Name: Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Lernen Sie die Ein-Schritt-Metabolomics-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von Kohlenhydraten, organischen und Aminosäuren mittels GC/MS. Dieses Verfahren verbessert das Neugeborenenscreening erheblich.

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Die Lage der technischen Hilfe von Anthony Thomas wird dankbar anerkannt.

Verfahren zur Bearbeitung der Urinproben <ol><li> Thaw die Urinprobe in einem 37 ° C Wasserbad. Dekantieren in einen neuen Container, wenn die ursprüngliche gefährdet ist. </li><li> Nehmen Sie ein Maximum Aliquot von 13 ml der Probe und speichern Sie es bei -20 ° C in einer markierten konisches Zentrifugenröhrchen. </li><li> Messen und notieren die optische Dichte der Probe, indem Sie ein paar Tropfen Urin in das Refraktometer. </li><li> Filtern Sie die Probe durch ein 0,2 um-Filter. </li><li> Messen Sie das Volumen der Probe unterhalb entsprechend der optischen Dichte <table border="0"><tbody><tr><td> 1,000-1,009 </td><td> 1,00 ml </td></tr><tr><td> 1,010-1,019 </td><td> 0,50 ml </td></tr><tr><td> 1,020-1,050 </td><td> 0,25 ml + 0,25 ml H 2 O </td></tr></tbody></table></li><li> Die angegebene Menge wird dann auf eine Reactivial übertragen mit folgenden internen Standards: 500 Nanomol (nMol) 3 Creatine, 10 nmol d 3 Methylmalonsäure; 100 nmol jedes der folgenden 13 C 3 Laktat, 13 C 3-Pyruvat, 13 C 2 15 N Glycin, Serin d 3, d 5 Phenylalanin, d 11 hexanoylglycine, 15 N 2 Orotat, d 4 Sebacinsäure, 13 C 6 Glukose, d 6 Inositol und d 5 Tryptophan. </li><li> 20 Mikroliter (ul) von 7,5 Einheiten / ul Lösung von Urease (Calzyme Laboratories Katalog-Nr. 116A0100) wird auf die Probe, die dann gespült und versiegelt unter CO 2 durch eine inerte Septum zugegeben. </li><li> Die Probe wird bei 37 ° C für 30 Minuten mit mehr Kohlendioxid aufgenommen Abstand von 15 Minuten, um den Druck aufrecht zu erhalten. </li><li> 20 pl mehrere der Urease-Lösung zugegeben, die Flasche mit Kohlendioxid gespült, und die Probe bei 37 ° C für weitere 15 Minuten gehalten. </li><li> 500 ul von 30:70 Aceton: Methanol versetzt, das Gummiseptum ist mit einer Teflon beschichteten Septum ersetzt, und die Probe wird bei -20 ° C für 15 Minuten gekühlt. </li><li> Die Feststoffe werden durch Zentrifugation bei 1500 rpm x 10 Minuten, dann in ein sauberes 2,0 ccm Reactivial (Supelco / Sigma) dekantiert entfernt </li><li> Add triethylammonium Trifluoracetat (TEA / TFA) (Sigma) wie folgt: <ul><li> 20 pl für 1,00 ml-Proben </li><li> 40 pl für 0,5 ml oder weniger Proben </li></ul></li><li> Top off mit Acetonitril und unter einem Stickstoffstrom bei 70 ° C bis zum konstanten Volumen erreicht ist (TEA / TFA bleiben) (~ 15 Minuten). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 13, bis zu 4 mal, bis sich ein Niederschlag bildet (~ 10 Minuten). </li><li> Lassen Sie für etwa 2 Minuten abkühlen lassen. Top off mit Methylenchlorid, wobei darauf geachtet von überkochen und trocken (~ 4:00 Minuten). </li><li> Wiederholen Sie Schritt 15. </li><li> Add MSTFA (N-Methyl-N-trimethylsilyl) (Thermal Scientific) zu folgenden Konditionen: <ul><li> 150 mu l für 1,00 ml-Proben </li><li> 200 ul für 0,50 ml oder weniger Proben </li></ul></li><li> Cap unter einer Stickstoffatmosphäre und Inkubieren bei 70 ° C für 1 Stunde. </li><li> Transfer zum Mikrolitergefäßen, unter Stickstoffatmosphäre, für die Analyse auf Gaschromatograph / Massenspektrometer. </li><li> Legen Sie Mikrolitergefäßen für die automatisierte Injektion von der Agilent 5975 GC / MS: Instrument Temperaturen sind: Injektor 200 ° C, Schnittstelle 250 ° C, Backofen 80 ° C für 1 Minute; Rampe bei 4 ° C / Minute 80-130 ° C, Rampe 6 ° C / Minute 130-200 ° C, Rampe bei 12 ° C / Minute 200-285 ° C für 10 Minuten halten. Column: 25 m, 320 micron ID, 0,5 Mikron Schichtdicke DB-5. Massenspektrometrie: Quelle 230 ° C, Quad 150 ° C, Scan 50-650 amu bei 2,46 Scans / Sek. Solvent Delay 3,5 Minuten. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2014/ShoemakerResultHawkinsinuria.pdf">klicken Sie hier,</a> um die repräsentative Ergebnisse zu sehen.

