Mechanische Entfernung der Chorion- und Vitellinmembran: Eine Methode zur Vorbereitung von Drosophila-Eizellen für die direkte Beobachtung

- Beginnen Sie mit reifen Eizellen aus fixierten Eierstöcken in einer Kochsalzlösung. Reife Eizellen tragen Eierschalen, die aus einer äußeren Chorion und einer inneren Vitellinmembran bestehen.

Um die Chorion- und Vitellinmembran mechanisch zu entfernen, legen Sie die Eizellen zwischen die mattierten Teile von zwei vorbehandelten Objektträgern. Bewegen Sie den oberen Schieber in geraden Hin- und Herbewegungen, um eine Reibung zu erzeugen, die die Eizellen rollt.

Bewegen Sie nun den oberen Objektträger in einem leichten Winkel, um die Eizellen in eine andere Richtung zu rollen. Um kreisende Bewegungen zu vermeiden, erhöhen Sie diesen Winkel in kurzen Schritten, bis sich die obere Folie senkrecht zur unteren Folie bewegt. Durch diese Bewegung werden die Chorionen und Vitellinmembranen mechanisch entfernt, wodurch Sonden oder Färbungen in die Eizelle gelangen können.

Eizellen ohne Chorionen erscheinen lang und dünn, und Eizellen ohne Vitellinmembranen haben spitze Enden. Um die gereinigten Eizellen von den umgebenden Ablagerungen zu trennen, geben Sie die Probenmischung in ein Röhrchen und lassen Sie die Eizellen am Boden absetzen, während die Eizellen oben schwimmen und entfernt werden können.

In diesem Protokoll werden wir Chorion- und Vitellinmembranen aus reifen Drosophila-Eizellen entfernen.

- Um die Eizellen im Spätstadium zu trennen, geben Sie zunächst 1 Milliliter PBSBTx in eine flache Präparierschale. Verwenden Sie dann einen P200 mit einer BSA-beschichteten Spitze, um fixierte Eierstöcke in die flache Schale zu übertragen. Pipettieren Sie die Eierstöcke mit der BSA-beschichteten Pipettenspitze auf und ab, um die reifen Eizellen von den weniger reifen Eizellen zu lösen.

Wenn die Eizellen im Spätstadium ausreichend getrennt sind, überführen Sie das gesamte Gewebe in ein 500-Mikroliter-Mikrofuge-Röhrchen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer gezogenen Pasteurpipette und lassen Sie etwa 150 bis 200 Mikroliter im Röhrchen.

Zur Vorbereitung des Eizellrollens befeuchten Sie eine Tiefkühlschale mit 200 Mikrolitern PBSBTx. Decken Sie die Schale ab und stellen Sie sie beiseite.

Besorgen Sie sich drei Objektträger aus Milchglas und legen Sie den Objektträger drei beiseite. Reiben Sie anschließend vorsichtig die Milchglasbereiche der Objektträger eins und zwei aneinander. Spülen Sie sie in entionisiertem Wasser ab, um Glasscherben zu entfernen, und trocknen Sie sie mit einem Einwegtuch ab. Beschichten Sie die mattierten Bereiche der Objektträger eins und zwei mit PBSBTx, indem Sie 50 Mikroliter PBSBTx auf einen Objektträger geben und diesen Bereich mit dem anderen Objektträger reiben. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einem Einwegtuch und legen Sie die Objektträger unter ein Präpariermikroskop. Halten Sie die mattierten Bereiche der Folien eins und zwei in Kontakt mit der dritten Folie, die die zweite Folie stützt.

Um die Eizellen zu rollen, befeuchten Sie zunächst eine P200-Pipettenspitze in PBSBTx vor und dispergieren Sie die Eizellen im Mikrofuge-Röhrchen, indem Sie auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 50 Mikroliter Flüssigkeit mit den Eizellen in die Mitte des Milchglasteils des ersten Objektträgers. Heben Sie dazu die zweite Rutsche an.

Schieben Sie den zweiten Schieber langsam ab, bis die Oberflächenspannung der Flüssigkeit eine Abdichtung zwischen den beiden Milchglasbereichen bildet. Es sollte genug Flüssigkeit vorhanden sein, um den vereisten Bereich zu bedecken, aber es sollte keine heraussickern. Halten Sie dann die untere Rutsche mit einer Hand an Ort und Stelle und bewegen Sie mit der anderen Hand die obere Rutsche zwei in horizontaler Richtung hin und her, wobei Sie die zweite Folie waagerecht und gestützt auf der dritten Folie halten.

Führen Sie die Durchführung unter einem Mikroskop durch, um die Bewegungen und den Fortschritt der Eizellen einfach zu visualisieren. Ändern Sie nach einigen Bewegungen in horizontaler Richtung den Bewegungswinkel leicht. Erhöhen Sie diesen Winkel in mehreren Schritten schrittweise auf 90 Grad, bis die Bewegung der oberen Folie zwei senkrecht zur Startrichtung verläuft. Beachten Sie, dass leere Chorionen in der Flüssigkeit sichtbar sind und Eizellen ohne Chorionen länger und dünner erscheinen.

- Achten Sie beim Rollen der Eizellen darauf, dass die Rollrichtung immer in einer geraden Linie und niemals in einer kreisenden Bewegung verläuft.

- Wiederhole das Rollen etwa 7 bis 10 Mal, bis die Lösung leicht trüb wird. Hören Sie auf zu rollen, wenn die Mehrheit der Eizellen ihre Vitellinmembranen verloren zu haben scheint.

Hebe den oberen Objektträger vorsichtig um zwei an und ziehe eine seiner Ecken zur Mitte des mattierten Bereichs am unteren Objektträger eins, so dass sich die gerollten Eizellen in der Mitte des mattierten Bereichs ansammeln. Spülen Sie die Eizellen von beiden Objektträgern mit PBSBTx in die Vertiefungsschale, die PBSBTx enthält.

Reinigen Sie die Objektträger eins und zwei mit Reinstwasser. Mit einem Einwegtuch trocknen und zurücksetzen. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Eizellen desselben Genotyps gerollt sind. Dies erfordert in der Regel drei bis vier Rollrunden pro Genotyp.

Um Schmutz nach dem Walzen zu entfernen, geben Sie 1 Milliliter PBSBTx in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Schwenken Sie die Flüssigkeit, um die Seiten des Rohrs zu beschichten. Übertragen Sie die gerollten Eizellen mit einer PBSBTx-beschichteten P1000-Pipettenspitze aus der Vertiefungsschale in das konische Röhrchen mit 1 Milliliter PBSBTx. Geben Sie weitere 2 Milliliter PBSBTx in das konische Röhrchen mit den Eizellen.

Halten Sie den konischen Schlauch vor einen dunklen Hintergrund, um die undurchsichtigen Eizellen beim Absinken zu sehen. Nachdem Sie die Eizellen am Boden abgesetzt haben, verwenden Sie einen P1000, um die oberen 2 Milliliter der Lösung mit den Ablagerungen zu entfernen und zu entsorgen.

Nachdem Sie den Schritt für insgesamt drei Runden der Schmutzentfernung wiederholt haben, verwenden Sie eine PBSBTx-beschichtete P1000-Pipettenspitze, um die Eizellen zurück in das ursprüngliche 500-Mikroliter-Mikrofuge-Röhrchen zu übertragen. 20 bis 25 Frauen sollten etwa 50 Mikroliter gerollte reife Eizellen ergeben.