Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle
April 26th, 2010
Wir präsentieren ein Protokoll zum Biegen filamentösen Bakterienzellen an eine Cover-Rutsch-Oberfläche mit einer optischen Falle auf die zelluläre Biegesteifigkeit zu messen.
Um die Biegesteifigkeit einzelner Coli-Zellen zu bestimmen, wachsen die Bakterien zunächst in die Exponentialphase und befestigen sie dann an einer chemisch behandelten Deckglasoberfläche. Lassen Sie die bereits an der Oberfläche anhaftenden Zellen weiter wachsen, so dass sie flexible Enden entwickeln. Als nächstes strömen Sie dielektrische Kügelchen ein, fangen Sie eine Raupe ein und biegen Sie sie zur flexiblen Spitze einer Zelle.
Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zelle mit der optischen Falle zu biegen und die resultierenden Daten der erzwungenen Verschiebung zu messen. Die Biegesteifigkeit der Zelle kann durch eine lineare Anpassung an die Daten der erzwungenen Verschiebung berechnet werden. Hallo, ich bin Steven Wong aus dem Labor von Professor Joshua Shere am Louis Sickler Institute of Integrative Genomics und dem Department of Physics der Princeton University.
Heute zeigen wir Ihnen in einem Verfahren des Biegens einzelner Eco-Zellen und der Steifigkeit der vermählten Zelle. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Beiträge verschiedener intrazellulärer Strukturen zur mechanischen Integrität der Bakterienzellen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.
Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie drei Milliliter aller E-Coli-Zellen in der LB-Medium bis zur exponentiellen Phase. Sobald die Zellen eine optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,2 und 0,4 erreicht haben, wird die Kultur 15 Minuten lang mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin ergänzt, um das filamentöse Wachstum zu induzieren. Während dieser 15 Minuten eine Strömungskammer herstellen.
Befestigen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einem Abstand von drei Millimetern zwischen den Teilen an einem Glasobjektträger und kleben Sie einen Deckslip darauf. Durch den Spalt zwischen den Klebebandstücken entsteht ein Kanal für fließende Flüssigkeit. Beschichten Sie das Deckglas mit PEI, indem Sie 10 Mikroliter 1%iges Polyethylen, verdünnt in Wasser, mit einer Mikropipette in die Durchflusskammer gießen und fünf Minuten lang inkubieren.
Waschen Sie dann, indem Sie an einem Ende der Kammer 200 Mikroliter Wasser einfließen lassen und am anderen Ende mit einem Vakuum auffangen. Nach 15 Minuten des Züchtens der Bakterien in Gegenwart von Cephalexin wird ein Milliliter Zellen in einer Mikrozentrifuge geschleudert und in 200 Mikrolitern LV mit Cephalexin resuspendiert. Als nächstes wird wieder eine Mikropipette an einem Ende verwendet und am anderen Ende vakuumiert, um 50 Mikroliter der konzentrierten Zellkultur in die Kammer zu fließen, in der das beschichtete Deckglas drei Minuten lang inkubiert wird.
Dann mit 50 Mikrolitern Vel B waschen, ergänzt mit Cephalexin. Um nicht gebundene Zellen zu entfernen, inkubieren Sie die Kammer 30 Minuten bis eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, damit die anhaftenden Zellen wachsen können, bevor Sie sie während der Inkubation auf das optische Fanginstrument legen. Bereiten Sie Polylysin-beschichtete Kügelchen vor, indem Sie drei Mikroliter Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 Mikrometern in einer von 0,1 %igen Polylysin, verdünnt in Wasser, 30 Minuten lang inkubieren.
Wenn die Kügelchen fertig inkubiert sind, waschen Sie sie dreimal, indem Sie sie in einer Mikrozentrifuge schleudern und in einem Milliliter Wasser wiederbeleben, fahren Sie fort, die Kügelchen an die Bakterien zu binden und die Bindungssteifigkeit der Zellen zu messen. Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, eine gute Zelle für die Messung von Biegung und Steifigkeit zu empfehlen, zu lokalisieren und zu erkennen. Und eine gute Zelle ist eine Zelle mit einem gut definierten festsitzenden Ende und einer freien Endstelle.
Die Strömungskammer am Mikroskop sucht nach einer Zelle mit einem gut definierten festsitzenden Ende. Einige Zellen sind nur an einer Spitze befestigt, und die Biegekraft an der anderen Spitze führt dazu, dass sich eine ganze Zelle dreht, anstatt sich zu biegen. Um eine geeignete Zelle zu finden, biegen Sie jede Zelle schnell mit der Falle, indem Sie die vom Joystick gesteuerte Tischbewegung verwenden.
