Name: Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Lernen Sie die robotergestützte Inokulation von Metagenombibliotheken auf Membranfilter für genomische Hochdurchsatz-Screenings. Diese Methode ermöglicht präzise Platzierung von 10.000 Kolonien mit hoher Reproduzierbarkeit.

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1. Hybridisierung Verfahren Eine Hybridisierung Rohr dauert 1 oder 2 Membranen (Größe 22 x 22 cm). Verwenden Sie 50 ml der Hybridisierung Mischung und 0,5 mg DNA-Sonde (10 ng / ml Endkonzentration) pro Hybridisierung Röhre. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit Gel-gereinigtes DNA als Sonde. Wenn Scaling-up-Sonde Vorbereitung, Erhöhung der Anzahl der Röhren anstatt die Erhöhung der Menge von Reagenzien pro Röhre. Probe Vorbereitung (0,5 mg DNA): <ol><li> Verdünnen Sie 15 ul Vernetzer-Lösung mit 60 l Wasser. </li><li> Verdünnen DNA zu 10 ng / ul mit Wasser auf 50 ul Gesamtvolumen in einem Schraubverschluss Mikroröhrchen. </li><li> Denaturieren DNA für 5 min in kochendem Wasser. </li><li> Schnell auf Eis zu übertragen und lassen Sie für 5 min abkühlen lassen. Spin kurz. </li><li> Dann werden 50 ul Reaktionspuffer und vorsichtig mischen. </li><li> Add 10 ul Markierungsreagens und vorsichtig mischen. </li><li> Dann werden 50 ul der verdünnten Vernetzer-Lösung aus Schritt 1 und vorsichtig mischen. Vortexen und Spin kurz. </li><li> Bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Keep on ice für bis zu 2 h oder fügen Sie ein gleiches Volumen von 100% Glycerin und bei -20 ° C. Hinweis: Verwenden Sie das Wasser mit dem Kit geliefert. Bewahren Sie alle Reagenzien auf Eis soweit nicht anders angegeben. </li></ol> Präparation und Hybridisierung <ol><li> Vorheizen 50 ml Hybridisierungspuffer und Hybridisierung Rohr bis 60 ° C. </li><li> Fügen Sie die Hybridisierungspuffer auf die Hybridisierung Röhre. Roll up-Membran (s) und fügen Sie die Hybridisierung Röhre. (Wenn man 2 Membranen pro Röhre, zuerst aufrollen einer Membran vollständig, dann rollen die andere Membran auf der Oberseite in die gleiche Richtung.) </li><li> Inkubieren Hybridisierung Rohr bei 60 ° C für mindestens ½ h. (Stellen Sie sicher, Membran (en) gründlich zu bekommen getränkt.) </li><li> Transfer ca. 1 ml Hybridisierungspuffer mit einer langen Pipette aus der Hybridisierung Rohr auf die Tube mit der markierten Sonde. Vortexen und Spin kurz. Transfer-Mischung zurück zur Hybridisierung Röhre. </li><li> Inkubation bei 60 ° C über Nacht. Hinweis: Verwenden einer Pinzette und Handschuhe beim Umgang mit Membranen. Mix Inhalt der Hybridisierung Röhrchen leicht, weil zu viel Unruhe verursachen permanente Bildung von unerwünschten Schaum. Die Membranen sollten im nassen Zustand hinzugefügt werden; einweichen in Hybridisierungspuffer oder Wasser, wenn nötig und abtropfen überschüssige Flüssigkeit vor der Zugabe. </li></ol> 2. Nachweisverfahren Washing Membranen <ol><li> Vorheizen primären Waschpuffer bis 60 ° C. (Verwenden Mikrowelle und / oder Heizplatte.) </li><li> Wenn es 2 Membranen in einer Hybridisierung Rohr, Transfer einer Membran auf eine saubere, vorgewärmte, leere Hybridisierung Röhre. </li><li> Kurz spülen Hybridisierung Rohr mit etwa 50 ml des primären Waschpuffer. </li><li> Fügen Sie etwa 100 ml des primären Waschpuffer Hybridisierung Rohr und Inkubieren bei 60 ° C für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4. </li><li> Transfer-Membran Spülbehälters und inkubieren mit mindestens 250 ml des sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6. Hinweis: Die Membranen können in der sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur aufbewahrt werden bis zu ½ h vor Signalerzeugung. </li></ol> Signalerzeugung und Detektion (Verfahren für eine Membran) <ol><li> Band zwei Stücke von SaranWrap flach auf die Tischplatte (für Stufe 2 und eine für Schritt 4). </li><li> Sorgfältig abtropfen überschüssige Puffer von der Membran durch Berühren der Ecken der Membran gegen die Seite des Behälters und der Membranfilter auf die SaranWrap (sample Seite nach oben). </li><li> Gießen Sie 6-7 ml der ECF-Reagenz über Membran und falten Saran Wrap über Membran. Sorgfältig verteilen ECF Reagenz über Membran durch leichtes Verschieben einer Kimwipe über die SaranWrap. Inkubieren für 5 min. </li><li> Ablassen über ECF-Reagenz von der Membran und übertragen sie auf neue SaranWrap, Falteinschlag über Membran, und die Ränder mit Klebeband. Decken Sie die Membran mit Aluminiumfolie. Inkubieren für 1-2 Stunden. </li><li> Bereiten Sie den Scanner Glasplatte durch die Verteilung von 1-2 ml ECF-Reagenz auf die Glasplatte. Übertragen Sie anschließend die Membran auf die Glasplatte (sample Seite nach unten) und verteilen noch 1-2 ml ECF-Reagenz über die Membran. Overlay mit SaranWrap und vorsichtig drücken alle Luftblasen entfernt von der Membran. (Sie können statt einer steifen Platte auf der Oberseite des SaranWrap die Membran gegen die Glasplatte gedrückt halten.) </li><li> Verwenden Sie den Fuji FLA-5100 Fluoreszenz-Scanner (&quot;1-Laser 1 Bild&quot;-Modus) mit folgenden Einstellungen: Anregung 473 nm, Filter zur Erkennung von LPB (510 nm), Auflösung 50 um, 16-Bit-Signal Abschluss CH1 400 V. (Scan dauert ca. 15-20 min pro Membran der Größe 22 x 22 cm.) Optional: </li><li> Lassen Sie es 2-4 Stunden (oder länger). </li><li> Wiederholen Sie scannen wie in Schritt 6. </li></ol> 3. Stripping-und Speichervorgang (NUF Version) <ol><li> Transfer-Membran zu 100% ethanol und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Ersetzen Sie mit frischen 100% Ethanol und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. (Membran kann in Ethanol für mehrere Tage zu bleiben.) </li><li> Ersetzen Ethanol mit destilliertem Wasser und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Add 100 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,5% SDS) zu einer Hybridisierung Rohr und vorsichtig mischen. Add-Membran. </li><li> Inkubation bei 80 ° C für 1 h. </li><li> Transfer-Membran, um eine saubere, leere Container. </li><li> Add 500 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,1% SDS) ein Becherglas und Wärme zu einem kräftigen Kochen in der Mikrowelle. </li><li> Gießen Sie die Nähe siedende 0,1% SDS-Lösung über die Membran und schonend für einige Minuten rühren. Lassen Sie sich auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Spülen Sie in mindestens 250 ml sterile 100 mM Tris pH 8 für mindestens 10 min. </li><li> Wrap-Membran in SaranWrap und sorgfältig zu schließen Kanten mit Bändern. Lagerung bei 4 ° C. (Membranen darf nie austrocknen.) </li></ol>

Das Strippen Verfahren nicht optimiert wurde. Allerdings ist das Stripping in der Anleitung des Herstellers (2 Wäschen je 10 min in 100% Ethanol, 1 Wäsche von 1 h bei 60 ° C in 0,5% SDS) gegeben unzureichend. Mindestens Inkubation über Nacht in 100% Ethanol ist notwendig, um den ECF Reaktionsprodukt aufzulösen; mehreren Tagen Inkubation in 100% Ethanol scheint keine negativen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Membran reprobe haben. Die vom Hersteller SDS-Behandlung scheint auch nicht ausreichen. NUF hat 1 h bei 80 ° C versuchte mit 0,5% SD...

