Agarose-Inflation der ganzen Lunge: Eine Methode zur Vorbereitung der Lunge für die ex vivo Live-Bildgebung

- Lege zuerst eine euthanasierte Maus auf ein Sezierbrett. Schneiden Sie direkt über dem Bauch durch die Haut und das Bauchfell. Durchstechen Sie das Zwerchfell und schneiden Sie entlang der Rippen und des Brustkorbs bis zur Luftröhre. Mache einen kleinen Schnitt in der Luftröhre. Führen Sie vorsichtig eine Nadel in die Luftröhre ein, ohne die Carina zu verletzen, und befestigen Sie sie mit einer Pinzette. Injizieren Sie Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt bei normaler Körpertemperatur in die Lunge. Entfernen Sie langsam die Spritze und halten Sie die Nadel im Inneren, um den Rückfluss von Agarose zu verhindern.

Gießen Sie kaltes PBS auf die Lunge, um die Agarose-Gelierung zu fördern. Entfernen Sie die Nadel und befestigen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette, um einen Rückfluss von nicht verfestigter Agarose zu vermeiden. Schneiden Sie das Brustbein auf, halten Sie die Luftröhre mit einer Zange fest und schneiden Sie sie mit einer Schere auf. Ziehe die Lunge aus der Brusthöhle heraus. Trennen Sie die Lappen im Medium. In Bildgebungsvertiefungen unter physiologischen Bedingungen für die Mikroskopie platzieren. Agarose bewahrt die Lungenmorphologie bei physiologischen Temperaturen, die helfen, lebende zelluläre Wechselwirkungen zu beobachten. Im folgenden Protokoll werden wir ex vivo Live-Bildgebung von Lungen demonstrieren, um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen zu untersuchen.

- Um die Lunge für die Ex-vivo-Live-Bildgebung vorzubereiten, beginnen Sie damit, die Maus auf einem Styroporschaumdeckel zu immobilisieren, der mit einem Stück Quellstück bedeckt ist, und sterilisieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol. Führen Sie anschließend mit einer chirurgischen Schere einen transversalen epigastrischen Schnitt durch die Haut durch, gefolgt von einem ähnlichen Schnitt durch das Bauchfell. Bewegen Sie dann das Präparierbrett in eine vertikale Position und schneiden Sie die absteigende Aorta so, dass sich das Blut im Bauch und nicht in der Brusthöhle sammelt.

Schneiden Sie eine kleine Öffnung in das Zwerchfell, um das Vakuum abzulassen, und schneiden Sie dann entlang des Brustkorbs, um das Zwerchfell herauszuschneiden und die Lunge sichtbar zu machen. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere die Haut bis zur Luftröhre über dem Brustkorb auf, wobei die Rippen intakt bleiben. Trennen Sie dann die Haut vom Brustkorb und entfernen Sie das umgebende Bindegewebe, um die Luftröhre freizulegen, wobei Sie darauf achten müssen, die Luftröhre selbst nicht zu beschädigen. Schneiden Sie eine kleine Öffnung von etwa 1 Millimeter Durchmesser in die freiliegende Luftröhre parallel zu den Knorpelringen so nah wie möglich am Kehlkopf, ohne die Luftröhre vollständig zu durchtrennen.

Führen Sie dann vorsichtig eine 20-Gauge-Nadel 4 bis 5 Millimeter in die Luftröhre ein, ohne jegliche Gegenkraft. Das Ende der Nadel sollte durch die Luftröhre sichtbar sein. Füllen Sie eine Spritze mit 400 Mikrolitern Agarose mit einer niedrigen Schmelztemperatur von 37 Grad Celsius und 2 % und stabilisieren Sie die Nadel dann mit einer Pinzette. Halten Sie das Präparierbrett senkrecht und träufeln Sie langsam die gesamte Menge an warmer Agarose durch die Nadel in die Lunge. Sobald die Lunge aufgeblasen ist, lösen Sie die Spritze, während Sie die Nadel in der Luftröhre halten, und gießen Sie etwa 50 Milliliter 20 Grad Celsius PBS über die Lunge, um die Agarose zu fixieren.

Wenn sich die Agarose verfestigt hat, entfernen Sie die Nadel und verwenden Sie eine Pinzette, um die Luftröhre zu verschließen, um das Austreten von nicht verfestigter Agarose zu verhindern. Öffnen Sie nun den Brustkorb weiter durch Sternotomie und fassen Sie die Luftröhre mit einer Pinzette. Schneiden Sie dann mit einer chirurgischen Schere die Luftröhre vollständig durch. Um die Lunge zu entfernen, ziehen Sie die Luftröhre vorsichtig nach oben, schneiden Sie das Bindegewebe und die Speiseröhre ab und ziehen Sie die Lunge vollständig aus der Brusthöhle heraus.

Tauchen Sie das Gewebe in 37 Grad Celsius RPMI 1640, um das überschüssige Blut abzuwaschen. Schneiden Sie mit Schere und Pinzette die Hauptstielbronchus der Lappen am Hilum ab und trennen Sie die Lungenlappen vorsichtig. Übertragen Sie die Lappen mit der flachen Oberfläche nach unten in eine Vertiefung einer 24-Well-Speicherfolie und bedecken Sie das Gewebe mit 100 Mikrolitern 37 Grad Celsius RPMI 1640. Legen Sie mehrere 15-Milliliter-Objektträger mit kreisförmigen Mikroskopabdeckungen auf die Keulen, um ein Aufschwimmen zu verhindern, und gießen Sie warmes PBS in die umgebenden Vertiefungen, um zu verhindern, dass das Medium verdunstet. Setzen Sie dann die 24-Well-Platte in die Klimakammer ein und übertragen Sie die Kammer auf den konfokalen Mikroskoptisch.