Escape Response Assay: Eine Methode zur Untersuchung der Reaktion von Zebrafischlarven auf Berührungsreize

- Übertragen Sie zunächst vorsichtig einige Embryonen in eine Petrischale, die das Embryomedium enthält. Halten Sie nun das Chorion mit einer Pinzette fest und machen Sie mit einer anderen Pinzette einen Riss hinein.

Schieben Sie dann den Embryo vorsichtig durch den Riss. Die Entnahme des Chorions aus dem Embryo beschleunigt sein Wachstum und seine Bewegung. Um die Rückstände zu entfernen, übertragen Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette in eine andere Petrischale, die das Embryomedium enthält.

Stellen Sie die Petrischale in einen Inkubator und lassen Sie die Embryonen bei 28 Grad Celsius wachsen. Stellen Sie einen beleuchteten, mit Wasser gefüllten Mikroskoptisch vor dem Experiment auf 28 Grad Celsius ein, um temperaturbedingte Abweichungen im Larvenverhalten zu vermeiden.

Stellen Sie die Petrischale auf die Bühne und montieren Sie sie in der Kamera über der Schale. Zentrieren Sie als Nächstes den Embryo im Sichtfeld der Kamera. Berühren Sie nun den Embryo vorsichtig mit einer stumpfen Nadel und zeichnen Sie die Reaktion der Larve mit der Aufnahmesoftware der Videokamera auf.

Bei einem Reiz zeigt der Embryo eine starke Fluchtreaktion - ein geplatztes Schwimmen zusammen mit scharfen Kurven. Messen Sie die Zeit zwischen der Berührung und der Spitzenbeschleunigung der Larve während ihrer Flucht.

Im Beispielprotokoll werden wir die Reaktion von Zebrafischlarven auf äußere Reize beobachten.

- Um den Assay durchzuführen, stellen Sie eine Petrischale, die mit etwa 25 Millilitern Embryomedium gefüllt ist, auf einen beleuchteten, temperaturgesteuerten Tisch, der auf etwa 28 Grad Celsius eingestellt ist. Montieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera über der Schüssel. Starten Sie die Videoaufzeichnungssoftware und stellen Sie die Aufnahmegeschwindigkeit auf 1.000 Bilder pro Sekunde ein, um sicherzustellen, dass hohe Schwimmgeschwindigkeiten erfasst werden können.

Positionieren Sie den Embryo in der Mitte der Petrischale, gut sichtbar im Sichtfeld. Drücken Sie auf Aufnahme und geben Sie dann einen mechanosensorischen Reiz ab, indem Sie den Embryo sanft mit einer stumpfen Nadel auf dem Kopf berühren.

Stoppen Sie die Aufnahme, sobald der Embryo aus dem Sichtfeld geschwommen ist oder zur Ruhe zurückgekehrt ist.

- Wiederholtes Testen der gleichen Larven kann bei einigen Krankheitsmodellen zu Gewöhnung führen oder Muskelschwäche fördern, was zu einer verminderten Reaktion auf den taktilen Reiz führt. Daher sollte jeder Embryo nur einmal getestet werden.