Name: Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Lernen Sie die Messung der Biegesteifigkeit von E. coli-Zellen mit einer optischen Falle. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Zelleigenschaften und intrazellulärer Strukturen.

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Wir erkennen an, hilfreiche Ratschläge von Mingzhai Sonne auf verbindliche Zellen an Oberflächen. Wir bedanken uns bei Ned Wingreen und Zemer Gitai für wertvolle Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren P50GM07150, National Science Foundation CAREER-Preis PHY-0844466 und der Alfred P. Sloan Foundation unterstützt.

<ol><li> Wachsen E. coli-Zellen in Luria-Beltrani Brühe (LB)-Medium zu exponentiellen Phase (OD = 0.2-0.4). </li><li> Die Kultur in LB mit 50 pg / ml Cephalexin für 15 min auf filamentösen Wachstum zu induzieren ergänzt, und dann konzentrieren sich die Kultur durch 5-mal durch Zentrifugation. </li><li> Machen PEI-beschichteten Deckglas durch fließendes 1% Polyethylenimin in Wasser in einer Flusskammer verdünnt und mit Wasser waschen nach einer 5-minütigen Inkubation. </li><li> Flow die konzentrierte Zellkultur in die Kammer, und wusch mit einer Mischung aus LB und Cephalexin (50μg/mL) nach 3 min zu losen Zellen zu entfernen. </li><li> Inkubieren der Kammer bei 37 ° C für 30 min-1 Stunde, damit die anhaftenden Zellen wachsen, bevor sie auf die optische Fallen Instrument. </li><li> Machen Polylysin-beschichteten Kügelchen durch Inkubation 0,5-um-Durchmesser Polystyrolkügelchen (Bangs Labs) in 0,1% Polylysin in Wasser für 30 min verdünnt. Dann waschen Sie die Perlen 3-mal und resuspendieren in Wasser. </li><li> Verdünnen Sie die Bead-Lösung um den Faktor zwei in LB mit Cephalexin (50μg/mL), und fügen Sie ihn in die Strömungskammer. </li><li> Optisch Falle einer schwimmenden Kügelchen, und tippen Sie auf die freie Spitze einer Zelle. (Wir verwenden ein Mad City Labs Piezo-Bühne, um der Bewegung der Probe zu kontrollieren.) Wenn ein geeigneter Perlen / Zell Kombination gefunden wird, waschen Sie die Kammer mit Cephalexin in LB (50μg/mL) zu losen Perlen zu entfernen. </li><li> Run individuell geschriebenen LabView Programm Biegekräfte zu Zelle und nehmen Kraft-Weg-Daten gelten. Programmdetails <ol class="lalpha"><li> Kalibrieren Detektor-Response durch Rastern der beigefügten Perle innerhalb der Detektionslaserstrahl und Aufzeichnung 3D PSD Spannungssignale. </li><li> Identifizieren Zelle langen Achse in mikroskopischen Bild. </li><li> Bewegen Zelle in Schritten in eine Richtung senkrecht zu der Zelle Längsachse. </li><li> Notieren Sie sich die Wegstrecke und die Verschiebung von der optischen Falle. </li><li> Convert Verschiebung nach Krafteinwirkung mit der zuvor gemessenen Falle Steifigkeit und sparen Spitze Vertreibung und Gewalt in eine Datei. </li></ol></li></ol> Secrets to Success: In Schritt 8), muss man eine Zelle mit einem gut definierten stecken Ende finden. Einige Zellen sind nur an einer Spitze, und die Biegekraft auf die andere Spitze stecken führt zu einer whole-cell schwenkbare anstatt Biegen. Ein geeignetes Paar ist durch Biegen jede Zelle schnell von Hand mit dem Joystick-gesteuerten Phase Bewegung gefunden. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Diese Abbildung zeigt Kraft-Weg-Daten für eine einzelne Zelle. Die Steigung dieser Geraden ist die Biegesteifigkeit der Zelle.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

Das Protokoll hier vorgestellten dient zur quantitativen Messung der Biege-Eigenschaften von Bakterienzellen. Der Versuchsaufbau kann auf jeden stabförmigen Zelle, die aus bis filamentös wachsen kann angewendet werden. Wir haben dieses Setup verwendet, um die Auswirkungen der Filamente des Zytoskeletts auf die Biegesteifigkeit der E.-Sonde coli-Zellen. Die gleiche Technik kann verwendet werden, um die Rollen der Druck, Zellwand Steifigkeit und anderen intrazellulären Komponenten bei der Bestimmung insgesamt Biegesteifigkeit von Zellen zu evaluieren.

