Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie
20. Juli 2010
Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Maushirngewebe für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem das Gehirn zunächst durch eine Perfusionsfixation des Tieres fixiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gehirn zu schneiden und die Schnitte für die Immunhistochemie aufzubereiten.
Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Schnitte zu ossifizieren, zu dehydrieren und einzubetten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Schneiden ultradünner Schnitte. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mit hoher räumlicher Auflösung die Verteilung verschiedener Proteine innerhalb unterschiedlicher Regionen und Zelltypen des zentralen Nervensystems zeigen.
Hallo, ich bin Maria Trombley aus dem Esca-Labor der Abteilung für Neurobiologie und Anatomie an der Universität von Rochester. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Vorbereitung von Maushirngewebe für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und Synapsen während der Entwicklung, der erfahrungsabhängigen Plastizität und des Alterns zu untersuchen.
Beginnen wir nun. Nachdem Sie das Maushirn durch intrakardiale Perfusion fixiert haben, fixieren Sie es anschließend in etwa 10 Milliliter Formaldehyd bei vier Grad Celsius für zwei Stunden. Waschen Sie das Gehirn bei vier Grad Celsius dreimal mit eiskaltem 1×PBS, jeweils zehn Minuten pro Waschgang, unter Verwendung eines Vibrators. Schneiden Sie das Gehirn unverzüglich in transversale 50-Mikrometer-Schnitte.
Verwenden Sie eine feine Bürste, um ausgewählte Schnitte in ein Glasfläschchen mit vier Grad Celsius zu überführen. Lagerung der verbleibenden Schnitte in XPBS mit Kryoprotektans bei minus 20 Grad Celsius für bis zu mehrere Jahre ohne Veränderung. Bearbeiten Sie maximal 10 frei schwimmende Schnitte pro Glasfläschchen für die Färbung.
Ersetzen Sie mit einer Transferpipette das eine XPBS durch frisches 0,1 % Natriumborhydrid in PBS. Wechseln Sie die Lösungen schnell, um zu verhindern, dass die Schnitte austrocknen. Inkubieren Sie 30 Minuten lang, spülen Sie die Schnitte anschließend dreimal je 10 Minuten mit einem XPBS. Achten Sie darauf, alle Blasen zu entfernen, und blockieren Sie mit einem XPBS, das 0,5 % Gelatine und 5 % normales Serum enthält, das für den verwendeten sekundären Antikörper geeignet ist.
Zwei Stunden inkubieren. Den primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt hinzufügen. 48 Stunden inkubieren.
3-mal 10 Minuten mit einem XPB S spülen. Jedes Mal 2 Stunden mit biotinyliertem sekundärem Antikörper, der in Blockierungslösung verdünnt wurde, inkubieren. Anschließend dreimal 10 Minuten in einem XPBS wie zuvor spülen.
Inkubieren Sie mit Streptavidin-Horseradish-Peroxidase, verdünnt in Blockierungslösung, für eine Stunde. Spülen Sie die Schnitte einmal in 1x PBS und zweimal in 1x TBS jeweils 10 Minuten lang. Um die Markierung sichtbar zu machen, inkubieren Sie die Schnitte mit einer frisch zubereiteten Lösung, die 0,05 % DAB und 0,01 % Wasserstoffperoxid in 1x TBS enthält.
Wenn die Färbung sichtbar dunkelbraun ist oder die Reaktion fünf Minuten gedauert hat, spülen Sie die Schnitte mit einem XTBS, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend einmal mit einem XTBS und zweimal mit einem x PB je 10 Minuten spülen. Über einer Abzugshaube die Schnitte mit einem feinen Pinsel in eine Mehrfachbrutschale überführen, die mit einem XPB gefüllt ist.
Entfernen Sie das PB aus einem Gut mit einem feinen Pinsel, um die Schnitte sofort flach zu verteilen. Geben Sie eine Lösung von 1% Osmiumtetroxid in einem x PB hinzu, bevor Sie zum nächsten übergehen, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Überführen Sie die OSM-Schnitte in Glasfläschchen.
Spülen Sie dreimal für jeweils 10 Minuten mit einem XPB. Dehydrieren Sie die Schnitte in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol. Anschließend Propylenoxid, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben.
Verwenden Sie einen feinen Pinsel, der in Propylenoxid gespült wurde, um die Schnitte in frisch zubereiteten Dupant-Harz zu überführen. Stellen Sie die Schale mit den Schnitten zur Imprägnierung über Nacht für 10 Minuten in einen Ofen mit 55 Grad Celsius. Um das Harz zu erweichen, beschichten Sie mit einem in Propylenoxid gespülten Pinsel einen chlorhaltigen Einbettungsfolie mit einer dünnen Harzschicht.