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenombanken Archivierung großer Fragmente des angrenzenden genomischen Sequenzen von Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung. Erstellen eines vereinfachten Verfahrens für die Erstellung und Screening Metagenombanken ist daher für eine effiziente Hochdurchsatz-Untersuchungen der genetischen und metabolischen Eigenschaften von unkultivierten Mikroorganismen Assemblagen nützlich. Hier werden die wichtigsten Protokolle auf Video, was wir vorschlagen, ist die nützlichste Format für die genaue Beschreibung eines langen Prozesses, der abwechselnd hängt von Roboter-Instrumenten und (menschlichen) manuelle Eingriffe vorgestellt. Zunächst beschäftigten wir Robotik bis zur Bibliothek Klone auf High-Density-Makroarray Membranen, von denen jedes Duplikat Kolonien 20-4 384-well Platten-Bibliothek enthalten kann vor Ort. Automation ist für dieses Verfahren nicht nur für die Genauigkeit und Geschwindigkeit, sondern auch aufgrund der Miniaturisierung der Maßstab erforderlich, um die große Anzahl von Bibliotheks-Klone in sehr dichten räumlichen Anordnungen fit. Einmal erstellt, wir als nächstes gezeigt, wie die Makroarray Membranen für Gene von Interesse unter Verwendung von modifizierten Versionen der Standard-Protokolle für Sondenmarkierung, Membran-Hybridisierung und Signalerkennung gescreent werden können. Wir ergänzten die bildliche Darstellung dieser Verfahren mit ausführlichen schriftlichen Beschreibungen der einzelnen Schritte und die benötigten Materialien, die alle online verfügbar neben dem Video sind.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomische Bibliotheken archivieren große Fragmente kontinuierlicher genomischer Sequenzen von Mikroorganismen, ohne dass eine vorherige Kultivierung erforderlich ist. Die Erstellung einer ...

Unser Ziel besteht darin, Kolonien aus einigen dieser metagenomischen Bibliotheken auf Membranfiltern zu impfen, wobei jeder dieser Filter 10.000 Kolonien aufnehmen kann. Gerade legt Rums diesen Nylonfilter auf einen Block und glättet ihn leicht. Er befindet sich etwas in Flüssigkeit, das ist lediglich das Nährmedium Luria-Brühe.Und dann wird er diese angefeuchtete Membran auf den Roboter übertragen, der sie automatisch mit 10.000 Kolonien beimpft. Roboter sind für diese Art von Verfahren unerlässlich, da kein Mensch die Geduld oder Genauigkeit besitzt, 10.000 Kolonien auf eine solche Membran aufzutragen. Roboter gehören zu den Technologien, die die Genomforschung tatsächlich vorangebracht haben, indem sie es ermöglichen, sehr repetitive und räumlich feinskalige Vorgänge mit hoher Genauigkeit durchzuführen.Gerade richtet der Roboter die Fütterung dieser drei 84-Well-Platten ein, wobei jede Vertiefung in diesen drei 84-Well-Platten eine einzelne Kolonie aus der metagenomischen Bibliothek enthält. Derzeit sterilisiert der Roboter die Inokulationsnadeln, die er zum Auftragen auf die Membran verwenden wird. Dazu durchläuft er mehrere verschiedene Lösungen, darunter 70 % Ethanol, um die Nadeln zu sterilisieren. Anschließend werden diese Inokulationsnadeln in eine 84-Well-Platte getaucht, die alle Kolonien enthält.Jetzt werden sie durch Licht sterilisiert und getrocknet. Nachdem die Inokulationsnadeln getrocknet sind, wird eine Platte durch den Roboter geführt. Jede dieser Kolonien wird tatsächlich abgeprägt und dupliziert, was als Kontrolle dient.Wir suchen also tatsächlich nach zwei Kolonien, die identisch sind, um ein Signal aus der Hybridisierung zu erhalten. Nachdem alle diese Kolonien auf dem Filter aufgebracht wurden, wird sie erneut auf die Agarplatte übertragen, die hier zu sehen ist, und anschließend über Nacht bei 37 Grad C inkubiert.Was passiert, ist, dass