Transduktion zur Markierung von PDX-Tumorzellen: Einführung eines Lentivirus-exprimierenden fluoreszierenden Markers in die Tumorzelle in vitro

Das Lentivirus ist ein Retrovirus, das genetisches RNA-Material enthält. Dieses Virus bietet eine effiziente und stabile Methode, um Transgene in Krebszelllinien einzuführen. Beginnen Sie damit, Neuraminidase in ein Röhrchen zu geben, das Lentivirus enthält, das grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimiert. Halten Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um die Bindungseffizienz des Virus zu erhöhen.

Zentrifugieren Sie anschließend ein Röhrchen mit der Tumorzellsuspension, um ein Pellet zu bilden. Fügen Sie Mammosphärenmedien hinzu, die Polybren enthalten, um die Zellen zu resuspendieren. Polybren ist ein kationisches Polymer, das die Effizienz lentiviraler Infektionen erhöht. Plattieren Sie nun die optimale Anzahl von Tumorzellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Geben Sie die erforderliche Menge Lentivirus in jede Vertiefung der Kulturplatte.

Schwenken Sie die Platte, um den Inhalt zu mischen, und halten Sie sie 96 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit einer kontinuierlichen Zufuhr von Kohlendioxid. Das Lentivirus dringt in die Zelle ein und setzt RNA frei. Die virale reverse Transkriptase wandelt die RNA in doppelsträngige DNA um, die sich in das Wirtsgenom integriert. Legen Sie die Platte unter ein Fluoreszenzmikroskop und überwachen Sie die Zellen für eine erfolgreiche Transduktion. Die transduzierten Zellen fluoreszieren aufgrund der GFP-Expression.

Im Beispielprotokoll führen wir die Transduktion von PDX-dissoziierten Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren durch.

Um die Tumorzellen zu transduzieren, zentrifugieren Sie die isolierten Zellen für die Resuspension in zwei Millilitern Mammosphärenmedium. Nach dem Zählen zentrifugieren Sie die Zellen erneut und resuspendieren das Pellet in zwei Millilitern Mammosphärenmedium, ergänzt mit 20 Mikrolitern Polybrene. Als nächstes wird die Platte 2 mal 10 auf die fünfte lebensfähige Tumorzelle pro Vertiefung in einer extrem niedrigen Adhärenz von sechs Well-Gewebekulturplatten und lentivirale Partikel auf die Zellen bei einer Multiplizität von 10 Infektionen aufgebracht.

Schwenken Sie die Platte, um das Virus mit den Zellen zu vermischen, und inkubieren Sie die Co-Kulturen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bis zu 96 Stunden lang, wobei Sie nach den ersten 24 Stunden 500 Mikroliter frisches Mammosphärenmedium hinzufügen. Wenn mindestens 10 % der Zellen GFP-positiv sind, übertragen Sie die transduzierten Zellen aus mindestens einer Vertiefung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis und waschen Sie die Vertiefung mit einem Milliliter Mammosphärenmedium.

Poolen Sie die Wäsche mit den Zellen und zentrifugieren Sie die Tumorzellen in 10 Millilitern HBSS plus HEPES. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen in 50 Mikrolitern Basalmatrix-Extrakt auf Eis und laden Sie die eingebetteten Zellen in eine 0,5-Milliliter-Insulinspritze zur Reimplantation.