Name: Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Lernen Sie die robotergestützte Inokulation von Metagenombibliotheken auf Membranfilter für genomische Hochdurchsatz-Screenings. Diese Methode ermöglicht präzise Platzierung von 10.000 Kolonien mit hoher Reproduzierbarkeit.

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1. Hybridisierung Verfahren Eine Hybridisierung Rohr dauert 1 oder 2 Membranen (Größe 22 x 22 cm). Verwenden Sie 50 ml der Hybridisierung Mischung und 0,5 mg DNA-Sonde (10 ng / ml Endkonzentration) pro Hybridisierung Röhre. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit Gel-gereinigtes DNA als Sonde. Wenn Scaling-up-Sonde Vorbereitung, Erhöhung der Anzahl der Röhren anstatt die Erhöhung der Menge von Reagenzien pro Röhre. Probe Vorbereitung (0,5 mg DNA): <ol><li> Verdünnen Sie 15 ul Vernetzer-Lösung mit 60 l Wasser. </li><li> Verdünnen DNA zu 10 ng / ul mit Wasser auf 50 ul Gesamtvolumen in einem Schraubverschluss Mikroröhrchen. </li><li> Denaturieren DNA für 5 min in kochendem Wasser. </li><li> Schnell auf Eis zu übertragen und lassen Sie für 5 min abkühlen lassen. Spin kurz. </li><li> Dann werden 50 ul Reaktionspuffer und vorsichtig mischen. </li><li> Add 10 ul Markierungsreagens und vorsichtig mischen. </li><li> Dann werden 50 ul der verdünnten Vernetzer-Lösung aus Schritt 1 und vorsichtig mischen. Vortexen und Spin kurz. </li><li> Bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Keep on ice für bis zu 2 h oder fügen Sie ein gleiches Volumen von 100% Glycerin und bei -20 ° C. Hinweis: Verwenden Sie das Wasser mit dem Kit geliefert. Bewahren Sie alle Reagenzien auf Eis soweit nicht anders angegeben. </li></ol> Präparation und Hybridisierung <ol><li> Vorheizen 50 ml Hybridisierungspuffer und Hybridisierung Rohr bis 60 ° C. </li><li> Fügen Sie die Hybridisierungspuffer auf die Hybridisierung Röhre. Roll up-Membran (s) und fügen Sie die Hybridisierung Röhre. (Wenn man 2 Membranen pro Röhre, zuerst aufrollen einer Membran vollständig, dann rollen die andere Membran auf der Oberseite in die gleiche Richtung.) </li><li> Inkubieren Hybridisierung Rohr bei 60 ° C für mindestens ½ h. (Stellen Sie sicher, Membran (en) gründlich zu bekommen getränkt.) </li><li> Transfer ca. 1 ml Hybridisierungspuffer mit einer langen Pipette aus der Hybridisierung Rohr auf die Tube mit der markierten Sonde. Vortexen und Spin kurz. Transfer-Mischung zurück zur Hybridisierung Röhre. </li><li> Inkubation bei 60 ° C über Nacht. Hinweis: Verwenden einer Pinzette und Handschuhe beim Umgang mit Membranen. Mix Inhalt der Hybridisierung Röhrchen leicht, weil zu viel Unruhe verursachen permanente Bildung von unerwünschten Schaum. Die Membranen sollten im nassen Zustand hinzugefügt werden; einweichen in Hybridisierungspuffer oder Wasser, wenn nötig und abtropfen überschüssige Flüssigkeit vor der Zugabe. </li></ol> 2. Nachweisverfahren Washing Membranen <ol><li> Vorheizen primären Waschpuffer bis 60 ° C. (Verwenden Mikrowelle und / oder Heizplatte.) </li><li> Wenn es 2 Membranen in einer Hybridisierung Rohr, Transfer einer Membran auf eine saubere, vorgewärmte, leere Hybridisierung Röhre. </li><li> Kurz spülen Hybridisierung Rohr mit etwa 50 ml des primären Waschpuffer. </li><li> Fügen Sie etwa 100 ml des primären Waschpuffer