<ol><li>Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+urine+samples+for+carbohydrates%2C+organic+and+amino+acids+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease.</a> J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).</li>
<li>Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+gas+chromatographic-mass+spectrometric+screening+of+newborn+urine+for+inborn+errors+of+metabolism+after+treatment+with+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).</li>
<li>Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+screening+for+organic+acidemia+using+GC%2FMS+and+dried+urine+filter+paper%3A+a+study+on+neonatal+mass+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening.</a> Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+gas+chromatographic-mass+spectrometric+procedure+for+diagnosing+pyrimidine+degradation+defects+for+prevention+of+severe+anticancer+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).</li>
<li>Kuhara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+inborn+errors+of+metabolism+using+filter+paper+urine%2C+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).</li>
<li>Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+simplified+and+sensitive+method+for+screening+fructose-1%2C6-diphosphatase+deficiency+by+analyzing+urinary+metabolites+in+urease%2Fdirect+preparations+and+gas+chromatography-mass+spectrometry+in+the+selected-ion+monitoring+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).</li>
<li>Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+diagnosis+of+homocystinuria+by+urease+treatment%2C+isotope+dilution+and+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).</li>
<li>Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).</li>
<li>Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+Drosophila+a+biotin-deficient+diet+for+multiple+generations+increases+stress+resistance+and+lifespan+and+alters+gene+expression+and+histone+biotinylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns.</a> J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).</li>
<li>Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Importance+of+NADP%2B-Dependent+Isocitrate+Dehydrogenase+in+Resistance+to+Nitrosative+Stress+and+the+Inessentiality+of+Glucose-6-Phosphate+Dehydrogenase+for+Oxidative+Stress+Resistance+in+Cryptococcus+neoformans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryotic Cell. , (2010).</li>
<li>Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Screening+in+Humans+by+Gas+Chromatography-Mass+Spectrometry+of+Urine+Metabolites+After+Substrate+Loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading.</a> , (1992).</li>
<li>Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproate-induced+biochemical+abnormalities+in+pregnancy+corrected+by+vitamins%3A+A+Case+Report%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report.</a> Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+folate-dependent+metabolite+in+amniotic+fluid+from+pregnancies+with+normal+or+trisomy+21+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes.</a> Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+concentrations+in+amniotic+fluid+found+in+normal+and+Down+syndrome+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).</li>
<li>Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridoxine-related+metabolite+concentrations+in+normal+and+Down+syndrome+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Fetal+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid.</a> Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).</li>
</ol>

Das Stoffwechsel-Screening-Labor ist ein CLIA-lizenzierten klinischen Labor durch Saint Louis University, einer Non-Profit Corporation. Dr. Shoemaker nicht direkt profitieren von Labor-Umsätze, kann aber indirekt profitieren die Produktivität im Labor. Keine der Methoden, Techniken, Ergebnisse, normal reicht, Makros, Software, Bibliotheken oder Schlussfolgerungen sind als proprietäre und sind frei interessierten Kreisen zur Verfügung.

