Warum ist die Bestimmung der IC50 vor der Dosiserhöhung entscheidend?

Die Ermittlung der Baseline-IC50 mittels MTT-Assay liefert die Referenzkonzentration, um die Dosissteigerung bei 1/10 IC50 zu beginnen, wodurch ein selektiver Druck ausgeübt wird, ohne dass unmittelbare Zytotoxizität auftritt. Dies ermöglicht eine schrittweise Entwicklung von Resistenz über die Zeit hinweg anstelle eines akuten Zelltods.

Wie liefert die MTT-Assay-Auswertung Hinweise auf die Entwicklung von Resistenz?

Der MTT-Test misst die Formazan-Produktion aus der Aktivität der mitochondrialen Reduktase in lebensfähigen Zellen, wobei die optische Dichte bei 570 nm mit der Zellanzahl korreliert; die Resistenz wird bestätigt, wenn die Zellen bei ansteigenden Afatinib-Konzentrationen, die anfangs das Wachstum hemmten, weiterhin lebensfähig bleiben.

Was ermöglicht die zuverlässige Reproduktion der Entwicklung resistenter Zelllinien?

Eine schrittweise Dosiserhöhung bei Subkonfluenz, mit Konzentrationssteigerungen von 10–20 % bei jedem Passagieren, bietet ein standardisiertes Protokoll zum Aufbau eines selektiven Drucks, das in verschiedenen Laboren reproduziert werden kann, um isogene resistente Modelle zu erzeugen.

Warum sind Replikationsanforderungen für die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg unerlässlich?

Eine konsistente Resistenzentwicklung über die Wiederholungen hinweg stellt sicher, dass die beobachteten Phänotypen genetisch und nicht stochastisch bedingt sind, und ermöglicht eine zuverlässige Übertragung zwischen Entdeckungs-, Assay-Entwicklungs- und präklinischen Teams für Zielvalidierungsstudien.

Welche statistische Analyse ist erforderlich, um die Entwicklung von Resistenz zu bestätigen?

Der Widerstand wird durch den Vergleich der aus dem MTT-Assay abgeleiteten Vitalitätskurven zwischen parenteralen und züchtungsadaptierten Zellen bestätigt, wozu eine statistische Signifikanzprüfung (z. B. Analyse der IC50-Verschiebung) erforderlich ist, um die verminderte Empfindlichkeit gegenüber dem Wirkstoff im Zeitverlauf nachzuweisen.

Dosis-Eskalation: Eine Methode zur Entwicklung von Arzneimittelresistenzen in Krebszellen

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

0 Ansichten • 4:17 Min. • April 30th, 2023

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- Tyrosinkinase-Inhibitoren, TKI, blockieren die Bindung des Kinaserezeptors an ATP und verhindern so die Phosphorylierung. Beginnen Sie mit dem Plattieren von Krebszellen in Wachstumsmedien. Lassen Sie sie eine günstige Dichte erreichen und übertragen Sie die Zellen in mehrere Vertiefungen. Geben Sie nach dem Wachstum über Nacht unterschiedliche Wirkstoffkonzentrationen in mehreren Vertiefungen ab und lassen Sie die Zellen für die gewünschte Dauer wachsen. Fügen Sie MTT, einen wasserlöslichen Farbstoff, hinzu, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu messen. Mitochondriale Enzyme wandeln MTT in lebenden Zellen in unlösliches violettes Formazan um.

Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels und messen Sie Formazan spektrophotometrisch. Diese Methode wird als MTT-Assay bezeichnet. Zeichnen Sie ein Diagramm der lebenden Zellen, angezeigt durch Formazan, im Vergleich zu den Arzneimittelkonzentrationen. Berechnen Sie die Hemmkonzentration, IC₅₀, indem Sie mit der Software die Wirkstoffkonzentration ermitteln, die 50 % der Zellen abtötet.

Als nächstes züchten Sie Krebszellen im Wachstumsmedium und verteilen sie auf drei verschiedene Platten. Nachdem die Zellen die Subkonfluenz erreicht haben, fügen Sie eine Verdünnung von 1/10 der IC_{50-Konzentration} hinzu. Lassen Sie die Zellen wachsen und führen Sie den MTT-Assay durch. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit zunehmender Arzneimitteldosierung. Krebszellen entwickeln aufgrund von Mutationen in der Proteinsequenz langsam eine Resistenz gegen TKIs.

Das folgende Protokoll zeigt die Entwicklung einer Afatinib-Resistenz in PC9-Zellen durch Dosiseskalation.

- Um die geeignete Afatinib-Resistenzkonzentration zu bestimmen, kultivieren Sie PC9-Zellen in Wachstumsmedium in einer 10 Zentimeter großen Zellkulturschale bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Resuspendieren Sie die PC9-Zellen bei einer 4 mal 10 bis 4 Zellen pro Milliliter Wachstumsmediumkonzentration und säen Sie die Zellen bei 50 Mikrolitern Zellsuspension pro Well in einer 96-Well-Mikroplatte aus. Nach einer Inkubation über Nacht im Zellkultur-Inkubator werden die Zellen mit 50 Mikrolitern Afatinib-Lösung pro Vertiefung bei sechs Replikaten der angegebenen Konzentrationen behandelt. Und nach einer 96-stündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator geben Sie 15 Mikroliter MTT-Farbstoff in jede Vertiefung

Geben Sie nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator 100 Mikroliter Solubilisierungsstopplösung in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte über Nacht wieder in den Inkubator. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte bei 570 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader. Für eine kontinuierliche Afatinib-Exposition kultivieren Sie PC9-Zellen in P100-Schalen mit 10 Millilitern Wachstumsmedium, bis die Zellen die Subkonfluenz erreichen.

Übertragen Sie die subkonfluenten Kulturen in drei neue P100-Schalen mit 9 Millilitern Wachstumsmedium pro anfänglicher Kulturschale und bringen Sie die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen geben Sie 0,1 Nanomolar oder 1/10 der halbmaximalen Hemmkonzentration von Afatinib in jeden Satz von drei Kulturschalen. Wenn die mit Afatinib behandelten Zellen subkonfluent werden, verwenden Sie eine 1-Milliliter-Pipette, um die Kulturen gründlich zu mischen, und übertragen Sie 1 Milliliter Zellen aus jeder Schale auf 9 Milliliter frisches Wachstumsmedium in neuen P100-Schalen.

Fügen Sie den neuen Kulturen 10 % bis 20 % höhere Konzentrationen von Afatinib hinzu und erhöhen Sie die Afatinib-Konzentration durch schrittweise Dosissteigerung jedes Mal, wenn die Kulturen über einen Zeitraum von 10 bis 12 Monaten Subkonfluenz erreichen. Wenn eine Afatinib-Konzentration von 1 Mikromolar erreicht ist, führen Sie den MTT-Assay wie gezeigt durch, um zu bestätigen, dass die Zellen eine Afatinib-Resistenz entwickelt haben.