die Kolonien jeweils wachsen und das, was man dort in Form eines Arrays sieht, sind 10.000 Kolonien auf einem Filter. Jede dieser Kolonien enthält natürlich viele, viele, viele Kopien der rekombinanten DNA, in diesem Fall der metagenomischen DNA. Diese stammt aus dem zentralen Nordpazifik, die wir hergestellt haben.Was Saltram als Nächstes tun wird, ist, die Membran in eine Reihe von Lösungen zu überführen. Die erste Lösung, in die er sie überführt, ist eine basische Lösung aus Natriumhydroxid, und diese wird die Kolonien lysieren. Im Wesentlichen löst sie die Zellwand auf und setzt die DNA frei, sodass die DNA mit dem Filter in Kontakt treten kann.Was hier geschieht, ist, dass alle Zellwände sämtlicher Bakterien in diesen Kolonien sich auflösen und die DNA nun frei vorliegt. Nach fünf Minuten in Natriumhydroxid werden die Filter dann überführt. Dies ist lediglich ein Platz, um sie vorübergehend abzulegen, da sie danach in kochenden Wasserdampf gebracht werden.Dies ist also der zweite Teil des Lysisschritts. Zunächst wurden die Zellen mit einer stark basischen Lösung aus Natriumhydroxid und dem Detergens Natriumlaurylsulfat behandelt. Nun werden diese Kolonien einer hohen Hitze ausgesetzt, Dampfhitze von hundert Grad Celsius.Die Kombination aus dieser Base und dem Detergens sowie dieser Hitze wird die Zellen vollständig lysieren, und die DNA wird auf dem Filter frei vorliegen. Nach fünf Minuten in den Dampfbädern wird der Filter in eine Neutralisierungslösung überführt. Die Neutralisierungslösung neutralisiert im Wesentlichen die Base, und anschließend wird der Filter getrocknet.Jetzt befindet sich dies in der Neutralisationslösung, und verbleibt dort weitere fünf Minuten. Danach wird der Filter auf Abtrockenpapier übertragen und üblicherweise über Nacht trocknen gelassen. Nachdem die Membranen mit den lysierten Zellen über Nacht getrocknet wurden, werden sie in eine Lösung aus Tris, EDTA und Proteinase K gegeben, wobei die Proteinase K dazu dient, sämtliche auf der Membran befindlichen Proteine zu entfernen.Sie sehen, dass das Rum umgedreht wurde, um sicherzustellen, dass alle diese Kolonien mit Protease K beschichtet werden. Dies wird einen Großteil des überflüssigen zellulären Materials und des Proteins verdauen. Nach einer einstündigen Inkubation in Protease K bei 37 Grad C werden die Membranen einfach aus der Lösung genommen und über Nacht auf Filterpapier getrocknet. Danach sind sie bereit für den nächsten Schritt, nämlich die Hybridisierung.Mein Name ist Vin fm. Ich bin Postdoktorand im Labor von Delong am MIT und verwende Makroarray-Technologie, um nach phylogenetischen Markern sowie funktionellen Genen zu screenen.Es wurde Ihnen gezeigt, wie diese Makroarray-Bibliotheken hergestellt wurden. Ich werde Sie nun durch den Rest des Verfahrens zur Durchführung der Screening-Methode führen. Hier ist ein Makroarray; bevor wir fortfahren können, müssen wir die DNA durch Vernetzung mit UV-Licht auf der Membran fixieren.Wir führen dies mit einem UV-Stratalinker durch, geben das hinein, stellen auf Autokreuzvernetzung ein und starten. Sobald die Vernetzung erfolgt ist, schneide ich die Membranen gerne in zwei Hälften. Ich mache dies, weil diese Membranen innerhalb dieser Hybridisierungsgefäße hybridisiert werden, und das Halbieren ermöglicht es, dass die gesamte innere Oberfläche der Membran vollständig der Hybridisierungslösung ausgesetzt ist.Sie können sehen, dass die Membran perfekt innerhalb des Röhrchens sitzt, ohne sich nach innen umzustülpen. Hier ist die Membran also gut im Hybridisierungsrohr untergebracht. Als Nächstes werde ich Hybridisierungspuffer hinzufügen.Mit der Sonde, die ich in diesem anderen Reagenzglas habe, das bei 60 Grad vorgewärmt