Einfache Assay zur Quantifizierung von Sozialvermeidung in Drosophila melanogaster

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reaktion von Fliegen auf das von gestressten Individuen ausgesendete soziale Signal zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst Fliegen, Responder und Emitter nicht mehr als zwei Tage vor dem Experiment eingefangen werden. Der zweite Schritt besteht darin, sowohl die Emitter- als auch die Responder-Fliegen zwei Stunden vor dem Experiment in frische Fläschchen zu überführen und sie in den klimatisierten Raum gewöhnen zu lassen, in dem der Assay durchgeführt wird.

Als nächstes werden die Responder-Fliegen in die TMAs gelegt und vor die Wahl gestellt, zwischen einem Fläschchen, in dem die Fliegen zuvor gestresst wurden und somit das Drosophila-Stress-Odorant enthält, und einem frischen Fläschchen, der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der Responder-Fliegen in dem frischen Fläschchen im DSO-Fläschchen und im Aufzug zu zählen, um ihre Reaktion auf das DSO zu quantifizieren. Letztendlich wird das T-Labyrinth verwendet, um die Vermeidung eines sozialen Stresssignals durch Fliegen, insbesondere des Gilo-Stress-Odoranten, zu messen. Die Idee zu dieser Methode hatte ich zum ersten Mal, als ich Postdoc am Caltech war.

Zu dieser Zeit waren Greg Sue und sein Postdoktorand David Anderson daran interessiert, Angst oder soziale Vermeidung in Phyla zu untersuchen, aber es gab keinen Assay dafür. Sie kamen auf mich zu, weil ich viele Verhaltenstests im Labor der S-Marken durchführte und bei der Durchführung von Fototaxi- und olfaktorischen Lernexperimenten festgestellt hatte, dass Fliegen von Fläschchen angezogen wurden, in denen andere Fliegen eine ungestörte Zeit verbracht hatten, während sie Fläschchen mieden, in denen Fliegen zu diesem Zeitpunkt mit einem elektrischen Schlag gestresst worden waren. Bischof. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der experimentelle Prozess des Assays zur sozialen Vermeidung etwas Übung erfordert, um das Bios schnell und effizient zu übertragen, ohne Fliegen oder DSL zu verlieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik zur Untersuchung sozialer Interaktionen gegenüber bestehenden Methoden wie computergestütztem Video-Tracking besteht darin, dass es sich um einen Assay handelt, der leicht zu beherrschen und zu implementieren ist, aber sehr leistungsfähig ist, um die soziale Vermeidung von gestressten Personen zu quantifizieren. Um das Experiment zu beginnen, schneiden Sie eine poröse Polyethylenfolie so zu, dass sie eine 12,7 Zentimeter x 10,2 Zentimeter große Schachtel abdeckt. Füllen Sie die Schachtel mit zerstoßenem Eis und bedecken Sie sie mit dem Blatt, um das Drosophila-Kälteanästhesiegerät zu vervollständigen.

Führen Sie das Experiment auf einer Bank durch, die mit einer weißen Bankabdeckung und einem Whiteboard davor bedeckt ist, um homogene Lichtverhältnisse zu gewährleisten. Bereiten Sie als Nächstes das Gerät, das Thermometer und den Timer für den Vortex-Fliegensauger vor. Ein bis zwei Tage vor dem Experiment Darmanästhesiefliegen betäuben.

Füllen Sie die Fliegen mit einem Trichter in ein 50 Milliliter Röhrchen und legen Sie das Röhrchen in einen isolierten Eiskübel unter Eishöhe. Warten Sie fünf Minuten, bis die Fliegen in ein kaltes Koma fallen. Anschließend werden die Fliegen bei Raumtemperatur auf die poröse Polyethylenplatte übertragen und unter einem Stereomikroskop die Antwortenden aussortiert.

Trennen Sie drei bis sieben Tage alte männliche Fliegen von weiblichen Fliegen und halten Sie diese Fliegen in einer Gruppe von 40 vorsichtig gemischtgeschlechtlichen Kanton-Strahlerfliegen. Mit einem Mundsauger lassen Sie die Fliegen zu. Eine Nacht der Erholung, um den verwirrenden Effekt der Sammlung auf das Verhalten zu minimieren.

