Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung mit einem inversen Mikroskop

- Beginnen Sie mit einer Petrischale, die Embryonen im E3-Medium enthält. Fügen Sie Tricain hinzu, um die Embryonen zu betäuben, und Phenylthiouria, PTU-Lösung, um die Pigmentbildung zu hemmen. Mit Hilfe eines Präpariermikroskops werden die Embryonen dechorioniert.

Übertragen Sie einen der dechorionierten Embryonen mit einer Glaspipette in eine kleine Petrischale mit einem flachen Glasboden in der Mitte, und entfernen Sie das überschüssige Medium. Geben Sie anschließend eine Agaroselösung in einer optimalen Konzentration, um die Verzerrung und Motilität des Embryos zu minimieren, in ein Mikrofugenröhrchen und erhitzen Sie es. Senken Sie die Temperatur auf 30 Grad Celsius, um den Embryo nicht durch Hitze zu beschädigen.

Gießen Sie die erste Schicht Agarose über den Embryo und füllen Sie die flache Vertiefung vollständig aus. Stellen Sie ein weiteres Deckglas über die Vertiefung und fügen Sie 1% Agarose hinzu. Die zweite Schicht hält das Deckglas an Ort und Stelle.

Sobald die Agarose fest wird, füllen Sie die Petrischale mit dem E3-Medium, das Tricain enthält. Dies ist die dritte Schicht und hält die Agarose und den Embryo mit Feuchtigkeit versorgt. Im folgenden Protokoll werden wir eine geschichtete Agar-Einbettung von Zebrafischembryonen für die erweiterte Zeitraffer-Bildgebung durchführen.

- Erhitzen Sie die Agaroselösung kurz vor dem Einbetten auf 65 Grad Celsius und lassen Sie sie dann auf etwa 30 Grad Celsius abkühlen, damit der Embryo durch die Hitze nicht geschädigt wird, und fügen Sie der Agaroselösung Tricain hinzu. Verwenden Sie 35 Millimeter Glasbodenschalen mit einem mit der Zahl Null abgedeckten Glasboden. Platzieren Sie einen dechorionierten Embryo vorsichtig mit einer seiner seitlichen Seiten zum Boden der Schale mit einer Glaspipette oder einer Mikropipette. Entfernen Sie dann vorsichtig das restliche E3 mit einer Mikropipette.

Geben Sie die erste Agaroselösung in die kleine Vertiefung, die durch das am Boden der Schale befestigte Deckglas entsteht, um den Embryo abzudecken, und achten Sie darauf, dass die Agarose die kleine Vertiefung bedeckt, aber nicht überläuft. Decken Sie die kleine Vertiefung mit dem Deckglas ab, um mit dem Embryo zwischen den beiden Deckgläsern einen schmalen, mit Agarose gefüllten Raum zu schaffen. Lege eine Schicht 1%ige Agaroselösung auf das Deckglas auf den Boden der Schale, damit das Deckglas an Ort und Stelle bleibt, während es sich verfestigt. Füllen Sie dann den restlichen Teil der Schale mit E3 mit 0,02 % Tricain, um das System mit Feuchtigkeit zu versorgen. Um die optimale Agarosekonzentration für die erste Schicht zu ermitteln, montieren Sie die Embryonen in steigende Agarosekonzentrationen und führen Sie eine Zeitrafferbildgebung durch, um die Konzentration zu identifizieren, die die Verzerrung und Motilität des Embryos minimiert, und testen Sie dann basierend auf den Ergebnissen einen feineren Konzentrationsbereich.

- Der wichtigste Schritt dieses Protokolls besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose für die erste Schicht zu ermitteln. Testen Sie verschiedene Nano-Konzentrationen von Agarose, wie z. B. 0,030 %, 0,032 % usw., um die optimale Konzentration zu finden.