0 Aufrufe • 3:21 Min. • April 30th, 2023
- Ein Xenotransplantat ist ein Organ oder Gewebe, das einer Spezies entnommen und in eine andere transplantiert wird. Ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat (PDX) ist ein Krebsmodell, bei dem Gewebe aus dem Tumor eines Patienten in ein immundefizientes Tier implantiert wird, z. B. in eine Zebrafischlarve, deren Immunsystem noch nicht vollständig entwickelt ist, um das Fortschreiten des Tumors oder die Wirksamkeit des Medikaments zu untersuchen. Zuerst werden die Larven 48 Stunden nach der Befruchtung in Tricainlösung betäubt und eine Larve auf eine Injektionsplatte übertragen, die Agarose enthält, die mit E3-Medium hergestellt wurde.
Laden Sie anschließend die Suspension der Transplantatzellen des Patienten und übertragen Sie sie in eine Mikrokapillarnadel. Unter dem Mikroskop injizieren Sie die Zellen mit einer Mikrokapillarnadel in den Dottersack der Larve. Kultivieren Sie nun die injizierten Larven in einer E3-Lösung, die Glukose und L-Glutamin enthält, was den hohen Energiebedarf der Xenotransplantatzellen unterstützt.
Für die medikamentöse Behandlung übertragen Sie die xenotransplantierten Larven in eine Vertiefungsplatte, unterteilen Sie die Vertiefungen in Gruppen basierend auf der Anzahl und Dosis der zu testenden Verbindungen und fügen Sie die Verbindungen hinzu. Schließen Sie eine Kontrollgruppe ein. Inkubieren Sie die behandelten Larven bei 32 Grad Celsius, bevor Sie die Behandlungsergebnisse beobachten.
Im folgenden Protokoll werden wir die Medikamente Gemcitabin und Navitoclolax in einem zPDX-Modell des Bauchspeicheldrüsenkrebses untersuchen.
- Nach der Betäubung der Zebrafischlarven werden diese in die Injektionsplatte überführt, die mit modifiziertem E3 gefüllt ist. Nehmen Sie 25 Mikroliter der gemischten Zellsuspension in die Mikrokapillarnadel auf und führen Sie die Nadel in den Mikroinjektionsmanipulator ein. Stellen Sie den Injektionsdruck und die Injektionszeit ein und injizieren Sie 50 bis 80 Zellen in den Dottersack des Zebrafischs 48 Stunden nach der Befruchtung.
Übertragen Sie die post-xenotransplantierten Zebrafischlarven in 40 Milliliter Mischlösung bei 32 Grad Celsius. Geben Sie 10 xenotransplantierte Larven in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Als nächstes teilen Sie die Larven in vier Gruppen ein.
Die Kontrollgruppe ist mit E3 mit 0,1 % DMSO zu behandeln und die anderen Gruppen mit Gemcitabin und/oder Navitoclolax zu behandeln. Inkubieren Sie alle Larven zwei Tage lang bei 32 Grad Celsius. Nachdem Sie die xenotransplantierten Larven nach der Behandlung betäubt haben, legen Sie sie in 3% Methylcellulose.
Verwenden Sie ein Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskop, um die Larven aus der Seitenansicht abzubilden. Verwenden Sie dann die Software Image J und Graph Pad, um die Intensität von roten und grünen Fluoreszenzsignalen zu quantifizieren.