Die Urease-Methode (1) wurde 62 Mal in der medizinischen Literatur mit verschiedenen Modifikationen zitiert. Matsumoto Gruppe (2,3) vereinfacht das Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening bei Neugeborenen und berichtete über die Ergebnisse von 16000 Patienten. Kuhara und andere (4-7) haben die Verwendung der Methode in mehreren Fällen von angeborener Diagnose gemeldet und Follow-up. Rhead (8) bestätigte auch die Methode der Nutzen für die klinische Diagnostik und Follow-up von angeborenen Fehlern. Die Methode hat den Urin von Bären angewendet wurde, knock-out Mäuse, Elefanten und Homogenaten von ganzen Fruchtfliegen und deren Larven (9). Kulturmedien von Cryptococcus vor und nach der Mutagenese wurden ebenfalls analysiert, ohne die Urease Schritt (10). Das Verfahren wurde für die menschliche Ernährung Beurteilung wurde in Medizinstudenten angewendet, Down-Syndrom-Patienten und dementen älteren Veteranen nach dem Laden der Patienten mit oraler Gabe von Aminosäuren Tryptophan, Methionin und Isoleucin (11). Alle acht B-Vitamine wurden durch Quantifizierung der Abbauprodukte der drei Aminosäuren, die, unter ihnen verlangen, dass alle 8 Vitaminen zu irgendeinem Zeitpunkt in ihrem Abbau bewertet. Die toxischen Wirkungen von Arzneimitteln und deren Minderung durch Vitamin-Supplementierung ist berichtet worden (12). Fruchtwasser Proben von normalen und Down-Syndrom Schwangerschaften wurden analysiert und berichtet (13-15).

<table><tbody><tr><td>MSD 5975</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>MSD 5973</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>GC/MS/Computer</td></tr><tr><td>Harnstoffase</td><td>Calzyme</td><td>116A0100</td><td>Auch Sigma C3</td></tr><tr><td>Stabile Isotopenstandards</td><td>CDN Isotopes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lösungsmittel</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-Säulen</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>123-5026</td><td></td></tr><tr><td>TEA/TFA</td><td>Fluka</td><td>09747</td><td></td></tr><tr><td>Vials</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z115088/12EA</td><td></td></tr><tr><td>Merlin Microseal</td><td>Agilent Technologies</td><td>5181-8815</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA</td><td>Thermal Scientific, Inc.</td><td>48913</td><td></td></tr></tbody></table>

ein-schritt-metabolomics: kohlenhydrate, organische und aminosäuren in einem einzigen verfahren quantifizierte

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Jedes Kind in den USA geboren ist nun für bis zu 42 seltene genetische Krankheiten abgeschirmt als &quot;angeborene Stoffwechselstörungen.&quot; Die Screening-Methode beruht auf Tandem-Massenspektrometrie und quantifiziert Acylcarnitine als Bildschirm für organische acidemias und misst auch Aminosäuren. Alle Staaten führen auch enzymatische Tests für den Kohlenhydrat-Erkrankungen wie Galaktosämie. Da die Ergebnisse können unspezifische, Follow-up-Tests positive Ergebnisse ist erforderlich, über eine genauere Methode. Der vorliegende Bericht beschreibt die &quot;Urease&quot; Methode der Probenvorbereitung für die angeborene Störung Screening. Crystalline Enzym Urease wird Harnstoff aus Körperflüssigkeiten, die meisten anderen wasserlöslichen Metaboliten werden entwässert und derivatisiert für die Gaschromatographie in einem einzigen Verfahren erlaubt zu entfernen. Dehydration durch Verdunstung in einem Stickstoffstrom wird durch Zugabe von Acetonitril und Methylenchlorid erleichtert. Dann nimmt Trimethylsilylierung Platz in der Gegenwart eines einzigartigen Katalysator, Triethylammonium Trifluoracetat. Automated-Einspritzung und Chromatographie wird durch Makro-driven eigene Quantifizierung von 192 Metaboliten und Semi-Quantifizierung von allen wichtigen Komponente mit Fachbibliotheken der Massenspektren von TMS derivatisiert biologischen Verbindungen gefolgt. Die Analyse kann auf der weit verbreiteten Chemstation Plattform mit den Makros und Bibliotheken erhältlich vom Autor durchgeführt werden. In unserem Labor haben über 16.000 Patientenproben untersucht mit der Methode mit einer diagnostischen Ausbeute von etwa 17% - das ist, zeigen 17% der Proben Ergebnisse Ergebnisse, die auf vom Besteller Arzt gehandelt werden sollte. Eingeschlossen in diesen sind über 180 bestätigte angeborenen Fehler, von denen etwa 38% nicht diagnostiziert worden konnte mit den bisherigen Methoden.