wurde. Das ist meine bevorzugte Hybridisierungstemperatur. Bevor ich das tue, oder besser gesagt, während ich das tue, werde ich erklären, dass der Hybridisierungspuffer mit dem Nachweiskit vom Hersteller an uns gesandt wurde.Es handelt sich um Hybridisierungspuffer, den wir mit einem Blockierungsmittel supplementieren. Ebenfalls enthalten sind Phosphatpuffer, SDS, Magnesiumchlorid und Natriumchlorid sowie etwas Harnstoff. Gut. Als Nächstes geben wir dieses Röhrchen mit dem Hybridisierungspuffer, der Membran und der Sonde in den Hybridisierungsbrutschrank, den ich auf 60 Grad eingestellt habe, und lassen es über Nacht inkubieren – einrichten und vergessen.Nach einer idealerweise über Nacht erfolgten Inkubation ist es nun an der Zeit, die Membranen zu waschen, um jegliche ungebundene Sonde zu entfernen. Bei der Herstellung des Hybridisierungspuffers oder der Sonde werden keine gefährlichen Materialien verwendet. Daher ist es unbedenklich, die Lösung in den Ausguss zu entsorgen.Ich hole jetzt meinen primären Waschpuffer, der ebenfalls auf 60 Grad erwärmt wird. Er hat sich schön bei derselben Temperatur erhitzt, bei der die Membranen über Nacht hybridisiert wurden. Auch die Wäsche erfolgt bei derselben Temperatur.Sie führen normalerweise drei Waschschritte mit dem primären Waschpuffer durch, jeweils mit einer Inkubationszeit von etwa fünf bis 10 Minuten. Der Waschpuffer enthält keine radioaktiven oder bekannten gefährlichen Chemikalien; nach jedem Waschzyklus können Sie die Flüssigkeit einfach in den Ausguss entsorgen. Nach insgesamt drei Waschungen mit dem primären Waschpuffer bei 60 Grad ist dieser Schritt abgeschlossen.Jetzt sind die Membranen bereit für die zweite Wäsche, durch die die Membranen auf den richtigen pH-Wert für die Behandlung mit den ECF-Nachweischemikalien gebracht werden. Als Nächstes waschen wir die Membranen daher in Puffer für die zweite Wäsche bei Raumtemperatur. Nun können Sie Pinzetten verwenden, um die Membranen zu entfernen, oder – falls Sie sehr vorsichtig sind – können Sie auch Ihre behandschuhte Hand benutzen und die Membranen nur an der Rückseite oder an den Rändern anfassen, um zu vermeiden, dass Sie die Membranen mit Kontaminationen verschmieren, die sich an Ihren Händen oder sogar an den Handschuhen befinden könnten.Wir sollten die Membranen in einen Behälter überführen, der einen sekundären Waschpuffer enthält, der vorbereitet wurde und auf Raumtemperatur gebracht wurde. Legen Sie sie einfach gut und flach ab. Manchmal überlappen sich die Membranen, aber das ist nicht so wichtig.Beachten Sie, dass dieser spezielle Schritt lediglich den pH-Wert für die Membranen ausgleicht. Anschließend lassen Sie die Probe inkubieren. Falls gewünscht, können Sie eine leichte Schüttelbewegung durchführen.Ich habe festgestellt, dass dies weder besonders nützlich noch schädlich ist. Daher lasse ich es einfach erneut fünf bis zehn Minuten lang auf meinem Pult stehen und wiederhole dann die Sekundärwäsche ein zweites Mal. Die zweite Wäsche der Sekundärwäsche ist abgeschlossen.Jetzt ist es an der Zeit, die Detektion vorzubereiten und zu erweitern. Ich ziehe etwas Frischhaltefolie ab, und die Membranen werden auf die Frischhaltefolie gelegt, wobei die Öffnung für die Detektionsreagenzien nach oben zeigt. Anschließend wird die Frischhaltefolie darüber zurückgefaltet. So entsteht eine kleine, gut geschlossene Tasche, die das Detektionsreagenz hält.Hier haben wir unsere Membranen. Ich lasse überschüssiges Waschpuffer auf trockene Papiertücher abtropfen, einen Stapel davon, und lege die Membranen auf Parafilm aus. Sie haben eine vorgemischte ECF-Detektionslösung bereitstehen.Diese können normalerweise mehrere Monate lang im Gefrierschrank aufbewahrt