Morpholino-Injektion: Eine Methode zur Unterdrückung der Zielgenexpression zur Untersuchung der Funktion im Zebrafisch

- Ein Ansatz, um die Funktion eines Gens zu bestimmen, besteht darin, seine Expression zu unterdrücken und die Wirkung zu beobachten. Morpholino-Oligomere werden häufig in Knock-down-Studien an Zebrafischen verwendet. Ein Morpholino ist ein synthetisches DNA-ähnliches Molekül mit einer Länge von etwa 25 Basen, das die Expression des Zielgens hemmt.

Für die Morpholino-Behandlung legen Sie einen betäubten Fisch mit einer teilweise amputierten Schwanzflosse auf eine Injektionsplatte und positionieren Sie die Platte unter einem Stereomikroskop. Injizieren Sie nur die dorsale Seite, während die nicht injizierte ventrale Seite als Kontrolle dient. Morpholinos können auf zwei Arten funktionieren, abhängig von der Sequenz, auf die sie abzielen. Zunächst binden sie sich an die Translationsstartstelle auf einer mRNA und verhindern die Proteinsynthese, indem sie die Translation blockieren.

Zweitens kann es an die Intron-Exon-Verbindung auf einer Prä-mRNA binden und ein ordnungsgemäßes Spleißen verhindern, was zu einem defekten Transkript führt, das von der Zelle abgebaut wird. Untersuchen Sie später die Schwanzflossen auf Auswuchs. Unterschiede zwischen dem Nachwachsen der morpholinobehandelten und der unbehandelten Region deuten darauf hin, dass das Zielprotein eine Rolle bei der Flossenregeneration spielt. In diesem Protokoll werden wir Morpholinos als Teil eines Assays zur Regeneration der Schwanzflosse verwenden.

- Stellen Sie am Tag vor der Morpholino-Injektion eine Injektionsplatte mit 2 % Agarose her, die an einem Ende der Vertiefung eine Kerbe ausgeschnitten hat, die dazu beiträgt, den Fisch für den Injektionsvorgang zu stabilisieren. Kurz vor der Injektion verdünnen Sie das mit Fluoroscein markierte Morpholino in RNAase und DNAase-freiem Wasser auf die richtige Konzentration und inkubieren Sie es fünf Minuten lang in einem 65 Grad Celsius warmen Wasserbad. Legen Sie eine zuvor vorbereitete Injektionsnadel ein und schneiden Sie die Spitze schräg ab.

Betäuben Sie anschließend den Fisch und legen Sie ihn auf die Injektionsplatte. Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit und stellen Sie die Platte auf den Tisch eines Stereomikroskops. Richten Sie die Nadel nur distal zum knöchernen Strahl aus.

Führen Sie die Nadel vorsichtig in das regenerative Gewebe ein, genau distal zu jedem knöchernen Strahl, und drücken Sie sie distal, bis sie sich im Blastem befindet. Wenn die Nadel richtig lokalisiert ist, befolgen Sie die Anweisungen des Mikroinjektionssystems und injizieren Sie pro Injektion einen Tropfen von fünf Nanolitern des Morpholinos. Bei jeder Injektion ist ein gelber Puff Morpholino-Lösung zu sehen, der hilft, die Injektion in das Blastem zu lokalisieren. Injizieren Sie dorsal von der Mittellinie aus etwa 75 Nanoliter Morpholino pro Knochenstrahl auf der dorsalen Seite, wobei die ventrale Seite als reine Elektroporationssteuerung verbleibt.