Die Urease-Methode der Probenvorbereitung für die GC / MS-Analyse der Vermittler Metaboliten von seinem Erfinder vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht in einem Schritt Follow-up der Neugeborenen-Screening auf angeborene Störungen durch Tandem-Massenspektrometrie durch Quantifizierung Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren alle in einem einzigen Prozess.

Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte

Jedes in den USA geborene Kind wird nun auf bis zu 42 seltene genetische Störungen untersucht, die als „angeborene Stoffwechselstörungen“ bezeichnet werden. Die Screening-Methode basiert auf ...

Bei diesem einstufigen Metabolomik-Verfahren werden biologische Proben in einem einzigen Arbeitsgang für die Analyse von Kohlenhydraten, organischen Säuren und Aminosäuren mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie vorbereitet. Zunächst werden die Proben mit dem Enzym Urease behandelt, um Harnstoff zu entfernen. Im zweiten Schritt des Verfahrens erfolgt die Dehydrierung der Proben in Gegenwart eines Detergens, das aus zwei flüchtigen Komponenten besteht: Triathlon, Ammonium und Trifluoracetat.Anschließend erfolgt die Derivatisierung der Komponenten durch Trimethylierung. Abschließend ermöglicht die Analyse mittels Gaschromatographie, Massenspektrometrie-Baum, automatisierter Quantifizierung von Kohlenhydraten, organischen und Aminosäuren, Isol, Glycin und Aminozuckern die Bestätigung und Nachverfolgung der meisten genetischen Störungen, die bei der neonatalen Screeninguntersuchung gefunden werden, sowie zusätzlicher 38 % Störungen, die derzeit nicht mittels Tandem-Massenspektrometrie erfasst werden. Hallo, ich bin Jim Shoemaker im Stoffwechsel-Screening-Labor der St. Louis University.Ich erkläre hier die einkomponentige Metabolomik, eine Methode zur Analyse biologischer Flüssigkeiten auf intermediäre Metaboliten, ohne Säuren, Basen und neutrale Verbindungen zu trennen. Dadurch wird es möglich, die tandemmassenspektrometrische Neugeborenen-Screening-Methode mit einem einzigen Verfahren zu ergänzen, das die Analyse von organischen Säuren, Aminosäuren, Kohlenhydraten, Kohlenhydratderivaten und ACell-Glycin in einem einzigen Schritt ermöglicht. Das Ergebnis ist, dass in dem Diagramm hinter mir die in Rot dargestellten Diagnosen mittels einkomponentiger Metabolomik gestellt werden können, jedoch bei der derzeitigen Neugeborenen-Screening-Methode mittels Tandem-Massenspektrometrie nicht erfasst würden.Beginnen wir nun mit der Demonstration. Um dieses Verfahren einzuleiten, erwärmen Sie die Urinprobe in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius. Falls der ursprüngliche Behälter beschädigt ist, füllen Sie eine Probe in einen neuen Behälter um.Entnehmen Sie eine Aliquotprobe und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius in einem beschrifteten kegelförmigen Zentrifgenröhrchen als Sicherheitsprobe. Messen und notieren Sie anschließend die optische Dichte der Probe, indem Sie einige Tropfen Urin in das tragbare Refraktometer geben. Nach der Messung der optischen Dichte filtrieren Sie die Probe durch einen 0,2-Mikron-Filter.Messen Sie das Probenvolumen entsprechend der optischen Dichte vor der Filtration ab. Für Werte zwischen eins und 1,009 verwenden Sie ein Milliliter Probe; für Werte zwischen 1,01 und 1,019 verwenden Sie 0,5 Milliliter Probe. Für Werte zwischen 1,02 und 1,05 kombinieren Sie 0,25 Milliliter Probe mit 0,25 Milliliter Wasser.Überführen Sie das angegebene Volumen in ein Reaktionsgefäß, das bereits die in der hier gezeigten Tabelle angegebenen isotonmarkierten internen Standards enthält. Die Standards umfassen Kreatin, Methylmalonsäure, Lactat, Pyruvat, Glycin, Sine-Phenylalanin, Hexaöl, Glycin, Orotat, SEBA-Säure-Glukose, Inositol und Tryptophan. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter einer Urease-Lösung mit einer Konzentration von 7,5 Einheiten pro Mikroliter hinzu.Spülen Sie die Probe aus und verschließen Sie sie unter Kohlendioxid durch eine inerte Septum. Halten Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, während Sie im Abstand von 15 Minuten zusätzliches Kohlendioxidgas zuführen, um den Druck am Ende der 30-minütigen Inkubation bei 20 Mikroliter mehr Harnstoffase-Lösung aufrechtzuerhalten. Spülen Sie das Gefäß mit Kohlendioxid und lagern Sie die Probe weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach Abschluss der Harnstoffase-Behandlung unverzüglich mit der Dehydrierung und Derivatisierung der Probe fortfahren, direkt im Anschluss an die Harnstoffase-Behandlung. Mit 500 Mikrolitern einer 30 bis 70 Aceton zu Methanol-Lösung. Ersetzen Sie bei den Proben die Gummiseptum durch ein Teflon-beschichtetes