Warum ist die Überlebenskurvenanalyse für die Validierung endokriner Signalwege wichtig?

Überlebenskurven quantifizieren die Reaktionen von Organismen auf chemische Exposition und ermöglichen den Nachweis von lebensverlängernden oder lebensverkürzenden Effekten, die eine Störung endokriner Signalwege widerspiegeln. Dies liefert einen funktionellen Endpunkt, um Zielstrukturen für mechanistische Folgeuntersuchungen zu priorisieren.

Wie verbessert die Kohortenisolierung die Konsistenz der Entdeckungspipeline?

Die Synchronisierung des Flugaustritts durch kontrollierte Eiablage und Entfernung der erwachsenen Tiere minimiert die Entwicklungsheterogenität und stellt sicher, dass beobachtete Unterschiede in der Lebensdauer auf experimentellen Bedingungen und nicht auf Altersunterschieden beruhen. Dies erhöht die Reproduzierbarkeit des Assays über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.

Was ermöglicht den quantitativen Vergleich von Gruppen mit chemischer Exposition?

Die regelmäßige Erfassung toter Fliegen ermöglicht die Berechnung von Überlebensraten, die grafisch dargestellt werden, um mittlere Überlebenskurven für jede Bedingung zu erstellen. Diese Kurven ermöglichen den statistischen Vergleich der medianen Lebensdauer und der Sterblichkeitsraten.

Warum sind Experimente mit Wiederholungen für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg unerlässlich?

Mindestens drei unabhängige Wiederholungen der Experimente stellen sicher, dass die Überlebensentwicklungen robust sind und nicht durch zufällige Schwankungen verursacht werden, wodurch die Toxikologieteams sicher sein können, die Daten mit den Pathologie- und Zulassungsgruppen zu teilen. Die Wiederholung der Experimente unterstützt die Übereinstimmung hinsichtlich der Sicherheitsprofile der Verbindungen.

Welche statistischen Ausgaben sind vor der Durchführung einer Lebensdauerscreening erforderlich?

Die Erstellung von Überlebenskurven erfordert die Berechnung der mittleren Überlebensraten über die Wiederholungen hinweg, um statistische Tests wie die Log-Rang-Analyse durchführen zu können, mit denen signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen bestimmt werden. Dies dient als Entscheidungsgrundlage für Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Sicherheitsbewertung.

Lebensdauerprotokoll für Drosophila melanogaster: Generierung von Überlebenskurven zur Identifizierung von Unterschieden in der Langlebigkeit von Fliegen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biologie

0 Ansichten • 3:28 Min. • April 30th, 2023

- Beginnen Sie mit der gemeinsamen Unterbringung einer bestimmten Anzahl männlicher und weiblicher Fruchtfliegen von Drosophila melanogaster in einem Fläschchen mit Maismehlmedium. Dies ermöglicht eine gleichbleibende Dichte an Nachkommen.

Lassen Sie die weiblichen Fliegen Eier legen. Entfernen Sie dann die erwachsenen Fliegen. Aus den Eiern werden innerhalb von 10 Tagen Larven, Puppen und schließlich erwachsene Fliegen. Neue Fliegen, die früher als ihre Kohorte auftauchen, sollten vor Tag 9 entfernt werden. Teilen Sie die nun synchronisierten Fliegen in Gruppen für die Kontroll- und Versuchsbedingungen ein. Die gemeinsame Unterbringung von männlichen und weiblichen Fliegen ermöglicht die Paarung, wodurch eine Variable beseitigt wird, die die Lebensdauer beeinflusst.

Teilen Sie die Fliegen nach einigen Tagen nach Geschlecht in Gruppen ein. Platzieren Sie eine gleiche Anzahl von Fliegen in die entsprechende Versuchsbedingung. Füllen Sie alle drei Tage die lebenden Fliegen in ein neues Fläschchen um und notieren Sie die Anzahl der toten Fliegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Fliegen abgestorben sind.

Nach mindestens drei Wiederholungsexperimenten stellen Sie den mittleren Prozentsatz der überlebenden Fliegen pro Tag dar, um für jede Bedingung mittlere Überlebenskurven zu erstellen. In diesem Beispiel sehen wir, wie Überlebenskurven für Kohorten erstellt werden, die mit endokrin wirksamen Chemikalien behandelt wurden.

- Im Lebensspannenprotokoll werden zunächst 20 Fläschchen mit acht Weibchen und vier Männchen aufgestellt, die jeweils mit 10 Millilitern Maismehl gefüllt sind, und bei 25 Grad Celsius gelagert. Entsorgen Sie die Fliegen nach vier Tagen und stellen Sie die Fläschchen wieder in den Inkubator. Entfernen Sie am späten Nachmittag von Tag 9 alle neu geschlüpften Fliegen aus den Fläschchen und stellen Sie die Fläschchen wieder in den Inkubator.

Nach 16 bis 24 Stunden teilt man sich bei 250 einen Tag alten adulten Fliegen beiderlei Geschlechts unter leichter Kohlendioxid-Betäubung in vier Gruppen und überträgt sie auf 250-Milliliter-Flaschen mit adulter mittlerer Nahrung, drei mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen und eine mit dem EE2-Lösungsmittel allein. Halten Sie die Fliegen zwei bis drei Tage lang bei 25 Grad Celsius, damit sie sich paaren können. Sortieren Sie dann jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen. Unterteilen Sie jede Gruppe innerhalb jeder Behandlungsbedingung für beide Geschlechter nach dem Zufallsprinzip in fünf parallele Fläschchen mit einer Dichte von 20 Individuen pro Durchstechflasche. Bereiten Sie eine Lebensdauertabelle vor, in der die Anzahl der toten Fliegen von der Anzahl der überlebenden Fliegen aus dem vorherigen Transfer abgezogen wird, so dass die Anzahl der Überlebenden bei jedem Transfer automatisch ermittelt wird.

Nach drei Tagen werden die Fliegen ohne Betäubung in neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter umgefüllt und auf Tod geprüft. Notieren Sie das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen. Wiederholen Sie den Transfer alle drei Tage, bis alle Fliegen abgestorben sind.