werden; ich gieße die Reagenzien einfach auf die Membran. Ich falte das Übrige ein. So liefere ich die Verpackung mit.Und ich forme durch Einstecken der Enden oder Ränder eine kleine Tasche und schütze den gesamten Nachweisprozess mit etwas Aluminiumfolie. Auch das lasse ich etwa fünf bis zehn Minuten lang stehen. Nun ist es an der Zeit, die Nachweischemikalien aus dieser ersten Tüte abzulassen.Sie bemerken vielleicht, dass ich einen Teil der Haftfolie an meiner Arbeitsbank befestigt habe. Für Sie kann es oft hilfreich sein, dies ebenfalls zu tun, um das Anhaften zu verhindern, das Folie unweigerlich verursacht. Auch hier ist es hilfreich, durch Antippen auf einen Stapel Papiertücher abzutupfen und dann auf die frische, saubere, saubere Folie abzurollen, die Sie zuvor auf der Bank vorbereitet haben.Okay, die Nachweischemikalien sind größtenteils entfernt, also sind die Membranen bereit für eine zweistündige Inkubation, damit sich das Signal entwickeln kann. Es sind nun zwei Stunden vergangen, und wir sind bereit, das Signal auf unseren Membranen nachzuweisen. Dazu scannen wir die Membranen mit einem Fluoreszenzscanner, wobei wir die Membranen erneut nur an den Rändern anfassen.Was Ihnen möglicherweise nützlich erscheint, ist die Verwendung einer Pipette, um eventuelle Blasen zwischen der Membran und dem Glas herauszurollen. Nun sind wir bereit, die Abtastung durchzuführen. Richten Sie den Bereich ein, der auf der Frontplatte durch unsere Membranen bedeckt wurde, und scannen Sie bei vier und 73 Nanometern.Wenn Sie also einen fertigen Scan vergrößern, erhalten Sie etwas Ähnliches wie dieses Bild. Sie sehen ein Signal genau dort. Immer wenn Sie zwei entgegengesetzte Punkte haben, ist das ein Zeichen für ein positives Signal.Hier ist ein Beispiel, hier ist ein zweites Beispiel. Sobald Sie wissen, welcher Bereich der Membran das Signal aufweist, verfolgen Sie zurück, welcher Platte und welchen Vertiefungen das jeweilige Signal entspricht. Das verrät Ihnen, welcher Fo-Smidt das spezielle Gen trägt, das Sie mit Ihrer Untersuchung identifizieren wollten.Und sobald Sie das SMID identifiziert haben, können Sie nach Ihrem Gen suchen. Eine Möglichkeit besteht darin, das gesamte Insert des SMID zu sequenzieren und das Gen zu finden, das Sie interessiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Quelle: Kim, H. et al., Multi-Enzym-Screening mit einem Hochdurchsatz genetischen Enzym-Screening-System. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert eine genetische Screening-Methode zur Erkennung der Enzymexpression unter Verwendung metagenomischer Fosmidbibliotheken und chromogener Substrate. Die Durchflusszytometrie identifiziert und isoliert einzelne Zellen, die farbige Produkte produzieren, was eine Hochdurchsatzselektion aktiver enzymexpressiver Zellen ermöglicht.

Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

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Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Metagenomik wurde verwendet, um das Mikrobiom von Silage-Rinderfutter zu untersuchen. Die Analyse wurde durch Schrotflintensequenzierung durchgeführt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Viehfutter zu charakterisieren.

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Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

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Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Dieses Manuskript beschreibt einen zellbasierten Screening-Ansatz im Genommaßstab zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

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Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

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