Septum.Kühlen Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius für 15 Minuten ab. Entfernen Sie die Feststoffe durch Zentrifugation bei 1500 U/min für 10 Minuten und dekantieren Sie anschließend das Überstand in ein sauberes 2,0-CC-Reaktionsfläschchen. Geben Sie nun Triammoniumtrifluoracetat oder T-E-A-T-F-A hinzu, das als Katalysator für die Trimethylierung dient: für Proben von einem Milliliter 20 Mikroliter und für Proben von 0,5 Milliliter oder weniger 40 Mikroliter.Füllen Sie mit Acetonitril auf und stellen Sie unter einen Stickstoffstrom bei 70 Grad Celsius, bis ein konstantes Volumen erreicht ist, was anzeigt, dass nur noch T-E-A-T-F-A vorhanden ist. Dies dauert etwa 15 Minuten. Füllen Sie erneut mit Acetonitril auf und stellen Sie unter einen Stickstoffstrom bei 70 Grad Celsius, bis ein konstantes Volumen erreicht ist, und wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu viermal, bis ein Niederschlag entsteht.Das dauert jedes Mal etwa 10 Minuten nach der Dehydrierung; lassen Sie es etwa zwei Minuten abkühlen. Füllen Sie mit Methylenchlorid auf, achten Sie darauf, dass es nicht überkocht, und trocknen Sie es. Dies dauert etwa vier Minuten.Füllen Sie mit Methylenchlorid auf und trocknen Sie. Einmal mehr. Danach derivatisieren Sie die Probe.Geben Sie 150 Mikroliter OFM, STFA zu Ein-Milliliter-Proben und 200 Mikroliter pro 0,5 Milliliter oder weniger hinzu. Verschließen Sie die Proben unter einer Stickstoffatmosphäre und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius. Am Ende der einstündigen Inkubation arbeiten Sie unter einer Stickstoffatmosphäre, um die Proben in Mikrovials zur Analyse an einem Gaschromatographen-Massenspektrometer umzufüllen; hier wird ein Agilent 5 9 7 5 GCMS mit einer DB-fünf-Kapillare verwendet.Stellen Sie beim Massenspektrometer die Quelle auf 230 Grad Celsius, das Quadrupol auf 150 Grad Celsius und den Scan-Massenbereich auf 50 bis 650 AMU bei 2,46 Scans pro Sekunde ein. Die Lösungsmittelverzögerung beträgt 3,5 Minuten. Die Geräte temperaturen liegen bei 200 Grad Celsius für den Injektor und 250 Grad Celsius.Stellen Sie für die Schnittstelle den Ofen auf 80 Grad Celsius für eine Minute ein, erhöhen Sie dann mit vier Grad Celsius pro Minute von 80 auf 130 Grad Celsius, anschließend mit sechs Grad Celsius pro Minute von 130 auf 200 Grad Celsius und schließlich mit 12 Grad Celsius pro Minute von 200 auf 285 Grad Celsius und halten Sie diesen Wert 10 Minuten lang konstant. Platzieren Sie die Mikrovials mit den derivatisierten Augenproben für die automatisierte Injektion durch die GC-MS und starten Sie die Analyse. Ein repräsentatives Spektrum einer Urinprobe, analysiert mittels GC-MS nach Urease-Behandlung, ist hier dargestellt, wobei die Peaks den Metaboliten Pyroglutaminsäure, 4-Hydroxycycloessigsäure und Hawkinson entsprechen.Diese Metaboliten sind charakteristisch für Hawkins-Anurie, eine seltene genetische Erkrankung. Alle Peaks im Spektrum können bekannten Metaboliten zugeordnet und quantifiziert werden. Die Ergebnisse von anfänglichen Neugeborenen-Screening-Tests können unspezifisch sein.Jedoch bestätigten die hier gezeigten erhöhten Spiegel von Hawkins-UR-Metaboliten in der mittels GC-MS analysierten Urinprobe die Diagnose dieser angeborenen Stoffwechselstörung. Mithilfe derselben URIs-Methode wurden bei 184 Patienten angeborene Stoffwechselstörungen diagnostiziert. Knapp 40 % der in Rot dargestellten Diagnosen wären mit der in der neonatalen Screening-Routine üblicherweise eingesetzten Tandem-Massenspektrometrie nicht erkannt worden.Das war damit die Demonstration, wie man mithilfe der Harnstoffabbau-Methode eine einstufige Metabolomik durchführt, um biologische Flüssigkeiten auf Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren sowie acylierte Glycine in ein und demselben Verfahren zu analysieren. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Beurteilung der Wirksamkeit des Verfahrens die Vollständigkeit der Harnstoffabbau-Digestion, der Dehydratisierung und der Trimethylsilylierung jeweils separat überprüft werden kann, indem lediglich das Vorhandensein aller internen Standards kontrolliert wird.Die internen Standards wurden gezielt so gewählt, dass beispielsweise die Vollständigkeit der Dehydratisierung nachgewiesen werden kann, denn andernfalls wäre das Creatinin-TRI-TMS nicht in voller Menge vorhanden. Das ist somit unser Nachweis. Falls Sie Interesse an den Makros und Bibliotheken haben, die wir zur Interpretation dieses Verfahrens mit ChemStation entwickelt haben, schreiben Sie mir bitte an die auf Ihrem Bildschirm angezeigte E-Mail-Adresse. Weitere Informationen über unser Labor finden Sie unter der auf Ihrem Bildschirm angezeigten URL.Vielen Dank. Hier spricht Jim Shoemaker.