<table><tbody><tr><td>Cephalaxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polylysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrolkügelchen mit 0,5-&amp;mu;m-Durchmesser</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>Nano-LP Series-Nanopositioniersystem</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

die messung der biegesteifigkeit von bakterienzellen mit einer optischen falle

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Wir entwickelten ein Protokoll, um die Biegesteifigkeit des filamentösen stäbchenförmige Bakterien zu messen. Kräfte werden mit einer optischen Falle, eine mikroskopisch kleine dreidimensionale Frühjahr aus Licht, die entsteht, wenn ein hoher Intensität Laserstrahl auf einen sehr kleinen Punkt wird durch ein Mikroskop das Ziel fokussiert angewendet wird. Zum Biegen einer Zelle, binden wir zuerst lebenden Bakterien zu einer chemisch behandelten Deckglas. Da diese Zellen wachsen, bleibt die Mitte der Zellen gebunden an das Deckglas, sondern die wachsende Enden sind frei von dieser Zurückhaltung. Durch die Induktion filamentösen Wachstums mit dem Medikament Cephalexin, sind wir in der Lage, Zellen, in denen ein Ende der Zelle an die Oberfläche geklebt wurde identifiziert, während das andere Ende blieb ungebunden und anfällig für Biegekräfte. Ein Biegekraft wird dann mit einer optischen Falle durch Bindung eines Polylysin-beschichtete Kügelchen an der Spitze einer wachsenden Zelle angewendet. Sowohl die Kraft und die Verschiebung der Kügelchen werden aufgezeichnet und die Biegesteifigkeit der Zelle ist die Steigung dieser Beziehung.

Wir präsentieren ein Protokoll zum Biegen filamentösen Bakterienzellen an eine Cover-Rutsch-Oberfläche mit einer optischen Falle auf die zelluläre Biegesteifigkeit zu messen.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

Wir haben ein Protokoll zur Messung der Biegesteifigkeit von filamentösen, stäbchenförmigen Bakterien entwickelt. Die Kräfte werden mit einer optischen Falle, einer mikroskopischen ...

Um die Biegesteifigkeit einzelner coli-Zellen zu bestimmen, züchten Sie zunächst die Bakterien in die exponentielle Phase und heften Sie sie dann an eine chemisch behandelte Deckglasoberfläche. Lassen Sie die bereits an der Oberfläche angehefteten Zellen weiterwachsen, sodass sie flexible Enden ausbilden. Danach leiten Sie dielektrische Kügelchen ein, fangen ein Kügelchen ein und biegen es an die flexible Zellspitze heran.Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zelle mit der optischen Falle zu verbiegen und die resultierenden Kraft-Weg-Daten zu messen. Die Biegesteifigkeit der Zelle kann durch eine lineare Anpassung an die Kraft-Weg-Daten berechnet werden. Hallo, ich bin Steven Wong aus dem Labor von Professor Joshua Shere am Louis-Sickler-Institut für Integrative Genomik und der Abteilung für Physik an der Princeton University.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Verbiegung einzelner Bakterienzellen und zur Bestimmung der Zellsteifigkeit. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um den Beitrag verschiedener intrazellulärer Strukturen zur mechanischen Stabilität von Bakterienzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie drei Milliliter beliebiger E. coli-Zellen in LB-Medium bis zur exponentiellen Phase. Sobald die Zellen eine optische Dichte bei 600 Nanometern zwischen 0,2 und 0,4 erreicht haben, geben Sie dem Kulturmedium 50 Mikrogramm pro Milliliter Cephalexin für 15 Minuten zu, um ein fadenförmiges Wachstum zu induzieren. Während dieser 15 Minuten stellen Sie eine Flusskammer her.Befestigen Sie zwei Stücke doppelseitiges Klebeband mit einem Abstand von drei Millimetern zueinander auf einem Objektträger und kleben Sie eine Deckglasplatte darauf. Der Spalt zwischen den Klebebandstücken bildet einen Kanal für fließende Flüssigkeit. Beschichten Sie das Deckglas mit PEI, indem Sie 10 Mikroliter einer 1 %igen Polyethalin-Lösung, die in Wasser verdünnt ist, mit einer Mikropipette in die Flusskammer einleiten und fünf Minuten lang inkubieren.Anschließend waschen, indem man an einem Ende der Kammer 200 Mikroliter Wasser zuführt und am anderen Ende mit Vakuum auffängt. Nach 15 Minuten Wachstum der Bakterien in Gegenwart von Cephalexin eine Milliliter Zellkultur in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und in 200 Mikroliter LV mit Cephalexin resuspendieren. Danach erneut einen Mikropipettierer an einem Ende und Vakuum am anderen Ende verwenden, um 50 Mikroliter der konzentrierten Zellkultur in die Kammer mit dem beschichteten Deckglas zu leiten, und drei Minuten lang inkubieren.Anschließend mit 50 Mikrolitern Vel B, ergänzt mit Cephalexin, waschen. Um nicht angeheftete Zellen zu entfernen, die Kammer bei 37 Grad Celsius 30 Minuten bis eine Stunde lang inkubieren, damit sich die angehefteten Zellen vermehren können, bevor sie während der Inkubation auf das optische Fanginstrument gebracht werden. Polylysin-beschichtete Kügelchen durch Inkubation von drei Mikrolitern Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 Mikrometern in einer 0,1-%-Polylysin-Lösung, die in Wasser verdünnt wurde, für 30 Minuten herstellen.Wenn die Inkubation der Kügelchen abgeschlossen ist, waschen Sie diese dreimal, indem Sie sie in einer Mikrozentrifuge abzentrifugieren und in einem Milliliter Wasser resuspendieren. Fahren Sie dann fort, indem Sie die Kügelchen an die Bakterien binden lassen und die Biegesteifigkeit der Zellen messen. Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls besteht darin, eine geeignete Zelle für die Messung der Biegesteifigkeit finden, erneut lokalisieren und erkennen zu können. Eine geeignete Zelle weist ein klar definiertes befestigtes Ende und ein freies Ende auf.Suchen Sie im Mikroskop den Flusskammer nach einer Zelle mit einem gut definierten, festen Ende. Einige Zellen sind nur an einer Spitze befestigt, und die Biegekraft an der anderen Spitze führt dazu, dass sich die gesamte Zelle dreht, anstatt sich zu verbiegen. Um eine geeignete Zelle zu finden, biegen Sie jede Zelle schnell mit der Falle, indem Sie die bewegliche Stufe über den Joystick steuern.Wenn eine geeignete Zelle gefunden wurde, verdünnen Sie die Perlenlösung im Verhältnis 1:2 in LB mit Cephalexin, geben 30 Mikroliter der Perlenlösung in die Durchflusskammer, indem Sie sie an einem Ende pipettieren und am anderen Ende vorsichtig mit einem Kim-Wipe-Tuch abfließen lassen. Fangen Sie eine frei schwebende Perle mit einer optischen Falle ein und berühren Sie damit die freie Spitze einer Zelle. Spülen Sie die Kammer erneut mit einer Mikropipette und einem Kim-White-Tuch mit 50 Mikrolitern Cephalexin in LB aus, um nicht gebundene Perlen zu entfernen. Führen Sie anschließend ein benutzerdefiniertes, in LabVIEW geschriebenes Programm aus, um Biegekräfte an die Zelle anzulegen und die Kraft-Dehnungs-Daten aufzuzeichnen.Zunächst kalibrieren Sie die Detektorantwort, indem Sie die befestigte Perle innerhalb des Detektionslaserstrahls mit einer RA-Abtastung scannen und die 3D-PSD-Spannungssignale aufzeichnen. Anschließend identifizieren Sie die Längsachse der Zelle in einem Mikroskopbild. Nach der Bestimmung der langen Zellachse bewegen Sie die Zelle schrittweise in einer Richtung senkrecht zur Längsachse, während Sie die zurückgelegte Distanz und die Verschiebung der Perle vom Zentrum der optischen Falle aufzeichnen.Konvertieren Sie abschließend die Verschiebungswerte mithilfe der zuvor gemessenen Fallensteifigkeit in die aufgebrachte Kraft und speichern Sie diese. Die hier in die Datei geschriebenen Werte für Spitzenverschiebung und Kraft stellen Kraft-Verschiebungs-Daten für eine einzelne Zelle dar. Die Steigung dieser Geraden entspricht der Biegesteifigkeit der Zelle.Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man die Biegesteifigkeit von E. coli mit einer optischen Falle kombiniert. Bei Verwendung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine geeignete Zelle mit einem klar definierten festen und einem freien Ende zu finden. Das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Eine Methode ist beschrieben, einzeln auswählen, bearbeiten und Bild zu leben Erreger mit einer optischen Falle gekoppelt an eine sich drehende Scheibe Mikroskop. Die optische Falle bietet räumliche und zeitliche Steuerung von Organismen und legt sie neben Wirtszellen. Fluoreszenzmikroskopie erfasst dynamische interzelluläre Wechselwirkungen mit minimaler Störung der Zellen.

