mikroskopische Dehnung der Faser reicht aus, um das Speckle-Muster während der Millisekundendauer jedes Photostimulationsimpulses viele Male zu verschieben und so das Speckling effektiv zu eliminieren. Schließlich wird der Ausgang der optischen Faser mit einem UV-Mikroskop-Objektiv zusammengeführt, um die DMDs zu beleuchten und das CCD-Pixel mit der DMD-Bildsoftware zu coregistrieren, die einzelne DMD-Spiegel mit bestimmten Pixeln der abbildenden CCD-Kamera korreliert.

Die grafische Benutzeroberfläche innerhalb der Software ermöglicht es dem Benutzer, mit der Computermaus über die grafische Benutzeroberfläche die DMD-Spiegelausrichtung zuzuweisen, die dem Bereich auf dem CCD-Bild entspricht. Markieren Sie den Ort für die Photostimulation, indem Sie den Cursor über das auf dem Computerbildschirm angezeigte Bild bewegen und auf den markierten Bereich von Interesse klicken, um den Speicher für Lichtabgabemuster zu programmieren. Das Muster, das auf dem Computerbildschirm als eine Reihe separater Bilder markiert ist, programmiert das Timing der Laserpulse für jedes räumliche Muster in die Software.

Dies wird in das Datenerfassungsprogramm P clamp integriert. Verwenden Sie schließlich das Datenerfassungsprogramm, um das Timing der DMD-Elektronik, das Gating des Lasers und die Erfassung des gepatchklemmten elektrischen Signals vom Zielneuron zu koordinieren. Hier wird eine Kalibrierung der optischen Systemauflösung gezeigt.

Die minimale Spotgröße wird als gemessen von einem fluoreszierenden Target angezeigt. Die effektive physiologische Auflösung wird durch die Amplitude des Stromflusses in Abhängigkeit von der Photostimulation gemessen. Hier wurde ein eingesperrtes Glutamat neben einem dendritischen Ast mit einem Durchmesser von zwei Mikrometern photomatisiert.

Als der Platz verschoben wurde. Orthogonal über das Gitter sind elektrische Reaktionen auf Photostimulation unterschiedlicher Intensität dargestellt. Spannungsklemmenreaktionen in Abhängigkeit von der Lyseintensität sind dargestellt.

Die verteilte dendritische Stimulation kann mit einem DMD-basierten System einfach implementiert werden. Hier wurde die Eingangsintensität variiert, indem die Anzahl der als Kreise markierten Stimulationspunkte auf den beiden dendritischen Ästen erhöht wurde. Die räumliche Summierung kann über Verzweigungspunkte hinweg nichtlinear sein.

Es wird zunehmend superlinear mit zunehmenden Eingangsamplituden, die an den beiden Türen zu den Abzweigungen ankommen. Diese Ergebnisse veranschaulichen deutlich die nichtlineare Art und Weise der Summierung über dendritische Verzweigungspunkte. Die Superlinearität wird weitgehend durch NMDA-Rezeptoren und nicht durch spannungsgesteuerte Kanäle vermittelt.

Dies kann demonstriert werden, da die Anwendung von zwei NMDA-Antagonisten, A PV und MK 8 0 1, das nichtlineare Verhalten weitgehend eliminiert. Wir haben Ihnen gerade das grundlegende Design und die Funktionsweise eines DMD-basierten Systems zur Muster-Photostimulation von Nervengewebe gezeigt. Das System kann für die Stimulation mit sichtbarem Licht angepasst werden, wie sie beispielsweise für optogenetische Experimente verwendet wird.

Es kann auch adaptiv für nahes UV-Licht sein, wie es für die Einzelphotonenlyse verwendet wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass, wenn ein Licht mit einer Wellenlänge von weniger als 400 Nanometern verwendet werden soll und die meisten Menschen den Epi-Beleuchtungspfad durchlaufen, diese präzise Ausrichtung des Beleuchtungsstrahls innerhalb weniger Grad entscheidend ist, und dass bei Verwendung eines kohärenten Lichts Fleckenbildung effektiv beseitigt werden muss. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.