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Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Protokoll für die Extraktion von wässrigen Metaboliten aus kultivierten, anhaftenden Zellen für die metabolomische Analyse zu beschreiben, insbesondere die kapillare Elektrophoresen-Massenspektrometrie.

Gewinnung von wässrigen Metaboliten aus kultivierten Adherenten Zellen für die metabolomische Analyse durch die kapitänische Spektrometrie Elektrophoresis-Mass

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Wir haben einen ungezielten metabolomischen Workflow entwickelt, der XY-Meta und metaX zusammen integriert. In diesem Protokoll zeigten wir, wie XY-Meta verwendet werden kann, um eine Lockvogel-Spektralbibliothek aus der Open-Access-Spektrenreferenz zu generieren, und führten dann eine FDR-Kontrolle durch und verwendeten das metaX, um die Metaboliten nach der Identifizierung der Metabolomik-Spektren zu quantifizieren.

Ein integrierter Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung von FDR-Kontroll-basierten, ungezielten Metabolomen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Zellmetaboliten für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) zu konservieren, indem es das Waschen flüchtiger Salzlösungen, das schnelle Abschrecken von flüssigem Stickstoff, die Gefriertrocknung und die Lagerung bei -8 °C kombiniert. Es zeigt, dass die Abschreckung von flüssigem Stickstoff für die Aufrechterhaltung von Metabolitenprofilen unerlässlich ist, während eine längere Kühllagerung minimiert werden sollte, um metabolische Veränderungen zu vermeiden.

Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

Lernen Sie die Ein-Schritt-Metabolomics-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von Kohlenhydraten, organischen und Aminosäuren mittels GC/MS. Dieses Verfahren verbessert das Neugeborenenscreening erheblich.

Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte

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