Die Verwendung einer optischen Falle für das Studium der Wirt-Pathogen-Interaktionen für Dynamic Live Cell Imaging

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Es wird ein Protokoll zum Starten und stabilen Einfangen ausgewählter dielektrischer Mikropartikel in Luft vorgestellt.

Optische Trap-Laden von Dielectric Mikroteilchen in der Luft

Viele Proteine in der Zelle spüren und Krümmung der Membran zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Membran Nanoröhrchen aus Lipid Vesicles, die Interaktion von Proteinen oder jede Krümmung-aktive Molekül mit gebogenen Membranen in VitroStudie ziehen.

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

Wir präsentieren Ihnen eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt mit einem leichten Bogen Mikroskop und deren Umsetzung, Zelle Mechanik ohne Perlen in Drosophila Embryos zu erforschen.

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Hier wird ein integriertes Protokoll beschrieben, das auf einer optischen Pinzette und Defokussierungsmikroskopie basiert, um die rheologischen Eigenschaften von Zellen zu messen. Dieses Protokoll ist breit anwendbar bei der Untersuchung der viskoelastischen Eigenschaften von Erythrozyten unter variablen physiopathologischen Bedingungen.

Quantitative Analyse der viskoelastischen Eigenschaften roter Blutkörperchen mittels optischer Pinzette und Defokussierungsmikroskopie

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Lernen Sie die Messung der Biegesteifigkeit von E. coli-Zellen mit einer optischen Falle. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung mechanischer Zelleigenschaften und intrazellulärer Strukturen.

Die Messung der Biegesteifigkeit von Bakterienzellen mit einer optischen Falle

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