3D-Co-Kultur von Lungenkrebszellen mit CAFs: Ein In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der Tumorprogression

- In 3D-Co-Kulturen werden mehrere Zelltypen in Matrizen wie einer Basalmembranmatrix zusammengezüchtet, die die natürliche Mikroumgebung der extrazellulären Matrix nachahmt und so Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen erleichtert. Um eine eingebettete 3D-Co-Kultur zu etablieren, bereiten Sie eine einheitliche Suspension von krebsassoziierten Fibroblasten oder CAFs und Lungenkrebszellen her, die in zwei zu zwei Verhältnissen in der Basalmembranmatrix entnommen werden. Halten Sie die Suspension auf Eis, um eine Verfestigung der Matrix bei Umgebungstemperaturen zu verhindern.

Übertragen Sie ein geeignetes Volumen der Suspension in eine Zellkulturplatte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für die erforderliche Dauer, um die Zellen gemeinsam in die Matrix einzubetten. Um eine überlagerte 3D-Co-Kultur zu etablieren, bereiten Sie eine Suspension von Lungenkrebszellen in einer Basalmembranmatrix in der gewünschten Zelldichte vor. Halten Sie die Aufhängung auf Eis. Pipettieren Sie ein geeignetes Volumen dieser Zellmatrix-Suspension in eine Zellkulturplatte. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, um die eingebettete Krebszell-Monokultur einzurichten.

Anschließend wird das gewünschte Volumen an CAFs, die in bevorzugten Kulturmedien suspendiert sind, über die eingebetteten Krebszellen übertragen. In 3D-Co-Kulturen fördern CAFs die Sphäroidbildung von Krebszellen und ziehen Krebszellen an, was zu tropfenartigen Strukturen führt. In diesem Protokoll werden wir TUM622-Lungenkrebszellen und CAFs co-kultivieren, um ihre Interaktion zu untersuchen.

- Nach der Herstellung von Zellsuspensionen von TUM622 und CAFs, wie zuvor beschrieben, zählen Sie die CAF-Zelldichte, indem Sie 10 Mikroliter Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau mischen. Geben Sie 10 Mikroliter der Mischung in jede der beiden Kammern eines Hämozytometers, um die Zelldichte zu zählen und zu berechnen. Um TUM622-Zellen und CAFs gemeinsam in die Basalmembranmatrix einzubetten, berechnen Sie zunächst die gewünschte Anzahl von Zellen, die für die Beschichtung verwendet werden, basierend auf den Zelldichteinformationen. CAFs werden im Verhältnis 2 zu 1 von TUM622-Zellen ausgesät. Übertragen Sie das berechnete Volumen von TUM622 sowie die CAF-Zellsuspension in dasselbe Zentrifugenröhrchen. Schleudern Sie nach unten und saugen Sie alles Medium an. Resuspendieren Sie es in einer Basalmembranmatrix und geben Sie 310 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Für die Immunfluoreszenz werden 60 Mikroliter TUM622- und CAF-Gemische wie zuvor beschrieben auf Kammerobjektträger übertragen.

Um TUM622 mit überlagerten CAFs in der Basalmembranmatrix zu co-kultivieren, wird zunächst die TUM622-Monokultur wie zuvor beschrieben aufgebaut. Die doppelte Anzahl der CAF-Suspension wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem 300-fachen "g" abgesenkt. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die CAFs in einem Milliliter 3D-Kulturmedium. Übertragen Sie die ein Milliliter CAF-Suspension in die Vertiefung mit den eingebetteten TUM622-Zellen.