Optokinetic Response Assay: Eine Methode zur Messung der Sehschärfe bei Zebrafischen

- Sichern Sie einen betäubten Fisch auf einer Plattform, wobei seine Augen und Kiemen über den Rand der Plattform hinausragen. Positionieren Sie den Fisch aufrecht in einem mit Wasser gefüllten Zylinder in einer gut beleuchteten Trommel, die sich frei drehen kann. Sobald der Fisch wieder zu sich kommt, was durch Kiemen- und Augenbewegungen angezeigt wird, legen Sie ein Gitter oder Muster aus abwechselnd weißen und schwarzen vertikalen Streifen in die Trommel. Platzieren Sie nun einen durchgehenden schwarzen Okkluder über den Streifen in der Ansicht des linken Auges.

Beginnen Sie mit der Drehung und zeichnen Sie die optokinetische Reaktion, OKR, für das rechte Auge auf. Das OKR besteht aus reflexiven Augenbewegungen als Reaktion auf einen visuellen Reiz. Ersetzen Sie das Muster durch immer kleinere schwarz-weiße Streifen, bis keine Augenbewegungen mehr zu beobachten sind. Führen Sie das gleiche Verfahren für das linke Auge durch.

Um die monokulare Sehschärfe zu berechnen, die Fähigkeit, feine Details zu unterscheiden, messen Sie den Abstand von der Mitte der Augenlinse zum Muster und die Länge des kleinsten Musters eines Paares von weißen und schwarzen Streifen, bei dem eine Augenbewegung beobachtet wurde. Im Beispielprotokoll werden wir die optokinetische Reaktion verwenden, um die monokulare und binokulare Sehschärfe bei erwachsenen Zebrafischen zu messen.

- Optokinetische Untersuchungen werden mit einem speziell angefertigten Aufzeichnungsgerät durchgeführt, das eine rotierende Trommel mit einem Durchmesser von 14,5 Zentimetern, ein Stereomikroskop mit einstellbaren Lichtintensitätseinstellungen, einen Computer und eine Kamera für die Aufnahme von Bildern und Aufzeichnungen verwendet. Ein computergesteuerter Mikrocontroller wird verwendet, um die Drehzahl der rotierenden Trommel und die Schleuderrichtungen einzustellen. Beginnen Sie eine Analyse mit Fischen, die unter Standardbedingungen gehalten werden, indem Sie einen Fisch zwei bis drei Minuten lang mit 0,016 % Tricain betäuben und ihn dann auf eine kleine Plattform legen, wobei die Augen und Kiemen über der Kante hängen.

Um den Fisch bewegungsunfähig zu halten und gleichzeitig Verletzungen zu vermeiden, legen Sie einen dünnen Schwamm oder ein Handtuch über den Körper des Fisches und stecken Sie zwei bis drei Stücke Schaumstoff über den Fisch, um sicherzustellen, dass die Bewegung des Schwanzes begrenzt ist. Positionieren Sie den Fisch in einem zylindrischen, mit Wasser gefüllten Tank, der in die rotierende Trommel des OKR-Aufnahmegeräts passt. Verwenden Sie Magnete auf der Plattform, um den Fisch aufrecht zu positionieren, wobei die Augen etwa 7,3 Zentimeter vom Rand der Trommel entfernt sind.

Sobald der Fisch aus der Narkose wiederbelebt ist und normale Atmung und zufällige Augenbewegungen beobachtet werden, legen Sie ein Basisgitter von 0,07 Zyklen pro Grad (CPD) in die rotierende Trommel und aktivieren Sie die Computersteuerung, um mit der Drehung und Videoaufnahme zu beginnen. Nachdem ein erstes OKR durch das Basisgitter hervorgerufen wurde, pausieren Sie die Drehung kurz und ersetzen Sie das Gitter durch ein kleineres Gitter mit höherer Ortsfrequenz. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit sequenziell kleineren Gittern, bis kein OKR mehr hervorgerufen werden kann. Um den Verlust von OKR zu überprüfen, führen Sie nach einem modifizierten Treppenansatz einen erneuten Test mit dem kleinsten Gitter durch, das ein OKR verursacht hat, und dann mit dem Gitter, das keine Antwort hervorgerufen hat, um den Verlust des OKR zu bestätigen.

Um monokulare Sehschärfemessungen zu erhalten, platzieren Sie einen schwarzen Kunststoffokkluder über den Streifen neben dem gegenüberliegenden Auge und wiederholen Sie den Datenerfassungsvorgang. Wechseln Sie dann zum anderen Auge, indem Sie den Okkluder neu positionieren und Messungen vornehmen. Verwenden Sie den Referenzmessstreifen unter dem Aquarium, um den Abstand jedes Auges vom Streifen zu notieren, um genaue Sehschärfemessungen durchzuführen.

Um die Sehschärfe zu bestimmen, berechnen Sie die CPD mit der folgenden Formel, wobei a der Abstand von der Mitte der Linse zum Gitter und h die Länge eines Zyklus des kleinsten Gitters ist, bei dem OKR beobachtet wurde. Verwenden Sie für kombinierte Sehschärfemessungen einen durchschnittlichen a-Wert, der sowohl vom linken als auch vom rechten Auge berechnet wird.