Übertragen Sie den Schnitt auf die Folie und bedecken Sie ihn gleichmäßig mit einer weiteren Einbettfolie. Verteilen Sie gleichmäßig Gewichte mit einem Gewicht von etwa zwei Gramm darauf, um das Auslaufen des Harzes zu unterstützen. Lassen Sie das Harz 48 bis 72 Stunden bei 55 Grad Celsius in einem Inkubator polymerisieren. Entfernen Sie nach der Polymerisation die Gewichte in der oberen Schicht der Einbettfolie unter einem Binokularmikroskop.
Wählen Sie zwei mal zwei Millimeter große interessierende Bereiche aus und schneiden Sie diese mit einem Rasiermesser aus dem Film aus. Befestigen Sie die interessierenden Bereiche mit Sekundenkleber an den Spitzen von Harzblöcken. Aushärten im 55 Grad Celsius warmen Inkubator für eine Stunde.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Harzblock auf die Form eines gleichschenkligen Trapezes zuzuschneiden, der optimalen Form für das ultradünne Aufsaugen. Entfernen Sie mit einem Mikrotom und einem Glasmesser den Kleber an der Oberfläche des Gewebes, um eine ebene Oberfläche zu erhalten. Zum Aufsaugen.
Füllen Sie das Boot des Glasmessers mit doppelt destilliertem Wasser und schneiden Sie einige Schnitte zwischen 0,5 und einem Mikrometer. Übertragen Sie die Schnitte mit einer perfekten Schleife auf einen Super-Frost-Objektträger. Trocknen Sie sie eine Minute lang auf einer Heizplatte bei 80 Grad Celsius und färben Sie sie eine Minute lang mit 0,1 % Methylenblau.
Spülen Sie mit einer Sprühflasche überschüssiges Farbstoffmittel mit doppelt destilliertem Wasser ab. Untersuchen Sie die Schnitte unter einem Lichtmikroskop, um den gefärbten Gewebebereich vom Harz zu unterscheiden. Schneiden Sie semidünne Schnitte, bis die Grenzfläche zwischen Gewebe und Harz ungefähr die Mitte des Schnitts erreicht. Ersetzen Sie das Glasmesser durch ein Diamantmesser und füllen Sie das Boot mit doppelt destilliertem Wasser.
Schneiden Sie das Silber auf silberfarbenes Gold extrem dünn. Schneiden Sie Abschnitte mit einer Dicke von 60 bis 80 Nanometern. Sammeln Sie die Abschnitte vorsichtig mit feinen invertierten Pinzetten auf Kupfer-Maschennetzen.
Trocknen Sie die Objektträger auf Filterpapier, um den Kontrast zu verbessern. Verwenden Sie feine invertierte Pinzette, um einen Objektträger zwei Minuten lang in einen Tropfen Zitratblei zu überführen. Spülen Sie den Objektträger vorsichtig ab, indem Sie ihn nacheinander in drei Bädern aus doppelt destilliertem Wasser eintauchen.
Trocknen Sie das Objektträgergitter auf Filterpapier und lagern Sie es in einer Gitterbox zur späteren Untersuchung im Elektronenmikroskop. Untersuchen Sie die Gitter im Elektronenmikroskop, um die Immunfärbung sowie die Morphologie zellulärer Strukturen sichtbar zu machen, einschließlich ihrer intrazellulären Organellen und der räumlichen Beziehungen untereinander.
Hier ist eine repräsentative Immunfärbung für IBA one auf der Lichtmikroskop-Ebene dargestellt. Die zelluläre Verteilung von IBA one ist auf Mikroglia beschränkt, was seine Spezifität auf der Elektronenmikroskop-Ebene bestätigt. IBA one, immunogefärbte Mikroglia-Perikaryen und -Fortsätze sind sichtbar.
Die Immunperoxidase-DAB-Färbung erscheint als elektronendichtes Präzipitat. Weitere Beispiele für IBA1-immunogefärbte Mikrogliafortsätze zeigen unterschiedliche Größen und Formen. Bei höherer Vergrößerung werden verschiedene intrazelluläre Organellen innerhalb eines Mikrogliafortsatzes sichtbar sowie die ultrasruckturellen Beziehungen zwischen einem weiteren Mikrogliafortsatz und benachbarten Elementen des Neuropils, einschließlich Synapsen.
Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Gehirngewebe von Mäusen für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung vorbereitet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Schritte streng einzuhalten und das Gehirngewebe schonend zu behandeln. Das war's.
Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung von Maushirngewebe für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung. Es umfasst die transkardiale Perfusion, das Schneiden von Gehirnschnitten und die Immunperoxidase-Färbung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Histologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Das Verständnis der Proteindistribution im zentralen Nervensystem ist entscheidend für die Neurowissenschaftliche Forschung.
- Die immunoelektronenmikroskopische Untersuchung liefert Bilder mit hoher räumlicher Auflösung.
- Eine sachgemäße Vorbereitung des Hirngewebes ist für genaue Ergebnisse unerlässlich.
- Dieses Protokoll ist für Forscher konzipiert, die mit Mausmodellen arbeiten.