Hybridisierung Rohr und Inkubieren bei 60 ° C für 10 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4. </li><li> Transfer-Membran Spülbehälters und inkubieren mit mindestens 250 ml des sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 6. Hinweis: Die Membranen können in der sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur aufbewahrt werden bis zu ½ h vor Signalerzeugung. </li></ol> Signalerzeugung und Detektion (Verfahren für eine Membran) <ol><li> Band zwei Stücke von SaranWrap flach auf die Tischplatte (für Stufe 2 und eine für Schritt 4). </li><li> Sorgfältig abtropfen überschüssige Puffer von der Membran durch Berühren der Ecken der Membran gegen die Seite des Behälters und der Membranfilter auf die SaranWrap (sample Seite nach oben). </li><li> Gießen Sie 6-7 ml der ECF-Reagenz über Membran und falten Saran Wrap über Membran. Sorgfältig verteilen ECF Reagenz über Membran durch leichtes Verschieben einer Kimwipe über die SaranWrap. Inkubieren für 5 min. </li><li> Ablassen über ECF-Reagenz von der Membran und übertragen sie auf neue SaranWrap, Falteinschlag über Membran, und die Ränder mit Klebeband. Decken Sie die Membran mit Aluminiumfolie. Inkubieren für 1-2 Stunden. </li><li> Bereiten Sie den Scanner Glasplatte durch die Verteilung von 1-2 ml ECF-Reagenz auf die Glasplatte. Übertragen Sie anschließend die Membran auf die Glasplatte (sample Seite nach unten) und verteilen noch 1-2 ml ECF-Reagenz über die Membran. Overlay mit SaranWrap und vorsichtig drücken alle Luftblasen entfernt von der Membran. (Sie können statt einer steifen Platte auf der Oberseite des SaranWrap die Membran gegen die Glasplatte gedrückt halten.) </li><li> Verwenden Sie den Fuji FLA-5100 Fluoreszenz-Scanner (&quot;1-Laser 1 Bild&quot;-Modus) mit folgenden Einstellungen: Anregung 473 nm, Filter zur Erkennung von LPB (510 nm), Auflösung 50 um, 16-Bit-Signal Abschluss CH1 400 V. (Scan dauert ca. 15-20 min pro Membran der Größe 22 x 22 cm.) Optional: </li><li> Lassen Sie es 2-4 Stunden (oder länger). </li><li> Wiederholen Sie scannen wie in Schritt 6. </li></ol> 3. Stripping-und Speichervorgang (NUF Version) <ol><li> Transfer-Membran zu 100% ethanol und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Ersetzen Sie mit frischen 100% Ethanol und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. (Membran kann in Ethanol für mehrere Tage zu bleiben.) </li><li> Ersetzen Ethanol mit destilliertem Wasser und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Add 100 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,5% SDS) zu einer Hybridisierung Rohr und vorsichtig mischen. Add-Membran. </li><li> Inkubation bei 80 ° C für 1 h. </li><li> Transfer-Membran, um eine saubere, leere Container. </li><li> Add 500 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,1% SDS) ein Becherglas und Wärme zu einem kräftigen Kochen in der Mikrowelle. </li><li> Gießen Sie die Nähe siedende 0,1% SDS-Lösung über die Membran und schonend für einige Minuten rühren. Lassen Sie sich auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Spülen Sie in mindestens 250 ml sterile 100 mM Tris pH 8 für mindestens 10 min. </li><li> Wrap-Membran in SaranWrap und sorgfältig zu schließen Kanten mit Bändern. Lagerung bei 4 ° C. (Membranen darf nie austrocknen.) </li></ol>

