Vier-Wege-Olfaktometer-Assay: Eine Methode zur Bewertung von Geruchsreaktionen bei Drosophila

- Ein Vierwege-Olfaktometer ist eine geschlossene Kammer mit Einwegöffnungen an jeder Ecke, durch die es bis zu vier Gerüche abgeben kann, wodurch Quadranten mit unterschiedlichen Geruchsprofilen entstehen. Beginne ein Experiment, indem du wache Fliegen in die Kammer bringst. Vermeiden Sie eine Anästhesie, da dies ihr Verhalten während des Experiments beeinträchtigen kann.

Setzen Sie die Fliegen sauberer Luft aus und beobachten Sie ihre Bewegungen, um sicherzustellen, dass keine Geruchsstoffe das Olfaktometer verunreinigen und das Verhalten der Fliegen beeinträchtigen. Bereiten Sie dann die Prüfodorstoffe in separaten Fläschchen vor und schließen Sie sie über die Einwegöffnungen an die Hauptkammer an. Setzen Sie die Fliegen für einen vordefinierten Zeitraum den Geruchsstoffen aus und entfernen Sie den Reiz nach Beendigung des Versuchs.

Fliegen neigen dazu, Quadranten mit abstoßenden Gerüchen zu meiden, während sie sich auf Quadranten mit attraktiven Gerüchen zubewegen und sich dort niederlassen. Messen Sie die geruchsbedingten Verhaltensreaktionen der Fliegen, indem Sie ihre Positionen im Laufe der Zeit verfolgen, während sie das Olfaktometer erkunden.

Im folgenden Protokoll werden wir ein Vier-Quadranten-Olfaktometer mit einem Luftzufuhrsystem verwenden, um das Verhalten der Fliegen als Reaktion auf Ethylpropionat, ein abweisendes Odorant, und Apfelessig, der attraktiv ist, zu analysieren.

- Schalten Sie den Temperaturregler mindestens fünf Minuten vorher ein und stellen Sie ihn auf 25 Grad Celsius ein. Verbinden Sie dann die Odoriermittelkammern über ein Kunststoffrohr mit der Arena. Überprüfen Sie den Luftdurchsatz in jedem Quadranten der Arena mit einem elektronischen Durchflussmesser. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Steuerung als auch die Geruchs- und Luftströme mit 100 Millilitern pro Minute laufen.

- Fliegen reagieren sehr empfindlich auf Luftströmungen, und es ist wichtig, dass der Luftstrom für jeden Quadranten vor jedem Experiment überprüft wird.

- Reinige nun die Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol. Wischen Sie alle Teile zwei- bis dreimal ab und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen, bevor Sie fortfahren. Als nächstes klemmst du die Glasplatten an die Arena. Bringen Sie die Fliegen dann ohne Betäubung in die Arena. Lassen Sie sie mit Hilfe der Schwerkraft durch das Loch in einer der Glasplatten eindringen und decken Sie das Loch dann mit einem kreisförmigen Netz ab.

Setze nun die fliegenbeladene Arena in die lichtdichte Kammer. Verbinden Sie dann die vier Steuerluftströme mit jeder Ecke der Arena. Schließen Sie die Tür der Kammer und lassen Sie die Fliegen sich 10 bis 15 Minuten lang an die neue Umgebung gewöhnen.

Führen Sie nach der Eingewöhnungsphase ein 5- bis 10-minütiges Kontrollexperiment durch, bei dem die Fliegen vier Kontrollluftströmen ausgesetzt werden. Es ist wichtig, die Daten jetzt sofort zu analysieren. Sind die Fliegen nicht gleichmäßig in der Arena verteilt, muss die Arena zurückgesetzt werden.

- Es ist wichtig, das Verhalten von Kontrollfliegen zu testen, um nur die Luft zu reinigen. Auf diese Weise wird schnell überprüft, ob alle Hintergrundbedingungen normal sind. Austretendes Licht, Temperaturungleichgewicht, gekippte Arena oder eine Geruchskontamination können Probleme verursachen.

- Falls nötig, wirf die Fliegen weg und reinige die Arena erneut. Bei Verdacht auf eine Verunreinigung des Odoriermittels alle Schläuche austauschen. Wiederholen Sie den Kontrolltest mit neuen Kohorten, bis die Tiere keine Präferenz mehr für einen der vier Quadranten zeigen. Verbinden Sie dann die Testodormittelkammer über ein Dreiwegeventil mit dem Aufbau oder schließen Sie den Schlauch wieder an und führen Sie ein Testexperiment für 5 bis 10 Minuten durch. Bei längeren experimentellen Aufzeichnungen sollten Sie das Tracking-Programm alle 20 Minuten schnell stoppen und neu starten, da sonst die Datendateien zu groß werden.

Entsorgen Sie zwischen den Tests die Fliegen, reinigen Sie die Arena und die Glasplatten mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die Verbindungsrohre. Halten Sie den trockenen Luftstrom in Gang, um das System kontinuierlich zu spülen. Aus Gründen der Effizienz ist es gut, zwei Arenen zu haben, damit die Reinigung während der Läufe durchgeführt werden kann.

- Wenn mehrere Experimente am selben Tag durchgeführt werden, achten Sie äußerst darauf, dass kein Geruch aus einem früheren Lauf im System zurückbleibt. Bei niedrigen Konzentrationen des Odoriermittels oder bei CO2 ist dies in der Regel kein Problem. Für hochkonzentrierte Stimuli kann jedoch ein Abstand von bis zu 24 Stunden zwischen den Versuchsläufen erforderlich sein.