Zweck der Studie
- Vorbereitung von Maushirngewebe zur detaillierten Untersuchung.
- Visualisierung der Verteilung von Proteinen in verschiedenen Hirnregionen.
- Verbesserung des Verständnisses zellulärer Strukturen im zentralen Nervensystem.
Verwendete Methoden
- Transkardiale Perfusion zur Fixierung des Gehirns.
- Schnittführung des Gehirns für die Immunhistochemie.
- Einbetten und Dehydrieren der Gehirnschnitte.
- Schneiden ultradünner Schnitte für die Elektronenmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Vorbereitung von Hirngewebe für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung.
- Erzielung hochauflösender Bilder zur Darstellung der Proteindistribution.
- Nachweis der Wirksamkeit des beschriebenen Protokolls.
- Gewinnung von Erkenntnissen über zelluläre Strukturen im zentralen Nervensystem.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll eignet sich zur Aufbereitung von Maushirngewebe.
- Mithilfe der Immun-Elektronenmikroskopie kann eine detaillierte Lokalisation von Proteinen aufgezeigt werden.
- Diese Methode kann auf verschiedene neurowissenschaftliche Studien angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die hochauflösende Visualisierung der Proteinlokalisation im Maushirngewebe und unterstützt die Zielvalidierung sowie die mechanistische Entwederung im Bereich der neurowissenschaftlichen Arzneimittelentwicklung. Durch die Kombination von Immunzytochemie mit Transmissionselektronenmikroskopie können Forscher die subzelluläre Verteilung therapeutischer Zielstrukturen präzise beurteilen, was Hypothesentests in frühen Entwicklungsstadien und die Priorisierung von Projekten unterstützt. Die Methode erhöht das Vorhersagevertrauen in Studien zur Zielstrukturenbindung und zur Modulation von Signalwegen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Proteinausprägung in spezifischen neuronalen und glialen Kompartimenten.
- Operationaler Wert: Liefert ultrasruckturelle Bestätigung der Antikörperspezifität und Zielstrukturenbindung in definierten Zelltypen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem intrazelluläre Organellenassoziationen und synaptische Beziehungen von Zielproteinen aufgeklärt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Gewebeproben, die für die quantitative immunhistochemische Untersuchung geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung der Proteindichte und ultrastrukturellen Lokalisation in Dendriten, Axonen und Synapsen.
- Plattformnutzung: Etabliert einen validierten Arbeitsablauf zur Bewertung der Verteilung von Zielstrukturen über verschiedene Hirnregionen und Krankheitsmodelle hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Ermöglicht die Untersuchung von Zielstrukturen in Modellen neurodegenerativer und neurodevelopmentaler Erkrankungen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet molekulare Erkenntnisse von der Entdeckung bis zur ultrasruckturellen Validierung in präklinischen Systemen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem unerwünschte Bindungen oder unerwartete zelluläre Lokalisationen aufgedeckt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur präklinischen Validierung ein und ermöglicht eine iterative Verbesserung therapeutischer Kandidaten basierend auf Daten zur subzellulären Proteindistribution.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Expression des Zielmoleküls in Mikroglia, Astrozyten, Neuronen und subzellulären Domänen aufgezeigt wird.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative immunhistochemische Ergebnisse zur Beurteilung der Zielstrukturenbindung unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Bietet hochauflösende räumliche Messwerte, die Teams dabei unterstützen, die Lokalisation von Proteinen mit funktionellen Ergebnissen zu korrelieren.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Befunde mit der Architektur intakter Gewebe und unterstützt die Validierung von Biomarkern sowie mechanistischen Zusammenhängen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Charakterisierung von Zentralnervensystem-Zielen über mehrere Projekte und therapeutische Bereiche hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten und Klärung der Beteiligung von Signalwegen.
- Operationaler Wert: Standardisierung der Gewebepräparation, Reproduzierbarkeit über verschiedene Schnitte hinweg und Skalierbarkeit für die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Zielstrukturen.
- Strategischer Wert: Verbesserte Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, Kapitaleffizienz durch frühzeitige Risikominimierung und geringeres Risiko biologischer Fehlschläge in späteren Entwicklungsphasen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten subzellulären Expressionsmustern.
Durchführungsüberlegungen
- Setzt Fachkenntnisse in Perfusionsfixierung, Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie voraus.
- Benötigt Zugang zu Mikrotomen, Ultramikrotomen und Durchstrahlelektronenmikroskopen.
- Erfordert die Standardisierung der Antikörpervalidierung, Blockierbedingungen und DAB-Reaktionskontrollen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene Hirnregionen, Entwicklungsstadien und Krankheitsmodelle.
- Ist durch Gewebeverfügbarkeit, Fixierungsartefakte und die Notwendigkeit sorgfältiger Handhabung zur Erhaltung der Ultrastruktur begrenzt.
