Herzdissektion: Eine Methode zur Beobachtung der Herzentwicklung von Zebrafischen

- Ein Zebrafischherz besteht aus vier Kammern, dem Sinus venosus, dem Vorhof, dem Ventrikel und der knolligen Arteriose. Es befindet sich anterior auf der ventralen Seite zwischen dem Operculum und dem Brustgürtel, einem Teil des Skelettsystems, der die Brustflosse stützt. Um das Herz zu präparieren, legen Sie einen euthanasierten fixierten Fisch in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält, um einen konstanten pH-Wert des Fischgewebes aufrechtzuerhalten, und richten Sie ihn mit der Bauchseite nach oben aus.

Halten Sie den Fischkopf mit einer Pinzette zwischen Augen und Kiemen. Schneiden Sie mit einer Mikroschere über die Kiemen, über den vorderen Bauch und dann vertikal und verbinden Sie die ersten beiden Schnitte. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette die Brustflosse und den darunter liegenden Brustgürtel, um das silberne Perikard freizulegen, die Membran, die das Herz bedeckt. Entfernen Sie das Perikard mit einer Pinzette, um das Herz sichtbar zu machen. Schneiden Sie nun die Arterie durch, die mit der knolligen Arteriose verbunden ist.

Platzieren Sie dann eine Pinzette unter dem Vorhof und schöpfen Sie das Herz aus der Körperhöhle. Halten Sie das Herz mit der Pinzette fest und verwenden Sie eine weitere Pinzette, um unerwünschtes Gewebe außerhalb des Herzens zu entfernen. Im folgenden Protokoll werden wir das Herz von Fischen unterschiedlicher Größe sezieren, um ihre Entwicklung im Laufe des Lebens der Fische abzubilden.

- Weisen Sie jedem Fisch eine Zahlen-Buchstaben-Kombination zu, damit ein einzelner Fisch und das daraus resultierende präparierte Herz für eine spätere Analyse verfolgt werden können. Geben Sie alle Daten, einschließlich aller Messungen, in eine Tabelle ein und organisieren Sie sie basierend auf diesen Beschriftungen. Beschriften Sie die PCR-Röhrchenstreifen vor der Dissektion mit der zugewiesenen Sendungsverfolgungsnummer und füllen Sie die Röhrchen mit PBT oder einer anderen Lösung, die für die weitere Analyse geeignet ist. Richten Sie den Fisch mit der Bauchseite nach oben in einer Petrischale aus, während Sie den Körper mit einer Pinzette stabilisieren und den Kopf zwischen Augen und Kiemen halten. Bei Fischen, die kürzer als 12 Millimeter in der Standardlänge sind, entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette oder einer Mikronadel in einem Stecknadelhalter die Brustmuskeln und Flossen vom Körper, um das Herz freizulegen.

- Durch die ständige Bewegung der Pinzette während der Dissektion können Strömungen im PBT entstehen, die den Fisch bewegen. Dies ist vor allem bei kleineren Fischen problematisch. Dazu muss die Mikronadel verwendet werden, um Brustmuskeln und Flosse zu entfernen und die Körperhöhle zu öffnen.

- Schöpfen Sie mit der Pinzette das Herz vorsichtig aus der Höhle unter dem Vorhof. Wenn der Fisch einen fluoreszierenden Herzmarker enthält, verwenden Sie für die Dissektion ein Fluoreszenzskop und überprüfen Sie, ob das Herz durch Fluoreszenz entfernt wurde. Sobald das Herz aus der Höhle entfernt wurde, verwenden Sie die Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um überschüssiges nicht-kardiales Gewebe und die Epikardauskleidung von der Außenseite des Herzens zu entfernen.

Bei Fischen, die länger als 12 Millimeter in Standardlänge sind, machen Sie mit einer Mikroschere mit Federgriff drei Schnitte. Machen Sie zunächst einen Querschnitt durch die Kiemen. Zweitens, machen Sie einen weiteren Querschnitt am vorderen Bauch. Und drittens, machen Sie einen sagittalen Schnitt auf der Bauchseite, der beide Querschnitte verbindet. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette die Brustmuskeln und Flossen vom Körper, um die Körperhöhle zu öffnen und das silbrige Gewebe des Perikards freizulegen.

Entfernen Sie dieses Perikardgewebe. Und das Herz wird sichtbar werden. Schneiden Sie mit der Mikroschere die Arterie, die mit der knolligen Arteriose verbunden ist, die sich oberhalb des Herzens befindet. Sobald diese Arterie durchtrennt ist, platzieren Sie die Spitzen der Pinzette unter dem Vorhof und schöpfen Sie mit der Pinzette das Herz aus der Höhle. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung, da es später entfernt werden kann. Bei einigen Fischen ist es alternativ möglich, das Herz zu entfernen, indem man den Knollen vorsichtig herauszieht, und der Rest des Herzens folgt.

- Seien Sie vorsichtig mit der Position des Vorhofs, wenn Sie die alternative Technik anwenden, da er leicht beschädigt werden kann. Wenn es zusätzliches Gewebe gibt, das mit dem Herzen kommt, ist das in Ordnung und kann danach entfernt werden.

- Sobald das Herz aus der Höhle entfernt wurde, verwenden Sie die beiden Zangen, um das Herz zu halten und das überschüssige Gewebe zu entfernen, oder eine Pinzette, um das Herz zu halten, und eine Mikronadel, um überschüssiges nicht-kardiales Gewebe zu entfernen.