Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Een Y-doolhof bestaat uit een Y-vormige connector met drie vliegenflacons die ermee verbonden zijn door rechte of taps toelopende buizen. Vliegen bewegen zich door het doolhof naar de zijkant met de stimulus die ze prefereren. Om het experiment te starten, plaatst u een tissuepapier met de oplossing met de vluchtige chemicaliën in elke flacon. Sluit ze vervolgens aan op de taps toelopende buizen. De taps toelopende buizen beperken het vermogen van de vliegen om terug te keren naar het midden van het doolhof en vertragen de verspreiding van de vluchtige chemicaliën.
Vervolgens, chill uitgehongerde vliegen om ze te vertragen. Gebruik geen chemische anesthesie, omdat dit de uitkomst van de test kan beïnvloeden. Verbind de flacon snel met de gekoelde vliegen aan de laatste kant van het doolhof. Laat de vliegen het doolhof verkennen. Om elke voorkeur veroorzaakt door fel licht te verminderen, voert u deze stap uit onder ver rood licht, dat vliegen niet zien. Tel ten slotte de vliegen aan elke kant van het doolhof. Hun locatie in het doolhof geeft hun voorkeur aan voor die vluchtige chemische geur.
In het voorbeeldprotocol zien we een opstelling van de Y-doolhoftest met wild type Drosophila.
- Voordat u de volgende ochtend, aan het einde van de dag, de test uitvoert, brengt u cohorten van 10 tot 20 experimentele lijnen over naar glazen flacons met vocht uit een natte handdoek. De vliegen moeten binnen 16 tot 18 uur worden getest, anders kunnen ze sterven als gevolg van uitdroging of verhongering. De volgende dag monteert u het Y-doolhof. Begin met het verbinden van de Y-vormige connector met twee glazen flacons met behulp van schuimconnectoren met bijgesneden pipetpunten.
De derde tak van de "Y" is bevestigd aan een laadbuis, gemaakt van het grote deel van een pipetpunt, en maakt doorgang van de laadflacon naar het keuzepunt van het doolhof mogelijk. Voorbij elke taps toelopende tunnel bevindt zich een glazen flacon, waarvan er één moet worden geladen met een geurstof. Laad deze als boluses van 40 microliter gedrenkt in 28 millimeter vierkanten tissuepapier. Welke van de twee de geurstof bevat, moet willekeurig worden afgewisseld.
Om de test uit te voeren, koelt u eerst de vliegen kort af op ijs, zodat de vliegen worden vertraagd. Dit moet onder verrood licht van LED-lampen en bij 25 graden Celsius zijn. Laat het cohort vliegen voorzichtig in de laadflacon vallen en laad het Y-doolhof met de testvliegen. Gebruik geen gasanesthesie.
- Het is echt van cruciaal belang om de vliegen snel en voorzichtig naar de laadflacon over te brengen. Het is eigenlijk de moeilijkste stap van dit experiment omdat vliegen snel wakker moeten worden voordat geuren in het Y-doolhof worden verspreid.
- De vliegen moeten het doolhof gedurende 24 uur kunnen verkennen, dus een maximum aantal vliegen verplaatst zich naar de ene of de andere glazen flacon. Het aantal vliegen in de verschillende buizen dient om de reukindex te berekenen. Standaard statistische methoden moeten op deze waarde worden toegepast, verzameld uit het gedrag van maximaal 10 vliegen.
Als 10-vliegenscohorten geen consistente resultaten opleveren, kunnen de proeven worden uitgevoerd met 20-vliegenscohorten. Om de doolhofcomponenten op te ruimen, week ze, gedemonteerd, in RBS 35 MD 's nachts. Volg dit met spoelingen in leidingwater en een laatste spoeling in DI-water voordat u ze aan de lucht droogt.
