0 Aufrufe • 2:47 Min. • April 30th, 2023
- Übertragen Sie einen mit Tricain betäubten Fisch mit der Rückenseite nach oben auf einen nassen Schwamm. Legen Sie den Schwamm mit dem Fisch unter ein Mikroskop. Positionieren Sie eine Mikroinjektionsnadel in einem Winkel von 45 Grad zur Körperachse in der Nähe des Rückenmuskels.
Suchen Sie als Nächstes die Stelle vor der Rückenflosse, die nicht mit Schuppen bedeckt ist, an der Sie die Nadel ohne großen Kraftaufwand einführen können. Führen Sie dann die Nadel vorsichtig ein und injizieren Sie langsam die interessierende Verbindung zusammen mit einem Marker wie Phenolrot in den Muskel.
Wenn die interessierende Verbindung genetisches Material enthält, elektropolieren Sie die Zellen, indem Sie Elektroden auf beiden Seiten der Injektionsstelle platzieren und den Strom verabreichen. Die Strömung macht die Muskelzellen durchlässig und in der Lage, das Erbgut effizient aufzunehmen. Setzen Sie den Fisch nach dem Eingriff sofort in ein Auffangbecken um. Im folgenden Protokoll werden wir eine intramuskuläre Injektion an einen erwachsenen Zebrafisch durchführen, um einen DNA-Impfstoff gegen Mykobakteriose zu verabreichen.
Um den Fisch während der Injektion in einer festen Position zu halten, verwenden Sie als Polsterung ein Stück Schwamm mit einer in der Mitte eingeschnittenen Rille. Weichen Sie den Schwamm gründlich in Systemwasser ein und legen Sie ihn in eine Petrischale. Übertragen Sie mit einem Plastiklöffel einen betäubten Zebrafisch mit der Bauchseite nach unten in die Rille auf den nassen Schwamm. Platzieren Sie die Nadel unter dem Mikroskop in einem 45-Grad-Winkel nahe dem Rückenmuskel des Zebrafisches. Finde dann den kleinen Fleck ohne Schuppen vor der Rückenflosse und schiebe die Nadel in den Muskel.
Wenn ein Widerstand zu spüren ist, versuchen Sie es mit einer angrenzenden Stelle. Verwenden Sie einen Fußschalter, um die Plasmidlösung nach und nach in den Muskel zu injizieren. Unter dem Mikroskop sollte das Phenolrot sichtbar sein, wenn es in das Muskelgewebe eindringt.
Elektropopolieren Sie den Fisch unmittelbar nach der Injektion, indem Sie die Pinzettenelektroden an jeder Seite der Injektionsstelle platzieren. Drücken Sie die Start-Taste am Elektroporator und geben Sie ihm sechs Impulse mit 40 Volt und 50 Millisekunden. Setzen Sie den Fisch dann vorsichtig in ein Auffangbecken um. Nachdem Sie den Fisch gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, verwenden Sie schließlich ein UV-Licht, um die EGFP-Expression in der Nähe der Injektionsstelle zu sehen.