Das Strippen Verfahren nicht optimiert wurde. Allerdings ist das Stripping in der Anleitung des Herstellers (2 Wäschen je 10 min in 100% Ethanol, 1 Wäsche von 1 h bei 60 ° C in 0,5% SDS) gegeben unzureichend. Mindestens Inkubation über Nacht in 100% Ethanol ist notwendig, um den ECF Reaktionsprodukt aufzulösen; mehreren Tagen Inkubation in 100% Ethanol scheint keine negativen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Membran reprobe haben. Die vom Hersteller SDS-Behandlung scheint auch nicht ausreichen. NUF hat 1 h bei 80 ° C versuchte mit 0,5% SD...

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenombanken Archivierung großer Fragmente des angrenzenden genomischen Sequenzen von Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung. Erstellen eines vereinfachten Verfahrens für die Erstellung und Screening Metagenombanken ist daher für eine effiziente Hochdurchsatz-Untersuchungen der genetischen und metabolischen Eigenschaften von unkultivierten Mikroorganismen Assemblagen nützlich. Hier werden die wichtigsten Protokolle auf Video, was wir vorschlagen, ist die nützlichste Format für die genaue Beschreibung eines langen Prozesses, der abwechselnd hängt von Roboter-Instrumenten und (menschlichen) manuelle Eingriffe vorgestellt. Zunächst beschäftigten wir Robotik bis zur Bibliothek Klone auf High-Density-Makroarray Membranen, von denen jedes Duplikat Kolonien 20-4 384-well Platten-Bibliothek enthalten kann vor Ort. Automation ist für dieses Verfahren nicht nur für die Genauigkeit und Geschwindigkeit, sondern auch aufgrund der Miniaturisierung der Maßstab erforderlich, um die große Anzahl von Bibliotheks-Klone in sehr dichten räumlichen Anordnungen fit. Einmal erstellt, wir als nächstes gezeigt, wie die Makroarray Membranen für Gene von Interesse unter Verwendung von modifizierten Versionen der Standard-Protokolle für Sondenmarkierung, Membran-Hybridisierung und Signalerkennung gescreent werden können. Wir ergänzten die bildliche Darstellung dieser Verfahren mit ausführlichen schriftlichen Beschreibungen der einzelnen Schritte und die benötigten Materialien, die alle online verfügbar neben dem Video sind.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Metagenomische Bibliotheken archivieren große Fragmente kontinuierlicher genomischer Sequenzen von Mikroorganismen, ohne dass eine vorherige Kultivierung erforderlich ist. Die Erstellung einer ...

Unser Ziel besteht darin, Kolonien aus einigen dieser metagenomischen Bibliotheken auf Membranfiltern zu impfen, wobei jeder dieser Filter 10.000 Kolonien aufnehmen kann. Gerade legt Rums diesen Nylonfilter auf einen Block und glättet ihn leicht. Er befindet sich etwas in Flüssigkeit, das ist lediglich das Nährmedium Luria-Brühe.Und dann wird er diese angefeuchtete Membran auf den Roboter übertragen, der sie automatisch mit 10.000 Kolonien beimpft. Roboter sind für diese Art von Verfahren unerlässlich, da kein Mensch die Geduld oder Genauigkeit besitzt, 10.000 Kolonien auf eine solche Membran aufzutragen. Roboter gehören zu den Technologien, die die Genomforschung tatsächlich vorangebracht haben, indem sie es ermöglichen, sehr repetitive und räumlich feinskalige Vorgänge mit hoher Genauigkeit durchzuführen.Gerade richtet der Roboter die Fütterung dieser drei 84-Well-Platten ein, wobei jede Vertiefung in diesen drei 84-Well-Platten eine einzelne Kolonie aus der metagenomischen Bibliothek enthält. Derzeit sterilisiert der Roboter die Inokulationsnadeln, die er zum Auftragen auf die Membran verwenden wird. Dazu durchläuft er mehrere verschiedene Lösungen, darunter 70 % Ethanol, um die

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Quelle: Kim, H. et al., Multi-Enzym-Screening mit einem Hochdurchsatz genetischen Enzym-Screening-System. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video demonstriert eine genetische Screening-Methode zur Erkennung der Enzymexpression unter Verwendung metagenomischer Fosmidbibliotheken und chromogener Substrate. Die Durchflusszytometrie identifiziert und isoliert einzelne Zellen, die farbige Produkte produzieren, was eine Hochdurchsatzselektion aktiver enzymexpressiver Zellen ermöglicht.

Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Dieses Manuskript beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Auswahl der Gelgröße zur Aufreinigung von DNA-Fragmenten für die Next-Generation-Sequenzierung. Die Ranger-Technologie ermöglicht die vollständige Automatisierung des gesamten Prozesses der Beladung des Agarosegels, der elektrophoretischen Analyse und der Rückgewinnung von DNA-Zielfragmenten und ermöglicht so einen hohen Durchsatz und eine hohe Qualität der Sequenzierungsbibliotheken der nächsten Generation.

Automatisierte Gel Größenauswahl, um die Qualität der nächsten Generation Sequencing Libraries von Umweltwasserproben vorbereitet verbessern

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

Metagenomik wurde verwendet, um das Mikrobiom von Silage-Rinderfutter zu untersuchen. Die Analyse wurde durch Schrotflintensequenzierung durchgeführt. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Viehfutter zu charakterisieren.

Metagenomanalyse von Silage

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Dieses Manuskript beschreibt einen zellbasierten Screening-Ansatz im Genommaßstab zur Identifizierung extrazellulärer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.

Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren mit Genom-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Lernen Sie die robotergestützte Inokulation von Metagenombibliotheken auf Membranfilter für genomische Hochdurchsatz-Screenings. Diese Methode ermöglicht präzise Platzierung von 10.000 Kolonien mit hoher Reproduzierbarkeit.

Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

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