RNA-Extraktions-Assay: Eine Methode zur Extraktion von RNA aus miRNA-transfizierten Lungenkrebszellen

- Säen Sie zunächst die Lungenkrebszellen in einen T-Kolben mit Gewebekulturmedium und lassen Sie ihn über Nacht wachsen. Als nächstes suspendieren Sie die miRNA mit einem Transfiktionsmittel in ein Transfiktionsmedium. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie ein Transfiktionsmedium hinzu, das miRNA in Krebszellen einführt. miRNA ist ein nicht-kodierendes RNA-Molekül, das an eine komplementäre mRNA-Sequenz bindet und die Genexpression blockiert. Inkubieren Sie den Kolben für die gewünschte Dauer.

Ersetzen Sie als Nächstes das Medium durch Gewebekulturmedien und züchten Sie es über Nacht. Fügen Sie Trypsin für die Zelldissoziation hinzu. Übertragen Sie die Mischung in ein Zentrifugenröhrchen, das PBS enthält, und zentrifugieren Sie es. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Lysepuffer hinzu, um die Zellen zu lysieren, und fügen Sie ultrareines Ethanol für die Fällung hinzu. Geben Sie das Gemisch in eine Trennsäule, um Nukleinsäure und Zentrifuge zu reinigen.

Entfernen Sie den Durchfluss und fügen Sie einen Waschpuffer hinzu, um die lysierte Zellmembran und die Zentrifuge zu entfernen. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie DNase mit DNase-Aufschlusspuffer hinzu, um DNA aus der Probe und der Zentrifuge zu entfernen. Fügen Sie RNA-Vorbereitungspuffer hinzu, um RNA zu isolieren und zu zentrifugieren. Sammeln Sie die im Überstand vorhandene RNA. Im folgenden Protokoll werden wir eine RNA-Extraktion aus miRNA-behandelten Lungenkrebszellen durchführen.

- Zuerst werden die Krebszellen in einen geeigneten Kolben gesät, der für die RNA- und Proteinextraktion ausreicht, um die Genexpression mittels qPCR- oder Microarray-Analyse durchzuführen. Dann über Nacht mit Medien inkubieren, die mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurden.

Am nächsten Tag bereiten Sie die microRNA-Probe für die Transfektion vor, indem Sie microRNA 143 und microRNA 506 in den Medien in einer Konzentration von jeweils 100 Nanomolar verdünnen. Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium. Mit 1 x PBS waschen.

Alle unbehandelten Kontrollen enthalten nur unvollständige Medien mit Zellen. Inkubieren Sie die Zellen sechs Stunden lang mit Transfektionsmedien in einem Inkubator. Entfernen Sie nach sechs Stunden das Medium und ersetzen Sie es durch 4 Milliliter frisches vollständiges Medium. Ernten Sie die Zellen nach 24 Stunden und 48 Stunden durch Trypsinisierung.

Anschließend zweimal mit 1x PBS in jeder Tube waschen und den Überstand entfernen. Um die RNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt durchführen zu können, frieren Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius ein.

- Die RNA-Extraktion wurde mit einem RNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zuerst die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius herausnehmen und auftauen lassen.

- Fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Zellmembran aufzubrechen. Fügen Sie das gleiche Volumen von 100% ultrareinem Ethanol hinzu. Dann gut mischen und in die Trennsäule geben. Zentrifugieren und den Durchfluss entfernen.

Fügen Sie 400 Mikroliter Waschpuffer hinzu und zentrifugieren Sie, um den Puffer zu entfernen. In jede Probe werden 5 Mikroliter DNAse I mit 75 Mikrolitern DNA-Aufschlusspuffer gegeben und 15 Minuten inkubiert. Waschen Sie dann die Probe mit 400 Mikrolitern RNA-Prep-Puffer

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Anschließend zweimal mit RNA-Waschpuffer waschen. Gib nun nukleasefreies Wasser in die Säule, zentrifugiere und sammle dann die RNA. Messen Sie die RNA-Konzentration, in diesem Schritt können 2 Mikrogramm RNA-Probe zur RNA-Sequenzierung geschickt werden.