Öffnen Sie anschließend den Beutel mit den Testfläschchen, um die abgestandene, nach Plastik riechende Luft im Beutel durch frische Luft zu ersetzen. Stellen Sie vor dem Experiment sicher, dass die Temperatur im Testraum bei 25 Grad Celsius liegt, dass der Raum gleichmäßiges Licht hat und dass die Luftfeuchtigkeit mehr als 30 % beträgtZwei Stunden vor dem Experiment Übertragen Sie die Responder- und Emitter-Fliegen in Fläschchen mit frischen Lebensmitteln und lassen Sie die Fliegen sich an die Umgebung auf dem Labortisch anpassen, auf dem das Experiment durchgeführt wird. Lege das Teelabyrinth auf das Stampfkissen und ziehe den Schraubclip fest, damit der Aufzug stabil steht.

Übertragen Sie als Nächstes die Antwortenden in ein frisches Testfläschchen und schnappen Sie das Fläschchen mit den Antwortenden auf das Teelabyrinth. Kippen Sie dann das Teelabyrinth-Gerät und klopfen Sie es auf die Stampfmatte, damit die Fruchtfliegen in den Aufzug fallen. Bewegen Sie den oberen Teil des Höhenruders nach unten, um die Fliegen zwischen dem oberen und dem unteren Teil der TMAs zu platzieren, und stellen Sie sicher, dass sich der Aufzug über dem Auswahlpunkt befindet, um zu verhindern, dass Fliegen entweichen, während sich die Fliegen an die neue Umgebung anpassen.

Legen Sie die Emitterfliegen in ein frisches Testfläschchen und bedecken Sie es mit einem Stück Baumwolle. Bewegen Sie das Fläschchen auf diese Weise auf einem Mini-Wirbel. Die Fliegen geben DSO ab, übertragen die Fliegen in ein Futterfläschchen und platzieren das mit DSO gefüllte Fläschchen schnell auf einer der beiden Seiten des Teams.

Wechseln Sie die Platzierungsseite für das mit DSO gefüllte Fläschchen. Platzieren Sie bei jedem neuen Durchlauf ein frisches Testfläschchen auf der anderen Seite von Team A und bringen Sie dann den Aufzug vollständig nach unten, damit die Fruchtfliegen zwischen dem frischen Testfläschchen und dem mit DSO gefüllten Fläschchen wählen können. Starten Sie sofort den Timer.

Bewegen Sie den Aufzug nach einer Minute nach oben, um die Fliegen in der frischen Durchstechflasche und die DSO-Durchstechflasche von den im Aufzug steckenden Fliegen zu trennen. Zähle die Anzahl der Fliegen in jedem Fläschchen und im Aufzug. Wiederholen Sie dies.

Für jeden Genotyp und/oder jede Bedingung hat die Gruppengröße der Responder-Fliegen keinen Einfluss auf die Vermeidung von DSO. Nach Durchführung des Experiments an einem Bereich von 10 bis 80 Fliegen zeigte ein T-Test keine statistische Signifikanz unter den Leistungsindizes oder PIs der antwortenden Fliegen. Die Anzahl der Emitterfliegen beeinflusst die Vermeidung von DSO durch die Fliegen, wie diese Grafik zeigt, die verschiedene Versuche darstellt.

Mit jeweils 10 bis 160 Emitterfliegen. Mit nur 10 gestressten Fliegen wurde immer noch eine erhebliche Vermeidung festgestellt. Die Wahl, der Zeitpunkt und der genetische Hintergrund von Fruchtfliegen beeinflussen die Reaktion auf DSO, wie diese Grafik zeigt, die eine Reaktion der Canton- und Elwood-Stämme zeigt.

Beide Genotypen zeigen eine stärkere Vermeidung des DSO als Oregon und einige Markinstämme nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, den Neurokreislauf zu identifizieren, der der Wahrnehmung und Vermeidung von CO2, einer der Komponenten des DSO, zugrunde liegt. Es wurde auch verwendet, um die Rolle von Autismus-Kandidatengenen bei der Beeinflussung des Sozialverhaltens zu untersuchen.

In Joseph Ano Gaster. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als fünf Minuten pro Replikat durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Social-Avoidance-Assay durchführen, von der Vorbereitung der Emitter- und Responder-Fliegen vor dem Testen bis hin zur Generierung des DSL-Feldbios und der Manipulation der Teamkollegen, um den Respondern eine binäre Wahl zu bieten.