Wenn eine geeignete Zelle gefunden wird, verdünnen Sie die Bead-Lösung um den Faktor zwei in lb mit Cephalexin, geben Sie 30 Mikroliter der Bead-Lösung in die Durchflusskammer, indem Sie in ein Ende pipettieren und am anderen Ende mit einem Kim-Tuch sanft ausfließen, fangen Sie eine schwimmende Perle optisch ein und berühren Sie sie mit der freien Spitze einer Zelle. Waschen Sie die Kammer erneut mit einer Mikropipette und verwenden Sie ein weißes Kim-Tuch mit 50 Mikrolitern Cephalexin in LB, um nicht anhaftende Kügelchen zu entfernen. Führen Sie als Nächstes ein benutzerdefiniertes Laboransichtsprogramm aus, um Biegekräfte auf die Zelle anzuwenden und die Daten zur erzwungenen Verschiebung aufzuzeichnen.
Kalibrieren Sie zunächst die Detektorantwort, indem Sie die angehängte Perle innerhalb des Detektionslaserstrahls scannen und die 3D-PSD-Spannungssignale aufzeichnen. Identifizieren Sie dann die Längsachse der Zelle in einem Mikroskopbild. Nachdem Sie die lange Zellenachse identifiziert haben, bewegen Sie die Zelle in Schritten in eine Richtung, die senkrecht zur langen Achse verläuft, während Sie den Zelldatensatz, den zurückgelegten Abstand und die Verschiebung der Perle von der Mitte der optischen Falle verschieben.
Konvertieren Sie abschließend die Verschiebungswerte in die aufgebrachte Kraft unter Verwendung der zuvor gemessenen Trap-Steifigkeit und speichern Sie. Die Verschiebung der Spitze und die Kraft zum Feilen sind hier erzwungene Verschiebungsdaten für eine einzelne Zelle. Die Steigung dieser Linie ist die Biegesteifigkeit der Zelle.
Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Biegesteifigkeit von E. coli mit einer optischen Falle verheiraten können. Wenn Sie dieses Verfahren anwenden, ist es wichtig, daran zu denken, eine gute Zelle mit einem gut definierten geklebten Ende und einem freien Ende zu finden. Das war's also.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Messung der Biegesteifigkeit von filamentösen Bakterienzellen mittels optischer Einfangtechniken vor. Die Methode beinhaltet das Wachstum von E. coli-Zellen, ihre Anbringung auf einem Deckglas und das Anwenden von Biegekräften zur Beurteilung ihrer mechanischen Eigenschaften.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Biophysik
- Zellmechanik
Hintergrund
- Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Bakterienzellen ist entscheidend für Einblicke in ihr Verhalten und ihre Integrität.
- Filamentöses Wachstum von E. coli kann induziert werden, um ihre Biegesteifigkeit zu untersuchen.
- Optische Fallen bieten eine nicht-invasive Methode, um Kräfte auf einzelne Zellen auszuüben.
- Frühere Studien haben sich auf die mechanische Integrität von Zellen unter verschiedenen Bedingungen konzentriert.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls zur Messung der Biegesteifigkeit von E. coli-Zellen.
- Untersuchung der Beiträge intrazellulärer Strukturen zur Zellmechanik.
- Verbesserung des Verständnisses des Verhaltens von Bakterienzellen unter mechanischer Belastung.
Verwendete Methoden
- Zucht von E. coli-Zellen in LB-Medium bis zur exponentiellen Phase.
- Induktion filamentösen Wachstums mittels Cephalexin.
- Anbringung der Zellen auf einem chemisch behandelten Deckglas.
- Verwendung optischer Fallen zum Ausüben von Biegekräften und Messen von Verschiebungsdaten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll misst erfolgreich die Biegesteifigkeit einzelner E. coli-Zellen.
- Die Datenanalyse zeigt die Beziehung zwischen aufgebrachter Kraft und Zellverschiebung.
- Die Identifizierung geeigneter Zellen für die Messung ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Bakterienzellmechanik bei.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ist effektiv für die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Bakterienzellen.
- Optisches Einfangen ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Zellsteifigkeit.
- Zukünftige Studien können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um weitere Aspekte der Zellmechanik zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
