Dezellularisierung von Brustfettpolstern: Ableitung von extrazellulären Matrix-Hydrogelen aus Brustfettpolstern

Legen Sie zunächst Brustfettpolster oder MFPs in eine Schale mit Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für die gewünschte Dauer, um die Zellmatrix-Adhäsionen aufzubrechen. Waschen Sie die MFPs mit entionisiertem Wasser und seihen Sie sie durch ein Sieb. Geben Sie die Taschentücher in ein Becherglas mit einem Rührstab und fügen Sie Triton X-100 hinzu. Rühren Sie um, um die Zellen zu lysieren, ohne die Wachstumsfaktoren in der extrazellulären Matrix des Gewebes zu beeinflussen.

Die MFPs abseihen und mit entionisiertem Wasser abspülen. Übertragen Sie das Gewebe zurück in das Becherglas und fügen Sie Desoxycholsäure hinzu, um die verbleibenden Zellen zu lysieren. Als nächstes die MFPs abseihen und in ein Becherglas geben, das entionisiertes Wasser mit Penicillin-Streptomycin enthält, um eine Kontamination zu verhindern. Inkubieren Sie den Becher über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Die MFPs abseihen und in ein Becherglas geben, das Ethanol und Peressigsäure enthält. Die Peressigsäure erhöht die Steifigkeit der extrazellulären Matrix des Gewebes. Rühren Sie einige Zeit um und wiederholen Sie den Siebschritt. Waschen Sie die MFPs mit PBS und dann mit entionisiertem Wasser. Übertragen Sie die gespannten MFPs in ein Becherglas, das Propan-1-ol enthält.

Rühren Sie einige Zeit um, seihen Sie den Inhalt ab und waschen Sie die MFPs mit entionisiertem Wasser. Trocknen Sie die MFPs und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Im folgenden Protokoll werden wir die Dezellularisierung von murinen Brustfettpolstern durchführen.

Legen Sie zunächst die MFPs in sechs Zentimeter große Schalen mit fünf Millilitern Trypsin-EDTA-Lösung. Besprühen und wischen Sie das Geschirr mit 70% Ethanol und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie 0,7-Millimeter-Siebe, um die MFPs mit entionisiertem Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zwischen den Wäschen manuell zu massieren.

Trocknen Sie anschließend das Taschentuch kurz auf einem feinen Tuch und wiegen Sie es. Die getrockneten Gewebe werden in ein vorautoklaviertes Becherglas gegeben, das einen Rührstab geeigneter Größe enthält, und das Gewebe mit 60 Millilitern 3 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol pro Gramm Gewebe bedeckt. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur umrühren. Kippen Sie dann den Inhalt des Bechers in ein Sieb.

Spülen Sie das Becherglas mit entionisiertem Wasser aus und gießen Sie dieses auf das Taschentuch. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang noch zwei weitere Male und achten Sie darauf, das Gewebe zwischen den Spülungen manuell mit einer Pinzette zu massieren. Trocknen Sie danach das Tuch kurz auf einem feinen Arbeitstuch ab und wiegen Sie es. Legen Sie die Taschentücher und die Rührstäbchen zurück in die gleichen Becher und bedecken Sie sie mit 60 Millilitern 4%iger Desoxycholsäure pro Gramm Gewebe. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur rühren.

Kippen Sie anschließend den Inhalt des Becherglases in ein Sieb. Spülen Sie das Becherglas mit entionisiertem Wasser aus und gießen Sie dieses auf das Taschentuch. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang noch zwei weitere Male und achten Sie darauf, das Gewebe zwischen den Spülungen manuell mit einer Pinzette zu massieren. Trocknen Sie das ausgespülte Tuch kurz auf einem feinen Tuch und wiegen Sie es.

Geben Sie das getrocknete Gewebe zusammen mit frischem entionisiertem Wasser, das mit 1 % Penicillin-Streptomycin versetzt ist, in dasselbe Becherglas. Decken Sie das Becherglas fest mit Paraffinfolie ab und lassen Sie es über Nacht bei 4 Grad Celsius stehen. Am nächsten Tag den Becherinhalt in ein Sieb abtropfen lassen. Trocknen Sie das Tuch kurz auf einem feinen Arbeitstuch und wiegen Sie es. Legen Sie dann die MFPs in denselben Becher mit einem entsprechend großen Rührstab.

Bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern einer Lösung, die 4 % Ethanol und 0,1 % Peressigsäure pro Gramm Gewebe enthält. Bei Raumtemperatur zwei Stunden lang umrühren. Kippen Sie den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Massieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette manuell und geben Sie den Inhalt zurück in das Becherglas. Waschen Sie das Taschentuch, indem Sie es mit 60 Millilitern 1X PBS pro Gramm Taschentuch bedecken.

Bei Raumtemperatur 15 Minuten umrühren. Wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang noch einmal. Kippen Sie anschließend den Inhalt des Bechers in ein 0,7-Millimeter-Sieb. Massieren Sie das Taschentuch mit einer Pinzette manuell und geben Sie den Inhalt zurück in das Becherglas. Waschen Sie das Taschentuch, indem Sie es mit 60 Millilitern entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.

Bei Raumtemperatur 15 Minuten umrühren. Wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang noch einmal. Trocknen Sie das gewaschene Tuch kurz auf einem feinen Tuch und wiegen Sie es. Schütten Sie das Taschentuch und den Inhalt in ein Sieb und massieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette manuell. Geben Sie den Inhalt zurück in das Becherglas und bedecken Sie das Gewebe mit 60 Millilitern 100% n-Propanol pro Gramm Gewebe.

Eine Stunde lang bei Raumtemperatur rühren. Trocknen Sie dann das Taschentuch kurz auf einem feinen Tuch und wiegen Sie es. Schütten Sie das Taschentuch und den Inhalt in ein 0,7-Millimeter-Sieb und massieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette manuell. Geben Sie den Inhalt zurück in das Becherglas und waschen Sie das Taschentuch, indem Sie es mit 60 Millilitern entionisiertem Wasser pro Gramm Gewebe bedecken.

Bei Raumtemperatur 15 Minuten umrühren. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang dreimal. Trocknen Sie danach das Tuch kurz auf einem feinen Arbeitstuch und wiegen Sie es. Übertragen Sie das Tuch in ein beschriftetes 15-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie es über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein.